用于治疗神经退行性疾病的伊格美新的制作方法

本申请要求2016年2月11日提交的美国临时专利申请序列号62/293,832的优先权，其内容通过引用全部并入本申请。

本发明涉及用包含伊格美新的组合物治疗神经退行性疾病和障碍的方法。

背景技术

σ受体是非阿片类、非苯环利定(pcp)结合位点，其调节细胞的存活和兴奋性。σ受体是广泛分布在哺乳动物脑、外周神经元和内脏器官中的膜相关蛋白。已经基于它们的药理学概况识别出两种亚型，σ-1和σ-2(sethpetal.(1998)jneurochem.70:922–931)。σ受体亚型两者均广泛分布于中枢神经系统(cns)中。σ-1受体(σ-1r)是位于内质网(er)和脑组织中er-线粒体界面的伴侣蛋白，其中它通过前列环素(ip)受体调节er-线粒体ca(2+)信号传导和er-细胞核串扰(hayashitetal.,2007cell131:596-610)。在人中，σ-1r由sigma1r基因编码。σ-2受体(σ-2r)发现于大脑的几个区域，包括小脑、运动皮层和黑质。它的位置尚未定位在人染色体上。

许多研究表明σ-1r具有神经保护活性。例如，体外研究已经显示出对多种细胞中的σ-1r激动剂的保护作用，所述细胞包括原代大脑神经元、视网膜神经节细胞和晶状体细胞。此外，σ-1r的击倒增加细胞对高毒性淀粉样蛋白aβ25–35肽、氧化应激、er应激和葡萄糖剥夺的易感性(hallaaetal.(2009)glia57(7):744-754；schrodermetal.(2005).mutationres.569(1-2):29-63)。σ-1r激动剂在动物模型中也显示出抗氧化应激和易受aβ25–35肽的疗效。强效σ-1配体4-苯基-1-(4-苯基丁基)哌啶(ppbp)减弱实验动物的大脑中动脉闭塞/再灌注引起的大脑皮质和纹状体的梗塞体积，并且显著减弱在缺血性和非缺血性层(stiratum)中的一氧化氮(no)产物(goyagietal.(2001)stroke32(7):1613-1620)。此外，选择性σ-1r激动剂、pre-084减弱鼠海马中的aβ25–35肽诱导的脂质过氧化(meunierjetal.(2006).brjpharmacol149(8):998-1012)。

越来越多的证据表明，σ-1r在神经精神疾病的病理生理学和一些治疗药物的机械作用中起作用(nitsutetal.(2012)currphardes.18:875-83)。基于其声称的神经保护和/或抗炎活性，已经在各种条件下提出了作为治疗干预目标的σ-1r。例如，已建议σ受体配体用于治疗由甲基苯丙胺引起的运动障碍(matsumotorretal.(2008)eur.neuropsychopharmacology18(12):871-881)。也已提出σ受体激动剂用于治疗或预防由如下病症引起的神经退行性疾病，所述σ受体激动剂包括氟伏沙明、n-(n-苄基哌啶-4-基)-4-碘苯甲酰胺(4-ibp)、pre-084、[n-(1,4-二苯基-1-乙基-3-丁烯-1-基)-n-甲基-环丙烷甲胺盐酸盐(伊格美新)、opc-14523、bd-737和n-苄基-n'-(2-羟基-3,4-二甲氧基苄基)-哌嗪(bhdp)，所述病症为缺血性中风、阿尔茨海默病、糖尿病性周围神经病变、癌症治疗诱导的神经病变、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化症、创伤性脑损伤、脊髓损伤、亨廷顿病或帕金森病(us2005/0020483)。us2005/0070524描述了用于治疗中枢神经系统疾病的环加氧酶-2选择性抑制剂和抗惊厥剂的组合物，伊格美新列为可能的抗惊厥剂。us5,665,725描述了某些哌啶衍生物，它们是σ受体配体，据说可用于治疗焦虑症、精神病、癫痫、抽搐、运动障碍(movementdisorders)、运动障碍(motordisturbances)、遗忘症、脑血管疾病、阿尔茨海默型老年性痴呆和帕金森病。us2007/0123556描述了在延迟时间点用σ受体激动剂进行的中风后治疗方法，所述σ受体激动剂包括1,3-二邻甲苯胍(dtg)、妥克拉司、(+)-喷他佐辛、pre-084、林卡唑、l-687,384、bd-737和伊格美新。最近一篇论文报道了σ-1受体激动剂pre-84和anavex2-73在β-淀粉样蛋白诱导的记忆障碍的小鼠模型中的记忆增强，以及当化合物以预防和对症方式给药时与多奈哌齐的协同活性(mauricet(2016)behaviouralbrainres.296:270-278)。然而，没有提供显示σ-1r激动剂对与记忆增强相关的神经保护作用的数据。

伊格美新(jo-1784)是有效且高选择性的σ-1r激动剂，其中ic50为39±8nm(romanfjetal.(1990)j.pharm.pharmacology42(6):439-440)。这种亲和力与氟哌啶醇的亲和力(24±6nm)相似，氟哌啶醇是该位点最具活性的化合物之一(largentbl,etal.(1986)j.pharmacologyexp.therap.238(2):739-748)。jo-1783是伊格美新(jo-1784)的非活性立体异构体，其效力比伊格美新低十倍，表明该化合物对结合位点具有一定程度的立体特异性。

伊格美新在全脑缺血沙土鼠模型中在50mg/kg、75mg/kg和100mg/kg有效剂量具有神经保护作用(o'neillmetal.(1995)eur.j.pharmacol.283(1-3):217-225)并且在衰老加速小鼠模型中在有效剂量为0.1mg/kg至3mg/kg在急性治疗范例中也显示出对年龄相关记忆障碍的有益作用。(mauricetetal.(1996)brainresearch733(2):219-230.us5,034,419)(l’oreal)描述了伊格美新及相关化合物，并且基于体外发现的σ受体亲和力，提出其通常用于神经和/或精神障碍的治疗，所述神经和/或精神障碍包括例如，抑郁状态、记忆和/或行为障碍、精神分裂症、阿尔茨海默病、帕金森病和老年痴呆症。然而，没有提供数据支持在任何这些条件下的治疗疗效。

提出了伊格美新在一些临床前动物模型中的抗抑郁疗效(kinsorajjjretal.(1998)neurosci.abstr.24,291.3；matsunoketal.(1996)eur.j.pharmacol.312(3):267-271；songcetal.(1997)。neuropsychobiology35(4):200-204；uraniaetal.(2001)j.pharmacol.exp.therap.298(3):1269-1279)和在临床试验中也观察到了抗抑郁活性(pandeacetal.(1998)。int.j.neuropsychopharmacol.1:s8–s9；pandeacetal.(1999)eur.neuropsychopharmacol.9:s138；leadbetterr,etal.(1999)biol.psychiatry,45(suppl)p.76s(abs.z44))。许多专利申请描述了使用伊格美新治疗抑郁症的方法。例如，wo2000/041684描述了通过给药σ-1r激动剂(例如伊格美新)和血清素再摄取抑制剂(例如氟西汀)的组合来治疗抑郁症的方法。wo2001/015685描述了当给药至类固醇缺失型动物时伊格美新的抗抑郁活性的有益效果。当与血清素再摄取抑制剂组合施用时，伊格美新也描述为可用于治疗抑郁症，例如在us6,436,938(pfizer)中。

us2003/0013699(scheringcorp.)描述了使用由它们的化学式定义的某些化合物治疗阿尔茨海默病的方法及其在组合治疗中的用途，在理论上可用于这种组合治疗的许多可能的药剂中描述了σ受体配体。

迄今为止，还没有公布数据以描述伊格美新在阿尔茨海默病(alzheimer’sdisease)、肌萎缩侧索硬化症(amyotrophiclateralsclerosis)、多发性硬化症(multiplesclerosis)、帕金森病(parkinson’sdisease)、亨廷顿病(huntington’sdisease)或额颞叶变性(frontotemporaldegeneration)中的疗效。

技术实现要素：

本发明部分基于如下令人惊奇的发现：伊格美新在aβ25-35阿尔茨海默病小鼠模型中具有强大的神经保护作用，如其预防或显著降低该模型系统中aβ25-35诱导的神经毒性的能力所证实的，例如，预防aβ25-35诱导的神经毒性特征的学习和记忆减退，以及细胞和生化指标，如减少神经元细胞凋亡(neuronalcellapoptosis)，减少内质网(er)应激，减轻神经炎症(neuroinflammation)，减少β-淀粉样蛋白负担，和抑制tau蛋白过度磷酸化。本发明也部分基于如下发现：伊格美新能够预防出现通过aβ25-35诱发的神经毒性引起并且与空间工作记忆和情景长期记忆有关的学习和记忆减退。伊格美新的有效剂量范围比先前在人中观察到的有效剂量范围低10至100倍，例如与其抗抑郁作用相关，在啮齿动物中，例如与其在全脑缺血模型中的神经保护作用相关。此外，本发明部分基于如下发现：伊格美新与其它治疗剂协同作用，以预防或显著降低aβ25-35诱导的神经毒性。本发明也部分基于伊格美新减少或预防神经细胞凋亡的能力。本发明也部分基于伊格美新促进σ-1受体伴侣活性以减弱错误折叠蛋白积累的能力，这些蛋白质引起神经退行性病变，如阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症(als)、亨廷顿氏症、多发性硬化症、帕金森病和额颞叶变性。

因此，本申请提供单独使用伊格美新或使用伊格美新与一种或多种另外的治疗剂的组合治疗神经退行性疾病或障碍的组合物和方法。在实施方式中，所述一种或多种另外的治疗剂选自胆碱酯酶抑制剂(cholinesteraseinhibitor)、aβ毒性降低剂(aβtoxicityloweringagent)、激素替代剂(hormonereplacementagent)、降脂剂(lipid-loweringagent)、分泌酶调节剂(secretasemodulatingagent)、aβ凝集抑制剂(aβaggregationinhibitor)、神经元纤维抑制剂(neurofibrillaryinhibitor)、单胺氧化酶(mao)抑制剂(monoamineoxidase(mao)inhibitor)和β-淀粉样分解代谢抑制剂(β-amyloidcatabolisminhibitor)。在实施方式中，一种或多种另外的治疗剂为胆碱酯酶抑制剂。在实施方式中，胆碱酯酶抑制剂为多奈哌齐(donepezil)。在实施方式中，一种或多种另外的治疗剂为抗炎剂。在实施方式中，抗炎剂为非甾体抗炎剂。在一种实施方式中，抗炎剂为布洛芬(ibuprofen)。在实施方式中，一种或多种另外的治疗剂为降脂剂。在实施方式中，降脂剂为他汀类(statin)。在实施方式中，他汀类为辛伐他汀(simvastatin)或阿托伐他汀(atorvastatin)。在实施方式中，一种或多种另外的治疗剂为mao抑制剂。在实施方式中，mao抑制剂选自雷沙吉兰(rasagiline)、司来吉兰(selegiline)和反苯环丙胺(tranylcypromine)。在实施方式中，mao抑制剂为mao-b抑制剂。在实施方式中，mao-b抑制剂为司来吉兰。

在一种实施方式中，本申请提供用于治疗有此需要的人受试者中的神经疾病或障碍的组合物，所述组合物适于每天一次或两次给药并且包含一定量的伊格美新或其药用盐，从而有效改善或延迟所述疾病或障碍的一种或多种病理生理学特征的发作，或改善或延迟所述疾病或障碍的至少一种临床症状的发作，其中伊格美新在所述组合物中的量为1mg至20mg或1mg至15mg，优选1mg至10mg或1mg至5mg。

在一种实施方式中，本申请提供治疗有此需要的人受试者中的神经疾病或障碍的方法，所述方法包括将包含治疗有效量的伊格美新或其药用盐的药物组合物给药至受试者，伊格美新的量有效改善或延迟疾病或障碍的一种或多种病理生理特征的发作，或改善或延迟疾病或障碍的至少一种临床症状的发作，伊格美新的量的范围为1mg至20mg，优选1mg至10mg。

在实施方式中，神经疾病或障碍选自阿尔茨海默病、als、亨廷顿病、多发性硬化症、帕金森病和额颞叶变性。

在一种实施方式中，本申请提供用于治疗人受试者中的阿尔茨海默病的组合物，所述组合物包含伊格美新盐酸盐和一种或多种另外的治疗剂，伊格美新盐酸盐的量为1mg至100mg、1mg至20mg、1mg至10mg、1mg至5mg、或1mg至3mg。在实施方式中，一种或多种另外的治疗剂选自胆碱酯酶抑制剂、抗炎剂、降脂剂和mao抑制剂。在实施方式中，胆碱酯酶抑制剂为多奈哌齐。在实施方式中，多奈哌齐在组合物中的量为1mg至6mg。在实施方式中，抗炎剂为非甾体抗炎剂。在一种实施方式中，抗炎剂为布洛芬。在实施方式中，一种或多种另外的治疗剂为降脂剂。在实施方式中，降脂剂为抑制素。在实施方式中，抑制素为辛伐他汀或阿托伐他汀。在实施方式中，一种或多种另外的治疗剂为mao抑制剂。在实施方式中，mao抑制剂选自雷沙吉兰、司来吉兰和反苯环丙胺。在实施方式中，mao抑制剂为mao-b抑制剂。在实施方式中，mao-b抑制剂为司来吉兰。

在一种实施方式中，本申请提供治疗有此需要的人受试者中的阿尔茨海默病的方法，所述方法包括将包含治疗有效量的伊格美新或其药用盐的药物组合物给药至受试者，伊格美新的量有效改善或延迟阿尔茨海默病的一种或多种病理生理特征的发作，或改善或延迟阿尔茨海默病的至少一种临床症状的发作，伊格美新的量的范围为1mg至100mg、1mg至50mg、1mg至20mg、1mg至10mg、或1mg至5mg。在实施方式中，组合物除伊格美新之外还进一步包含一种或多种另外的治疗剂。在实施方式中，一种或多种另外的治疗剂选自胆碱酯酶抑制剂、抗炎剂、降脂剂和mao抑制剂。在实施方式中，胆碱酯酶抑制剂为多奈哌齐。在实施方式中，多奈哌齐在组合物中的量为1mg至6mg。在实施方式中，抗炎剂为非甾体抗炎剂。在一种实施方式中，抗炎剂为布洛芬。在实施方式中，一种或多种另外的治疗剂为降脂剂。在实施方式中，降脂剂为抑制素。在实施方式中，抑制素为辛伐他汀或阿托伐他汀。在实施方式中，一种或多种另外的治疗剂为mao抑制剂。在实施方式中，mao抑制剂选自雷沙吉兰、司来吉兰和反苯环丙胺。在实施方式中，mao抑制剂为mao-b抑制剂。在实施方式中，mao-b抑制剂为司来吉兰。

根据本申请描述的方法或组合物的实施方案中的任一种，伊格美新的药用盐可以为盐酸盐。

在实施方式中，有此需要的受试者为诊断患有神经疾病或障碍的人患者。

在实施方式中，神经疾病或障碍选自阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症(als)、多发性硬化症、帕金森病、亨廷顿病和额颞叶变性。

在一种实施方式中，神经疾病或障碍为阿尔茨海默病。在实施方式中，阿尔茨海默病的一种或多种病理生理特征选自神经炎症、细胞凋亡、er应激、β淀粉样蛋白斑块负荷(βamyloidplaqueburden)、tau蛋白过度磷酸化(tauproteinhyperphosphorylation)和脂质过氧化(lipidperoxidation)。在实施方式中，阿尔茨海默病的至少一种临床症状为与工作记忆、短期记忆和长期记忆中的一种或多种相关的学习或记忆减退。在实施方式中，阿尔茨海默病的至少一种临床症状为积极强化记忆或空间和情景记忆，或积极强化记忆以及空间和情景记忆。

在实施方式中，本申请描述的包含伊格美新的药物组合物进一步包含有效量的至少一种另外的活性药物成分(“api”)，本申请中也可以互换地称为“活性剂”或“治疗剂”。在实施方式中，至少一种另外的api选自胆碱酯酶抑制剂、aβ毒性降低剂、激素替代剂、降脂剂、分泌酶调节剂、aβ凝集抑制剂、神经元纤维抑制剂或β-淀粉样分解代谢抑制剂，及其组合。在实施方式中，至少一种另外的api选自胆碱酯酶抑制剂、抗炎剂、降脂剂和mao抑制剂。在实施方式中，胆碱酯酶抑制剂为多奈哌齐。在实施方式中，多奈哌齐在组合物中的量为1mg至6mg。在实施方式中，抗炎剂为甾体或非甾体抗炎剂。在一种实施方式中，抗炎剂为布洛芬。在实施方式中，所述至少一种另外的api是降脂剂。在实施方式中，降脂剂为抑制素。在实施方式中，抑制素为辛伐他汀或阿托伐他汀。在实施方式中，所述至少一种另外的api是mao抑制剂。在实施方式中，mao抑制剂选自雷沙吉兰、司来吉兰和反苯环丙胺。在实施方式中，mao抑制剂为mao-b抑制剂。在实施方式中，mao-b抑制剂为司来吉兰。

在实施方式中，所述至少一种另外的api是胆碱酯酶抑制剂。在实施方式中，胆碱酯酶抑制剂的存在量为不存在伊格美新盐酸盐时小于治疗有效量的胆碱酯酶抑制剂的至少2倍，优选至少4倍。在实施方式中，胆碱酯酶抑制剂为多奈哌齐。在实施方式中，有效量的多奈哌齐为1mg至6mg。

在实施方式中，组合物为口服剂型或适于静脉内给药的剂型。

在实施方式中，本申请提供适于口服给药的包含伊格美新盐酸盐和多奈哌齐的单位剂型。在实施方式中，单位剂型中的伊格美新盐酸盐的量为1mg至100mg，1mg至20mg，或1mg至10mg，多奈哌齐的量为1mg至6mg。

在实施方式中，本申请提供适于口服给药的包含伊格美新盐酸盐和布洛芬的单位剂型。在实施方式中，单位剂型中的伊格美新盐酸盐的量为1mg至100mg，1mg至20mg，或1mg至10mg，布洛芬的量为100至400mg。

在实施方式中，本申请提供适于口服给药的包含伊格美新盐酸盐和辛伐他汀的单位剂型。在实施方式中，单位剂型中的伊格美新盐酸盐的量为1mg至100mg，1mg至20mg，或1mg至10mg，辛伐他汀的量为20mg至80mg。

在实施方式中，本申请提供适于口服给药的包含伊格美新盐酸盐和阿托伐他汀的单位剂型。在实施方式中，单位剂型中的伊格美新盐酸盐的量为1mg至100mg，1mg至20mg，或1mg至10mg，阿托伐他汀的量为10至80mg。

在实施方式中，本申请提供适于口服给药的包含伊格美新盐酸盐和司来吉兰的单位剂型。在实施方式中，单位剂型中的伊格美新盐酸盐的量为1mg至100mg，1mg至20mg，或1mg至10mg，司来吉兰的量为1mg至10mg。

在实施方式中，本申请提供用于治疗人受试者的阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症或亨廷顿病的组合物，所述组合物包含伊格美新盐酸盐的量为2.5至10mg每剂量，其中组合物用于每天给药一次、两次或三次。在实施方式中，组合物进一步包含：量为1mg至15mg的多奈哌齐；或量为50mg至150mg的布洛芬；或量为5mg至15mg的司来吉兰；或量为1mg至5mg的阿托伐他汀。

附图说明

图1.σ-1r激动剂伊格美新(amy002，0.1、0.3、1mg/kg)对aβ25-35诱导的小鼠自发交替的作用。将给药伊格美新的小鼠在侧脑室(i.c.v.)注射乱序重排的aβ肽(sc.aβ)或aβ25-35(9nmol)前的20min进行腹腔注射(i.p.)，在注射伊格美新后7天使用y型迷宫(y-maze)测试小鼠的自发交替行为。veh，媒介物溶液；dpz，多奈哌齐(1mg/kg)。***p<0.001，相对于veh-+sc.aβ组；###p<0.001，相对于veh+aβ25-35组；n＝12)。通过dunnett方差齐性检验(posthoctest)分析数据。该实验中的所有治疗剂量均以mg/kg表示。

图2.伊格美新(amy002)对aβ25-35诱导的小鼠被动回避的作用：在停留期间确定(a)步入潜伏期和(b)逃避潜伏期。将小鼠在侧脑室注射aβ25-35前的20min通过腹腔注射给药伊格美新，在注射伊格美新或/dpz后对小鼠进行了测试以评估认知缺陷。veh，媒介物溶液。***p<0.001，相对于veh治疗的sc.aβ组；###p<0.001，相对于aβ25-35治疗的组；dunnett检验。所有剂量均以mg/kg表示。

图3.与多奈哌齐(dpz)相比，伊格美新(amy002)对aβ25-35诱导的海马脂质过氧化(lpo)水平升高的保护作用。将伊格美新在aβ25-35注射前的20min进行ip注射。veh，媒介物溶液。***p<0.001，相对于veh治疗的sc.aβ组；###p<0.001，相对于veh治疗的aβ25-35组；dunnett检验。所有剂量均以mg/kg表示。

图4.在伊格美新注射后的7天，伊格美新(amy002)对aβ25-35诱导的小鼠自发交替缺陷的神经保护作用。多奈哌齐(dpz)的比较作用。将化合物从aβ25-35注射后的第1天进行注射直到第6天。veh，媒介物溶液。***p<0.001，相对于v治疗的sc.aβ组；###p<0.001，相对于媒介物治疗的aβ25-35组；dunnett检验。所有剂量均以mg/kg表示。

图5.伊格美新(amy002)或多奈哌齐(dpz)对aβ25-35诱导的小鼠被动回避缺陷的保护作用：(a)在注射aβ25-35肽后的8天确定步入潜伏期和(b)在24小时的停留期间在第9天测定逃避潜伏期。将伊格美新从aβ25-35注射后的第1天进行注射直到第6天。veh，媒介物溶液。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，相对于v治疗的sc.aβ组；##p<0.01，###p<0.001，相对于aβ25-35治疗的组；dunnett检验。所有剂量均以mg/kg表示。

图6.伊格美新(amy002)或多奈哌齐(dpz)对aβ25-35诱导的小鼠海马lpo水平升高的作用。lpo水平用作氧化应激的标志。将伊格美新在aβ25-35注射后的24小时进行注射，每天一次直至第6天，在被动回避测试后在第9天收集小鼠脑。所有结果以sc.aβ组的百分比(％sc.aβ)表示。veh，媒介物溶液。***p<0.001，相对于媒介物治疗的sc.aβ组；###p<0.001，相对于媒介物治疗的aβ25-35组；dunnett检验。所有剂量均以mg/kg表示。

图7.伊格美新(amy002)对aβ25-35诱导的小鼠皮质胶质细胞原纤维酸性蛋白(gfap)水平升高的作用。gfap水平用作神经损伤的标志。将伊格美新在aβ25-35注射后的24小时进行注射直到第6天，在被动回避测试后在第9天收集脑。所有结果以sc.aβ组的百分比(％sc.aβ)表示。veh，媒介物溶液。***p<0.001，相对于媒介物治疗的sc.aβ组；###p<0.001，相对于媒介物治疗的aβ25-35组；dunnett检验。

图8.伊格美新(amy002)对aβ25-35诱导的小鼠皮质caspase12水平升高的保护作用。caspase水平用作er应激的标志。将伊格美新在aβ25-35注射后的24小时进行注射直到第6天，在被动回避测试后在第9天收集脑。所有结果以sc.aβ组的百分比(％sc.aβ)表示。veh，媒介物溶液。***p<0.001，相对于媒介物治疗的sc.aβ组；###p<0.001，相对于媒介物治疗的aβ25-35组；dunnett检验。

图9.伊格美新(amy002)对aβ25-35诱导的小鼠皮质aβ1-40和aβ1-42水平升高的作用。将伊格美新在aβ25-35注射后的24小时进行注射直到第6天，在被动回避测试后在第9天收集脑。所有结果以sc.aβ组的百分比(％sc.ab)表示。veh，媒介物溶液。***p<0.001，相对于媒介物治疗的sc.aβ组；###p<0.001，相对于媒介物治疗的aβ25-35组；dunnett检验。

图10.伊格美新(amy002)对aβ25-35诱导的皮质tau蛋白在丝氨酸199处磷酸化(ptaus199)升高的保护作用。p-tau水平用作阿尔茨海默病的生物标志。将伊格美新在aβ25-35注射后的24小时进行注射直到第6天，在被动回避测试后在第9天收集脑。所有结果以sc.aβ组的百分比(％sc.aβ)表示。veh，媒介物溶液。***p<0.001，相对于媒介物治疗的sc.aβ组；###p<0.001，相对于媒介物治疗的aβ25-35组；dunnett检验。

图11.伊格美新(amy002，1mg/kg)对aβ25-35诱导的皮质bax/bcl2比率升高的作用。bax/bcl2比率用作与疾病进展有关的凋亡的标志。将伊格美新在aβ25-35注射后的24小时进行注射直到第6天，在被动回避测试后在第9天收集脑。所有结果以sc.aβ组的百分比(％sc.aβ)表示。veh，媒介物溶液。***p<0.001，相对于媒介物治疗的sc.aβ组；###p<0.001，相对于媒介物治疗的aβ25-35组；dunnett检验。

图12.伊格美新(amy002)与σ-1r激动剂多奈哌齐(dpz)(a)的组合或与美金刚胺(mem)(b)的组合对aβ25-35诱导的小鼠自发交替缺陷的作用。veh，媒介物溶液。***p<0.001，相对于媒介物治疗的sc.aβ组；#p<0.05,###p<0.001，相对于媒介物治疗的aβ25-35组；dunnett检验。所有剂量均以mg/kg表示。

图13.伊格美新(amy002)与σ-1r激动剂多奈哌齐(dpz)(a)的组合或与美金刚胺(mem)(b)的组合对aβ25-35诱导的小鼠被动回避缺陷的作用。被动回避测试是评估小鼠的短期或长期记忆。veh，媒介物溶液。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，相对于媒介物治疗的sc.aβ组；###p<0.001，相对于aβ25-35治疗的组；dunnett检验。所有剂量均以mg/kg表示。

图14.伊格美新(amy002)与σ-1r激动剂多奈哌齐(a)或美金刚胺(b)的组合对aβ25-35诱导的海马lpo水平升高的作用。将伊格美新和多奈哌齐在aβ25-35注射前20min进行腹腔注射。veh，媒介物溶液。***p<0.001，相对于媒介物治疗的sc.aβ组；##p<0.01,###p<0.001，相对于媒介物治疗的aβ25-35组；dunnett检验。所有剂量均以mg/kg表示。

图15.伊格美新(amy002)与布洛芬(ibu)的组合对aβ25-35诱导的小鼠自发交替缺陷的保护作用。将伊格美新和布洛芬在aβ25-35注射后24小时进行ip注射直到第6天，在被动回避测试后在第9天收集脑。veh，媒介物溶液。***p<0.001，相对于媒介物治疗的sc.aβ组；#p<0.05，###p<0.001，相对于媒介物治疗的aβ25-35组；+p<0.05，相对于ibu50治疗的aβ25-35组；°°°p<0.001，相对于ibu25治疗的aβ25-35组；dunnett检验。所有剂量均以mg/kg表示。

图16.伊格美新(amy002)与司来吉兰(sgl)的组合对aβ25-35诱导的小鼠自发交替缺陷的保护作用。将伊格美新和布洛芬在aβ25-35注射后的24小时进行ip注射直到第6天，在被动回避测试后在第9天收集脑。v，媒介物溶液。**p<0.01，***p<0.001，相对于媒介物治疗的sc.aβ组；##p<0.01###p<0.001，相对于媒介物治疗的aβ25-35组；dunnett检验。所有剂量均以mg/kg表示。

图17.伊格美新(amy002)与降胆固醇药物阿托伐他汀(ator)的组合对aβ25-35(ab)诱导的小鼠自发交替缺陷的保护作用。将伊格美新和阿托伐他汀在aβ25-35注射后的24小时进行ip注射直到第6天，在被动回避测试后在第9天收集脑。v，媒介物溶液。***p<0.001，相对于v治疗的sc.aβ组；###p<0.001，相对于v治疗的aβ25-35组；dunnett检验。

图18.伊格美新(amy002)对由神经毒性合成化合物6-羟基多巴胺或2,4,5-三羟基苯乙胺(6-ohda，20μm，48h)损伤的鼠原代多巴胺能神经元培养物的存活的作用。活神经元数目以未治疗的对照的百分数(％ctrl)表示。(均值±均值标准误差(s.e.m)；**p<0.016ohda，相对于对照；#p<0.05；##p<0.01，伊格美新或bdnf相对于6ohda组；单因素方差分析，然后dunnett检验。th阳性神经元数目(用与alexa488偶联的第二抗体标记)通过施用6ohda得到显著降低。

图19.伊格美新(amy002)对由高浓度的谷氨酸损伤(40μm，20min)的原发性中型多棘神经元(msn)以对照的百分数(％ctrl)表示的存活率的影响。活神经元的数量以未治疗的对照的百分数(％ctrl)表示。使用单因素方差分析，然后dunnett检验，将数据计算为均值±均值标准误差。***p<0.001，谷氨酸相对于对照组。#p<0.05；##p<0.01，伊格美新或bdnf相对于谷氨酸组。谷氨酸诱导darpp32阳性神经元数目大幅和显著减少。

图20.伊格美新(amy002)对由谷氨酸损伤(40μm，20min)的原发性运动神经元以对照的百分数(％ctrl)表示的存活率的影响。(均值±均值标准误差；***p<0.001谷氨酸相对于对照组；#p<0.05；##p<0.01；###p<0.001，伊格美新或bdnf相对于谷氨酸组；单因素方差分析，然后dunnett检验)。谷氨酸(40μm，20min)诱导islet1/2运动神经元数目大幅和显著减少。

图21.伊格美新(amy002，1μm和10μμ)对结合免疫球蛋白(bip)从σ-1受体的解离和通过10μmne100对解离作用的拮抗作用的影响。*p<0.05，***p<0.001，相对于对照组(veh)；###p<0.001，相对于10μm伊格美新组；dunnett检验。

具体实施方式

本申请部分基于如下发现：伊格美新以低剂量(1mg/kg)在阿尔茨海默病毒性急性啮齿动物模型、aβ25-35肽小鼠模型中具有显著的治疗效果。令人惊奇地，伊格美新防止了各种阿尔茨海默病相关病理的发展，即使在aβ25-35肽攻击后的24小时开始治疗的情况下也是如此。当在攻击后给药伊格美新时，其作用显然是神经保护性的而非预防性的。该结果不同于在相同模型中评估但使用预防性和对症治疗的其它σ配体如pre-084和anavex2-73所描述的结果。在考虑到实验模型的平移值时，这种特殊性非常重要。考虑到患者在诊断患有阿尔茨海默病时需要药物，治疗性治疗对于预防性治疗的疗效限制的价值非常有限。此外，目前唯一可用的治疗方法是对症治疗，如aricept^tm或ebixa^tm，这种治疗的局限性在很大程度上认为是它们的益处不能长期得以维持。所有阿尔茨海默病患者最终都会因药物治疗的影响而使病情恶化。

实施例1中使用的实验模型再现了阿尔茨海默病的可能原因，其为在脑中过量产生aβ寡聚体。事实上，aβ25-35肽是尸检后的痴呆患者脑中已发现毒性最大的肽之一。这些结果表明即使当这些毒性肽已经大量注射到脑中时，伊格美新也能显示出疗效。因此，该实验在急性方案中模拟了在痴呆症迹象出现前的15或20年内这种毒性肽在人体中的长期暴露。在这些特性的情况下，伊格美新完全适应于用作疾病调节剂，例如在已诊断为阿尔茨海默病早期的患者、或处于发展为阿尔茨海默病的高风险下的那些患者中，以减少或甚至停止病理的进展。此外，我们在此显示伊格美新协同增强胆碱酯酶抑制剂多奈哌齐的治疗活性。使用非常低剂量的伊格美新(0.1mg/kg)和低剂量的多奈哌齐的组合，观察到这种协同活性，其剂量范围比治疗阿尔茨海默病的典型治疗有效剂量低约4倍。基于伊格美新在动物模型和人中的先前工作，单独的伊格美新和伊格美新与胆碱酯酶抑制剂的组合的低剂量疗效都是预料不到的。尽可能地限制暴露于这两种药物从而可能得到充分的疗效是非常有价值的发现。协同剂量远低于已知的人体可接受的安全剂量。由于该组合意在用于需要从早期诊断和其余生命中进行长期治疗的治疗个体，因此认为药物的安全性要优先于任何其它适应症考虑。

本申请提供伊格美新在阿尔茨海默病的aβ25-35小鼠模型中具有强效的神经保护作用，这通过其可以防止或显著降低aβ25-35诱导的神经毒性的能力来证明。因此，如下文较详细讨论的，伊格美新有效地防止aβ25-35诱导的神经毒性的学习和记忆减退的特征。伊格美新也能够减少或改善该模型系统中的神经毒性的几个关键细胞和生化指标。因此，本申请提供减少、延迟阿尔茨海默病的一种或多种病理生理学特征例如神经细胞凋亡、神经炎症、β-淀粉样蛋白负荷和tau蛋白过度磷酸化的发作，或改善阿尔茨海默病的一种或多种病理生理学特征例如神经细胞凋亡、神经炎症、β-淀粉样蛋白负荷和tau蛋白过度磷酸化的方法。

本发明也部分基于如下发现：伊格美新能够防止出现通过aβ25-35诱导的神经毒性引发并且与空间工作记忆和情景长期记忆有关的学习和记忆减退。因此，本申请提供减少、延迟阿尔茨海默病的至少一种临床症状的发作，或改善阿尔茨海默病的至少一种临床症状的方法，所述至少一种临床症状如与以下中的一种或多种相关的学习或记忆减退：工作记忆、短期记忆、长期记忆、正强化记忆、空间和情景记忆或前述的任何组合。

本发明也部分基于如下发现：伊格美新的神经保护作用表现在剂量范围方面，该剂量范围比先前在人(例如，与其抗抑郁作用有关)和啮齿动物(例如，与其在全脑缺血模型中的神经保护作用有关)中观察到的有效剂量范围低约10至100倍。因此，本申请提供使用有效剂量的伊格美新治疗神经疾病或障碍的方法和相关组合物，其剂量比先前在例如伊格美新的i期临床研究中使用的剂量低10至100倍。

另外，本发明部分基于如下发现：伊格美新与其它治疗剂协同作用以防止或显著降低aβ25-35诱导的神经毒性。因此，本申请提供使用伊格美新与一种或多种另外的治疗剂的组合治疗阿尔茨海默病的方法和相关组合物。在实施方式中，阿尔茨海默病为早发性疾病。在实施方式中，一种或多种另外的治疗剂选自：胆碱酯酶抑制剂、mao抑制剂、抗炎剂、aβ毒性降低剂、激素替代剂、降脂剂、分泌酶调节剂、aβ凝集抑制剂、神经元纤维抑制剂、β-淀粉样分解代谢抑制剂，及其组合。

在治疗阿尔茨海默病的进一步实施方式中，一种或多种另外的治疗剂选自胆碱酯酶抑制剂、抗炎剂、降脂剂和mao抑制剂。在实施方式中，胆碱酯酶抑制剂为多奈哌齐。在实施方式中，多奈哌齐在组合物中的量为1mg至6mg。在实施方式中，抗炎剂为甾体或非甾体抗炎剂。在一种实施方式中，抗炎剂为布洛芬或阿司匹林。

在实施方式中，一种或多种另外的治疗剂为降脂剂。在实施方式中，降脂剂为抑制素。在实施方式中，抑制素选自：阿托伐他汀、risuvostatin、辛伐他汀、普伐他汀，及其药用盐或前体药物。在一种实施方式中，抑制素为辛伐他汀或阿托伐他汀。

在实施方式中，一种或多种另外的治疗剂为mao抑制剂。在实施方式中，mao抑制剂选自雷沙吉兰、司来吉兰和反苯环丙胺。在实施方式中，mao抑制剂为mao-b抑制剂。在实施方式中，mao-b抑制剂为司来吉兰。

本发明也部分基于伊格美新的减少或预防神经细胞凋亡的能力和进一步提高伊格美新促进σ-1受体分子伴侣活性的能力，从而减弱构成疾病病理学基础的错误折叠蛋白的积累。因此，本申请提供单独使用伊格美新作为单一疗法、或使用伊格美新与一种或多种另外的治疗剂的组合或本申请描述的治疗方案，治疗神经退行性疾病或障碍的组合物和方法。在实施方式中，神经退行性疾病或障碍可选自：阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症(als)、亨廷顿病、多发性硬化症、帕金森病和额颞叶变性。在实施方式中，神经退行性疾病或障碍为阿尔茨海默病。在实施方式中，阿尔茨海默病为早发性疾病。

在本申请描述的治疗方法的实施方式中，体重约70公斤的成年人受试者给药伊格美新的治疗有效剂量为1mg至100mg，1mg至50mg，1mg至20mg，1mg至10mg，或1mg至5mg。优选地，剂量的给药途径是口服，最优选地，剂型适于每天一次递送有效剂量。

如下文较详细讨论的，本申请也提供在一种或多种药用赋形剂存在下包含伊格美新和一种或多种另外的治疗剂的药物组合物。在实施方式中，伊格美新以与一种或多种另外的治疗剂相同的剂型存在。在实施方式中，伊格美新以与一种或多种另外的治疗剂的不同剂型存在。本申请也提供单位剂型，其含有单独的伊格美新、或伊格美新与一种或多种另外的治疗剂的组合。在实施方式中，单位剂量含有1mg至100mg、1mg至50mg、1mg至20mg、1mg至10mg、1mg至5mg、或3mg至10mg的伊格美新，优选伊格美新盐酸盐。

整个本申请中使用的术语“伊格美新”可以指伊格美新本身(游离碱)，或可以包括伊格美新的药用盐、溶剂化物、包合物、水合物、多晶型物、前体药物、类似物或衍生物，如下所述。此处描述方法和组合物的实施方式的任一种中，伊格美新的优选实施方式是伊格美新盐酸盐。伊格美新含有与胺官能团相邻的不对称四取代碳原子，其导致外消旋、左旋和右旋形式的存在。除非另有说明，否则术语“伊格美新”是指标识为jo-1784或amy002的右旋(+)对映体。

伊格美新游离碱的结构如下所示：

伊格美新的iupac名称是：(+)-(e)-n-(环丙基甲基)-n-甲基-3,6-二苯基己-5-烯-3-胺，cas号为140850-73-3(其为(+)对映体的游离碱)。

伊格美新商购可得并且可以例如根据美国专利no.5,034,419中描述的方法制备，该专利还描述了伊格美新的药用盐、溶剂化物、包合物、水合物、多晶型物、前体药物、类似物和衍生物。

本申请所用的术语“药用盐”是例如通过与伊格美新的胺官能团的酸加成形成的盐。可用于制备这种加成盐的酸的非限制性实例包括乙酸、苯磺酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙磺酸、富马酸、氢溴酸、盐酸、乳酸、马来酸、苹果酸、甲磺酸、粘液、硝酸、扑酸、磷酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、硫酸和酒石酸。

伊格美新的盐可以由母体化合物通过常规化学方法合成，如下述中描述的方法：pharmaceuticalsalts:properties,selection,anduse,p.hemrichstalil(editor),camilleg.wermuth(editor),isbn:3-90639-026-8,august2002。通常，这种盐可以通过使母体化合物与适宜的酸在水中或在有机溶剂中或在水和有机溶剂两者的混合物中反应来制备。

本申请描述的化合物的一种盐形式可通过本领域技术人员熟知的方法转化为游离碱和任选转化为另一种盐形式。例如，游离碱可以通过使盐溶液通过含有胺固定相的柱(例如strata-nh2柱)形成。或者，盐在水中的溶液可以用碳酸氢钠处理，使盐分解并且从游离碱中沉淀出来。然后可以使用常规方法将游离碱与另一种酸组合。

术语“多晶型物”是指化合物(例如，伊格美新)的固体结晶形式或其复合物。相同化合物的不同多晶型物可以表现出不同的物理、化学和/或光谱性质。不同的物理性质包括但不限于稳定性(例如，热或光稳定性)、可压缩性和密度(在制剂和产品制造中是重要的)和溶出速率(其可影响生物利用度)。稳定性的差异可以由如下方面的变化引起：化学反应性(例如，差异性氧化，使得与当由另一种多晶型物组成时相比，剂型当由一种多晶型物组成时较迅速地变色)或机械特性(例如，片剂在储存时崩解，因为动力学上有利的多晶型物转化为热力学上较稳定的多晶型物)或化学反应性和机械特性两者(例如，一种多晶型物的片剂在高湿度下较易于破裂)。多晶型物的不同物理性质会影响它们的加工。一种多晶型物可较为可能形成溶剂化物，或者可较难以过滤或洗涤至不含杂质，这是由于例如该多晶型物颗粒的形状或尺寸分布引起的。

术语“水合物”是指化合物(例如伊格美新)或其盐，其进一步包括通过非共价分子间力结合的化学计量或非化学计量的水。

术语“包合物”是指包含空间(例如，通道)的晶格形式的化合物(例如伊格美新)或其盐，所述空间具有捕获在其中的客体分子(例如，溶剂或水)。

术语“前体药物”是指本申请描述的化合物(例如伊格美新)的衍生物，其可以在生物条件下(体外或体内)水解、氧化或以其它方式反应以提供本发明的化合物。前体药物可能仅在生物条件下的这种反应中变得有活性，或者前体药物可能以其未反应的形式具有活性。本发明预想的前体药物的实例包括但不限于本申请描述的化合物(例如伊格美新)的类似物或衍生物，其包含生物可水解的部分，如生物可水解的酰胺、生物可水解的酯、生物可水解的氨基甲酸酯、生物可水解的碳酸酯、生物可水解的酰脲和生物可水解的磷酸酯类似物。前体药物的其它实例包括本申请公开的式子中任一个的化合物的衍生物，其包含-no、-no2、-ono或-ono2部分。前体药物通常可以使用熟知的方法制备，如下述所述的那些方法：burger’smedicinalchemistryanddrugdiscovery(1995)172-178,949-982(manfrede.wolffed.,5^thed.)。

术语“溶剂化物”或“药用溶剂化物”是指由一种或多种溶剂分子与本申请公开的化合物之一(例如伊格美新)缔合形成的溶剂化物。术语溶剂化物包括水合物(例如，半水合物、一水合物、二水合物、三水合物、四水合物等)。

术语“类似物”是指在结构上与另一种结构相似但在组成上略有不同(如一个原子被不同元素的原子替代或存在特定官能团，或一种官能团被另一种官能团替代)的化合物。因此，类似物是在功能和外观上与参考化合物相似或相当、但在结构或来源上与参考化合物不相似的化合物。本申请使用的术语“衍生物”是指本申请描述的具有共同核心结构并且由各种基团取代的化合物。

治疗方法

本申请提供通过如下治疗有此需要的受试者的神经疾病或障碍的方法：向受试者给药治疗有效量的包含伊格美新或药用盐、溶剂化物、包合物、水合物、多晶型物、前体药物、其类似物或衍生物的组合物。在一种实施方式中，组合物包含伊格美新盐酸盐。本发明进一步提供伊格美新在制备用于治疗神经疾病或障碍的药物中的用途，如本申请描述的。

在本申请描述的方法的上下文中，向受试者给药的伊格美新的量为治疗有效量。术语“治疗有效量”是指如下的量，其量足以治疗、改善治疗的受试者的神经疾病或障碍的一种或多种临床症状的症状，减轻治疗的受试者的神经疾病或障碍的一种或多种临床症状的严重程度，延迟治疗的受试者的神经疾病或障碍的一种或多种临床症状的发作，或增强或改善另一种疗法的治疗效果，或改善或延迟所述疾病或障碍的一种或多种病理生理特征的发作。在实施方式中，体重70kg成年人的伊格美新的治疗有效量为1mg至100mg、1mg至50mg、1mg至20mg、1mg至10mg或1mg至5mg每天。优选的给药途径为口服。

根据本申请描述的方法，“有此需要的受试者”是已诊断患有神经疾病或障碍的受试者。在实施方式中，神经疾病或障碍选自阿尔茨海默病、早发性阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症、多发性硬化症、帕金森病、亨廷顿病和额颞叶变性。

组合治疗

本申请也提供包含组合治疗的方法。本申请使用的“组合治疗”或“共同治疗”包括给药治疗有效量的伊格美新与至少一种另外的活性剂作为特定治疗方案的一部分，意在提供来自伊格美新和另外的活性剂的共同作用的有益效果。“组合治疗”并不意在包括给药两种或更多种治疗化合物作为单独单一疗法方案的一部分，其偶然地和任意地产生并非预期或预测的有益效果。

至少一种另外的活性剂可以是治疗剂或非治疗剂及其组合。术语“治疗剂”和“活性药物成分”(“api”)在本申请中可互换使用。就治疗剂而言，组合的有益效果包括但不限于由治疗活性化合物的组合产生的药代动力学或药效学的共同作用。就非治疗剂而言，组合的有益效果可以涉及减轻与组合的治疗剂相关的毒性、副作用或不良事件。

在实施方式中，至少一种另外的药剂是非治疗剂，其减轻组合物中包含的伊格美新或第二api的一种或多种副作用。一种或多种副作用可选自恶心、呕吐、头痛、头晕、眩晕、嗜睡和应激中的任一种。

在实施方式中，治疗剂或api是胆碱酯酶抑制剂、抗炎剂、mao抑制剂、nmda受体拮抗剂、aβ毒性降低剂、激素替代剂、降脂剂、分泌酶调节剂、aβ凝集抑制剂、神经元纤维抑制剂或β-淀粉样分解代谢抑制剂。在实施方式中，治疗剂或api是胆碱酯酶抑制剂、抗炎剂、mao抑制剂或降脂剂。

根据本申请所述与治疗阿尔茨海默病相关的实施方式中的任一种，胆碱酯酶抑制剂可选自：毒扁豆碱、新斯的明、吡啶斯的明、阿伯侬、癸二胺苯酯、利凡斯的明、加兰他敏、多奈哌齐、他克林(四氢氨基吖啶)、腾喜龙、石杉碱甲、拉多替吉、恩其明和山莴苣苦素。在实施方式中，胆碱酯酶抑制剂为多奈哌齐。

在实施方式中，胆碱酯酶抑制剂选自：他克林，阿米利定，多奈哌齐及其衍生物tak-147和cp-118'954，苯哒吗啉，卡巴拉汀，加兰他敏，石杉碱，huprine，双-四氢氨基吖啶(双-tha)及其衍生物如双(7)-他克林，咪唑，1,2,4-噻二唑烷酮，苯并吖庚因(benzazepine)衍生物，4,4-联吡啶茚并喹啉胺(4,4-bipyridineindenoquinolinylamine)，十甲季铵，腾喜龙，bw284c51，毒扁豆碱，依斯的明，美曲磷酯，丙锭(propidium)，fasciculins，有机磷酸酯，氨基甲酸酯，亚氨基1,2,3,4-四氢环戊[b]吲哚氨基甲酸酯(ache抑制剂毒扁豆碱和mao抑制剂司来吉兰和反苯基炔胺的杂化物)，n-嘧啶4-乙酰苯胺衍生物，7-芳氧基香豆素衍生物，炔丙基氨基氨基甲酸酯如n-炔丙基氨基茚满和n-炔丙基苯乙胺，维生素e，nos抑制剂，前体如胆碱和吡咯烷胆碱，和胆碱能受体激动剂(如烟碱，特别是α7和毒蕈碱)。

根据本申请描述的与治疗阿尔茨海默病有关的实施方式中的任一种，抗炎剂可以是甾体或非甾体抗炎剂。在实施方式中，抗炎剂选自：肾上腺皮质激素，皮质类固醇(例如倍氯米松，布地奈德，氟尼缩松，氟替卡松，曲安西龙，甲泼尼龙，泼尼松龙，泼尼松，氢化可的松)，糖皮质激素和类固醇。在实施方式中，非甾体抗炎剂选自：阿司匹林，布洛芬，双氯芬酸和cox-2抑制剂。在实施方式中，抗炎剂选自：白三烯(leukotreine)拮抗剂(例如孟鲁司特，甲基黄嘌呤，扎鲁司特和齐留通)，β2-受体激动剂(例如沙丁胺醇，biterol，非诺特罗，isoetharie，奥西那林，吡布特罗，沙丁胺醇，特布他林福莫特罗，沙美特罗和沙丁胺醇特布他林)，抗胆碱能药物(例如，异丙托溴铵和氧托溴铵，柳氮磺胺吡啶，青霉胺，氨苯砜，抗组胺药，抗疟药(例如羟氯喹)，抗病毒药和抗生素(例如放线菌素d(原放线菌素))，博来霉素，红霉素，青霉素，光神霉素，和氨茴霉素(amc)。

根据本申请描述的与治疗阿尔茨海默病有关的实施方式中的任一种，mao抑制剂可选自雷沙吉兰、司来吉兰和反苯环丙胺。在实施方式中，mao抑制剂为mao-b抑制剂。在实施方式中，mao-b抑制剂为司来吉兰。

根据本申请描述的与治疗阿尔茨海默病有关的实施方式中的任一种，激素替代剂可选自：prefest，倍美力，vivelle，estrasorb，enjuvia，戊酸雌二醇，康美华和alora。

根据本申请描述的与治疗阿尔茨海默病有关的实施方式中的任一种，aβ毒性降低剂可选自非甾体抗炎药，死亡相关蛋白激酶(dapk)抑制剂(例如3-氨基哒嗪衍生物)，环加氧酶(cox-1和-2)抑制剂，抗氧化剂(例如，维生素c和e)，nmda的调节剂(例如，美金刚胺)和mao抑制剂(例如，雷沙吉兰、司来吉兰和反苯环丙胺)。在实施方式中，药剂是选自布洛芬、吲哚美辛和舒林酸硫化物的非甾体抗炎药。

根据本申请描述的与治疗阿尔茨海默病有关的实施方式中的任一种，降脂剂可选自3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a(hmg-coa)还原酶抑制剂和抑制素。在实施方式中，药剂选自甲基-β-环糊精，7-脱氢胆固醇还原酶(如bm15.766)，酰基辅酶a:胆固醇酰基转移酶(acat)抑制剂，p13k抑制剂，如渥曼青霉素、洛伐他汀、普伐他汀、阿托伐他汀、辛伐他汀、氟伐他汀、西立伐他汀、罗苏伐他汀、康帕丁、mevilonin、美伐他汀、visastatin、velostatin、斯伐他汀、rivastatin、伊伐他汀和匹伐他汀。

根据本申请描述的与治疗阿尔茨海默病有关的实施方式中的任一种，分泌酶抑制剂可选自β-分泌酶抑制剂和γ-分泌酶抑制剂。在实施方式中，分泌酶抑制剂选自：三肽醛1，sib-1281，om99-2，stat-val，烷氧基取代的四氢萘，基于二氟酮的化合物，sib-1405，羟基取代的肽脲，丙氨酸-苯基甘氨酸衍生物，己内酰胺，苯二氮杂卓类和己酰胺，enchylaminesulfonamide，双环磺酰胺和异香豆素，磺酰胺，二芳基乙炔，咪唑并吡啶和多氧化芳香结构，蛋白激酶c激活剂，谷氨酸，碳酰胆碱，毒蕈碱激动剂，ait-082(neotrophin^tm)，神经营养剂，含铜(ii)的化合物和胆固醇耗竭剂。

根据本申请描述的与治疗阿尔茨海默病有关的实施方式中的任一种，aβ凝集抑制剂可选自：肽基抑制剂(例如五肽抑制剂)，淀粉样蛋白结合染料刚果红和硫磺素t的类似物，抗癌剂阿霉素的类似物(例如蒽环霉素-4'-脱氧-4'-碘代抗坏血酸(anthracycline-4′-deoxy-4′-iododoxcorubicin)(idox))，抗体如利福平或其类似物和氯碘羟喹，苯并呋喃(例如skf-74652)，血清淀粉样蛋白(sap)的抑制剂如卡托普利(例如cphpc)，和通过加入cu2+、zn2+或fe3+的金属螯合。

根据本申请描述的与治疗阿尔茨海默病有关的实施方式中的任一种，神经元纤维抑制剂可选自：gsk3β抑制剂如lici、gsk3β，和cdk5抑制剂如靛玉红和paulones，以及钙蛋白酶抑制剂。

在实施方式中，将包含伊格美新的组合物与至少一种另外的活性剂一起以单一剂型或以单独的剂型给药。在一种实施方式中，剂型是口服剂型。在另一实施方式中，剂型适于静脉内给药。

在组合治疗的背景下，伊格美新的给药可以与一种或多种另外的活性剂的给药同时或相继进行。在另一实施方式中，组合治疗的不同组分的给药可以是不同的频率。一种或多种另外的活性剂可以配制成与伊格美新以单一剂型共同给药，如本申请较详细描述的。一种或多种另外的活性剂可以与包含本发明化合物的剂型分开给药。当另外的活性剂与伊格美新组合物分开给药时，可以采用与伊格美新组合物相同或不同的给药途径。

优选地，伊格美新与一种或多种另外的药剂组合给药在治疗的受试者中提供协同应答。在本文中，术语“协同”是指组合的疗效比单独一种治疗的加性效应更有效。与其组合之外的剂量和/或频率相比，根据本发明的组合治疗的协同作用可以允许在组合中使用较低剂量和/或较低频率给药至少一种药剂。组合的其它有益效果可以表现为避免或减少与单独使用组合中的任一种疗法(也称为单一疗法)相关的不良或不需要的副作用。

“组合治疗”也包括将本发明化合物与非药物疗法(例如手术或放射治疗)进一步组合给药。在组合治疗进一步包含非药物治疗的情况下，非药物治疗可以在任何合适的时间进行，只要实现治疗化合物和非药物治疗的组合的共同作用的有益效果即可。例如，在适当的情况下，当非药物治疗暂时从治疗化合物的给药中去除时，可能是数天或甚至数周，仍然可以得到有益效果。

根据本申请描述的方法中的任一种，伊格美新、例如伊格美新盐酸盐的治疗有效量范围对于成年人可为约1mg至100mg，约1mg至50mg，或约1mg至20mg每单位剂量，优选每天给药一次或两次，最优选每天给药一次。在实施方式中，伊格美新的治疗有效量为1mg至20mg，1mg至15mg，1mg至10mg，1mg至5mg，1mg至3mg，或1mg至2mg。

在伊格美新与胆碱酯酶抑制剂组合的实施方式中，较低剂量范围的伊格美新通常是有效的。例如，伊格美新与多奈哌齐的组合的治疗有效量可为1mg至10mg每天，1mg至8mg每天，1mg至6mg每天，1mg至5mg每天，1mg至4mg每天，1mg至3mg每天，或1mg至2mg每天。

如本领域技术人员认识到的，有效剂量也会变化，这取决于治疗的疾病，给药途径，赋形剂的使用，以及与其它治疗性治疗共同使用如使用其它药剂的可能性。

治疗有效量的伊格美新优选每天给药一次或两次。优选的给药途径是口服，但是考虑了其它途径，并且本领域技术人员可以使用标准方法基于本申请的指导容易地计算用于其它途径的适宜剂量。

在本申请描述的方法的上下文中使用的“受试者”优选是人受试者，但也可包括其它哺乳动物。哺乳动物可以是例如任何哺乳动物，例如人、灵长类动物、脊椎动物、鸟、小鼠、大鼠、家禽、狗、猫、牛、马、山羊、骆驼、绵羊或猪。术语“患者”是指人受试者。

本发明也提供本申请描述的治疗神经疾病或障碍的单一疗法。本申请使用的“单一疗法”是指向有此需要的受试者给药单一活性剂(也称为治疗剂)，例如伊格美新，在实施方式中为伊格美新盐酸盐。

本申请使用的“治疗”描述了为了对抗疾病或障碍而对患者的管理和护理，并且包括减轻疾病或障碍的一种或多种症状或并发症。

在实施方式中，给药本申请描述的组合物导致消除治疗的疾病或障碍的症状或并发症，然而，不需要消除。在一种实施方式中，症状的严重程度降低，或者其发作延迟，或两者兼而有之。

药物组合物和制剂

本发明提供的药物组合物包含伊格美新，或其药用盐、溶剂化物、包合物、水合物、多晶型物、前体药物、类似物或衍生物。药物组合物适用于哺乳动物，优选人。在该上下文中，组合物可进一步包含至少一种药用赋形剂或载体。在实施方式中，组合物包含有效量的伊格美新，其中该量可有效用于治疗神经疾病或障碍。用于成年人受试者的口服组合物每单位剂量的伊格美新的有效量通常小于20mg或小于10mg，通常在约1mg至20mg的范围内，优选1mg至10mg。如上所述，其中组合物包含伊格美新和另外的api，如胆碱酯酶抑制剂，组合物中的伊格美新的量可以处于其有效剂量范围的低端，例如1mg至10mg，优选1mg至5mg，或小于5mg。

在实施方式中，伊格美新组合物包含伊格美新盐酸盐。

在实施方式中，伊格美新组合物与至少一种api以单一剂型组合。在实施方式中，至少一种另外的api选自：胆碱酯酶抑制剂、aβ毒性降低剂、激素替代剂、降脂剂、分泌酶调节剂、aβ凝集抑制剂、神经元纤维抑制剂和β-淀粉样分解代谢抑制剂。在实施方式中，一种或多种另外的治疗剂为胆碱酯酶抑制剂。

在实施方式中，胆碱酯酶抑制剂可选自：毒扁豆碱，新斯的明，吡啶斯的明，阿伯侬，癸二胺苯酯，利凡斯的明，加兰他敏，多奈哌齐，他克林(四氢氨基吖啶)，腾喜龙，石杉碱甲，拉多替吉，恩其明和山莴苣苦素。在实施方式中，胆碱酯酶抑制剂为多奈哌齐。

在实施方式中，激素替代剂可以是雌激素或雌激素化合物。在实施方式中，激素替代剂可选自：prefest，倍美力，vivelle，estrasorb，enjuvia，戊酸雌二醇，康美华，和alora。

在实施方式中，aβ毒性降低剂可选自：非甾体抗炎药，死亡相关蛋白激酶(dapk)抑制剂(例如3-氨基哒嗪衍生物)，环加氧酶(cox-1和cox-2)抑制剂，抗氧化剂(例如维生素c和e)，nmda的调节剂(例如，美金刚胺)和mao抑制剂(例如，雷沙吉兰、司来吉兰和反苯环丙胺)。在实施方式中，药剂是选自布洛芬、吲哚美辛和舒林酸硫化物的非甾体抗炎药。

在实施方式中，降脂剂可选自3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a(hmg-coa)还原酶抑制剂和抑制素。在实施方式中，药剂选自甲基-β-环糊精，7-脱氢胆固醇还原酶(如bm15.766)，酰基辅酶a:胆固醇酰基转移酶(acat)抑制剂，p13k抑制剂，如渥曼青霉素、洛伐他汀、普伐他汀、阿托伐他汀、辛伐他汀、氟伐他汀、西立伐他汀、罗苏伐他汀、康帕丁、mevilonin、美伐他汀、visastatin、velostatin、斯伐他汀、rivastatin、伊伐他汀和匹伐他汀。

在实施方式中，分泌酶抑制剂可选自β-分泌酶抑制剂和γ-分泌酶抑制剂。在实施方式中，分泌酶抑制剂选自：三肽醛1，sib-1281，om99-2，stat-val，烷氧基取代的四氢萘，基于二氟酮的化合物，sib-1405，羟基取代的肽脲，丙氨酸-苯基甘氨酸衍生物，己内酰胺，苯二氮杂卓类和己酰胺，enchylaminesulfonamide，双环磺酰胺和异香豆素，磺酰胺，二芳基乙炔，咪唑并吡啶和多氧化芳香结构，蛋白激酶c激活剂，谷氨酸，碳酰胆碱，毒蕈碱激动剂，ait-082(neotrophin^tm)，神经营养剂，含铜(ii)的化合物和胆固醇耗竭剂。

在实施方式中，aβ凝集抑制剂可选自：肽基抑制剂(例如五肽抑制剂)，淀粉样蛋白结合染料刚果红和硫磺素t的类似物，抗癌剂阿霉素的类似物(例如蒽环霉素-4'-脱氧-4'-碘代抗坏血酸)，抗体如利福平或其类似物和氯碘羟喹，苯并呋喃(例如skf-74652)，血清淀粉样蛋白(sap)的抑制剂如卡托普利(例如cphpc)，和通过加入cu2+、zn2+或fe3+的金属螯合。

在实施方式中，神经元纤维抑制剂可选自：gsk3β抑制剂如lici、gsk3β，和cdk5抑制剂如靛玉红和paulones，以及钙蛋白酶抑制剂。

在实施方式中，至少一种另外的活性剂是选择为改善伊格美新或另外的api的一种或多种副作用的非治疗剂。

“药物组合物”是含有药物形式的化合物的制剂，其药用形式适于给药至受试者，优选人受试者。本申请使用的短语“药用”是指在合理的医学判断范围内适用于与人类和动物组织接触而没有过多的毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物、载体和/或剂型。

“药用赋形剂”是指可用于制备药物组合物的赋形剂，其通常是安全、无毒的，既不是生物学上也不是其它方面不合需要的，并且包括兽医用途以及人药物用途可接受的赋形剂。药物赋形剂的实例包括但不限于无菌液体，水，缓冲盐水，乙醇，多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)，油，洗涤剂，悬浮剂，碳水化合物(例如葡萄糖、乳糖、蔗糖或葡聚糖)，抗氧化剂(例如抗坏血酸或谷胱甘肽)，螯合剂，低分子量蛋白质，或其适宜的混合物。

药物组合物可以散装或剂量单位形式提供。特别有利的是以剂量单位形式配制药物组合物，以便于给药和剂量的均匀性。本申请使用的术语“单位剂型”是指适宜作为治疗的受试者的单一剂量的物理上离散的单位；计算每单位含有预定量的活性化合物以产生与所需的药物载体有关的所需治疗效果。本发明的单位剂型的规格通过活性化合物的独特特征和要实现的特定治疗效果决定并且直接取决于活性化合物的独特特征和要实现的特定治疗效果。单位剂型可以是安瓿、小瓶、栓剂、糖衣丸、片剂、胶囊、iv袋或气溶胶吸入器上的单个泵。

在治疗应用中，剂量取决于药剂，接受患者的年龄、体重和临床状况，以及临床医生或从业者给予治疗的经验和判断，以及影响所选剂量的其它因素。通常，剂量应该是治疗有效量。剂量可以mg/kg/天的测量单位提供(该剂量可以根据患者的体重(kg)、体表面积(m²)和年龄(年)进行调整)。有效量的药物组合物是提供临床医生或其他合格观察者所指出的客观可识别的改善的药物组合物。例如，减轻障碍、疾病或病况的症状。本申请使用的术语“剂量有效方式”是指药物组合物在受试者或细胞中产生所需的生物学效应的量。

在实施方式中，单位剂型可包含1mg至20mg或1mg至10mg的伊格美新或其药用盐。在实施方式中，单位剂量包含1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg或10mg的伊格美新。在实施方式中，单位剂量含有12mg、15mg或20mg的伊格美新或其药用盐。

药物组合物可采用任何适宜形式(例如，液体、气雾剂、溶液、吸入剂、雾、喷雾剂；或固体、粉末、软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、贴剂等)，以任何所需途径给药(例如，肺部、吸入、鼻内、口腔、颊、舌下、肠胃外、皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、胸膜内、鞘内、透皮、经粘膜、直肠等)。例如，本发明的药物组合物可以是用于通过吸入或吹入(通过口腔或鼻)进行气雾剂给药的水溶液或粉末的形式；用于口服给药的片剂或胶囊形式；适于通过直接注射或通过加入到无菌输注液进行静脉内输注给药的无菌水溶液或分散液形式；或用于透皮或透粘膜给药的洗剂、乳膏、泡沫、贴剂、悬浮液、溶液或栓剂的形式。

药物组合物可以是口腔可接受的剂型，其包括但不限于胶囊、片剂、经颊形式、锭剂、糖锭，和乳剂、含水悬浮液、分散液或溶液形式的口服液体。胶囊可包含本发明化合物与惰性填充剂和/或稀释剂的混合物，所述惰性填充剂和/或稀释剂如药用淀粉(例如玉米、马铃薯或木薯淀粉)，糖，人造甜味剂，粉状纤维素如结晶纤维素和微晶纤维素，面粉，明胶，树胶等。在口服用片剂的情况下，常用的载体包括乳糖和玉米淀粉。也可加入润滑剂，如硬脂酸镁。对于胶囊形式的口服给药，有用的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。当口服给药含水悬浮液和/或乳液时，本发明化合物可以悬浮或溶解在油相中，与乳化剂和/或悬浮剂混合。如果需要，可以加入某些甜味剂和/或调味剂和/或着色剂。

药物组合物可以是片剂的形式。片剂可包含单位剂量的本发明化合物以及惰性稀释剂或载体如糖或糖醇，例如乳糖、蔗糖、山梨糖醇或甘露糖醇。片剂可进一步包含非糖衍生的稀释剂，如碳酸钠，磷酸钙，碳酸钙，或纤维素或其衍生物如甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素，和淀粉如玉米淀粉。片剂可进一步包含粘合剂和造粒剂，如聚乙烯吡咯烷酮，崩解剂(例如可溶胀的交联聚合物，如交联的羧甲基纤维素)，润滑剂(例如硬脂酸酯)，防腐剂(例如对羟基苯甲酸酯)，抗氧化剂(例如bht)，缓冲剂(例如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂)，和泡腾剂如柠檬酸盐/碳酸氢盐混合物。

片剂可以是包衣片剂。涂层可以是保护膜涂层(例如蜡或清漆)或设计用于控制活性剂释放的涂层，例如在胃肠道中的特定位置延迟释放(在摄取后的预定滞后时间后释放活性物质)或释放。后者可以使用肠溶膜涂层，例如以商标名销售的那些实现。

片剂制剂可通过常规压制、湿法制粒或干法制粒方法制备，并且使用药用稀释剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、表面改性剂(包括表面活性剂)、悬浮剂或稳定剂，包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸、滑石粉、十二烷基硫酸钠、微晶纤维素、羧甲基纤维素钙、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、海藻酸、阿拉伯树胶、黄原胶、柠檬酸钠、复合硅酸盐、碳酸钙、甘氨酸、糊精、蔗糖、山梨糖醇、磷酸二钙、硫酸钙、乳糖、高岭土、甘露糖醇、氯化钠、滑石粉、干淀粉和糖粉。优选的表面改性剂包括非离子表面改性剂和阴离子表面改性剂。表面改性剂的代表性实例包括但不限于泊洛沙姆188、苯扎氯铵、硬脂酸钙、十六十八醇、聚西托醇乳化蜡、脱水山梨糖醇酯、胶体二氧化硅、磷酸盐、十二烷基硫酸钠、硅酸铝镁和三乙醇胺。

药物组合物可以是硬明胶胶囊或软明胶胶囊的形式。根据该制剂，本发明的化合物可以是固体、半固体或液体的形式。

药物组合物可以是适于肠胃外给药的无菌水溶液或分散液的形式。本申请使用的肠胃外术包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。

药物组合物可以是适于通过直接注射或通过加入到无菌输注液进行静脉内输注给药的无菌水溶液或分散液的形式，并且包含含有水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)的溶剂或分散介质，其适宜的混合物，或一种或多种植物油。本发明作为游离碱或药理学上可接受的盐的化合物的溶液或悬浮液可以在水中适宜地与表面活性剂混合制备。适宜的表面活性剂的实例如下。也可以在例如甘油、液体聚乙二醇及其在油中的混合物中制备分散液。

用于本发明方法的药物组合物除制剂中存在的任何载体或稀释剂(如乳糖或甘露糖醇)之外，还可包含一种或多种添加剂。一种或多种添加剂可包含一种或多种表面活性剂或由一种或多种表面活性剂组成。表面活性剂通常具有一个或多个长脂族链如脂肪酸，这使得它们能够直接插入细胞的脂质结构中以增强药物渗透和吸收。通常用于表征表面活性剂的相对亲水性和疏水性的经验参数是亲水-亲脂平衡值(“hlb”值)。具有较低hlb值的表面活性剂较具疏水性，并且在油中具有较大的溶解度，而具有较高hlb值的表面活性剂较具亲水性，并且在水溶液中具有较大的溶解度。因此，亲水性表面活性剂通常认为是hlb值大于约10的那些化合物，疏水性表面活性剂通常是hlb值小于约10的那些化合物。然而，这些hlb值仅为参考，这是因为对于许多表面活性剂，hlb值可以相差大约8个hlb单位，这取决于选择确定hlb值的经验方法。

用于本发明组合物的表面活性剂包括聚乙二醇(peg)-脂肪酸和peg-脂肪酸单酯和peg-脂肪酸二酯，peg甘油酯，醇-油酯交换产物，聚甘油脂肪酸，丙二醇脂肪酸酯，甾醇和甾醇衍生物，聚乙二醇脱水山梨糖醇脂肪酸酯，聚乙二醇烷基醚，糖及其衍生物，聚乙二醇烷基酚，聚氧乙烯-聚氧丙烯(poe-pop)嵌段共聚物，脱水山梨糖醇脂肪酸酯，离子表面活性剂，脂溶性维生素和它们的盐，水溶性维生素及其两亲性衍生物，氨基酸及其盐，有机酸及其酯和酸酐。

本发明也提供用于本发明方法的包含药物组合物的包装和试剂盒。试剂盒可包含一个或多个容器，所述容器选自瓶子、小瓶、安瓿、泡罩包装和注射器。试剂盒可以进一步包括本申请描述的用于治疗和/或预防神经疾病、病况障碍的一个或多个说明，一个或多个注射器，一个或多个施用器，或适于重构本发明的药物组合物的无菌溶液。

除非另有说明，否则本申请使用的所有百分比和比率均以重量计。本发明的其它特征和优点从不同的实施例中是明显的。提供的实施例说明了可用于实施本发明的不同组分和方法。这些实施例不限制要求保护的发明。基于本申请，本领域技术人员可以识别和使用可用于实施本发明的其它组件和方法。

实施例

er应激已经显示导致σ-1受体的快速上调，并且报道σ-1受体在帕金森病早期患者的壳核中以及阿尔茨海默病患者的大脑中的下调(jansenkl,etal.1993.brainres.623(2):299-302；mishinam,etal.2005.actaneurologicascandinavica112(2):103-107；toyoharaj,etal.2009.centralnervoussystemagentsinmedicinalchemistry9(3):190-196)。在这些受试者中看到的σ-1受体水平降低可提高大脑对er应激的易感性。因此，增加σ-1受体的先天伴侣活性的σ-1激动剂可以在治疗er应激与病理生理学有关的神经疾病中发挥治疗潜力。自由基的过量产生也与神经退行性疾病的病理生理学密切相关，这可通过ros或活性氮物种(rns)或通过死于这些疾病的患者脑组织的脂质过氧化产物修饰蛋白质侧链的调查结果得到证实。例如，在阿尔茨海默病患者的大脑中，铁(fe2+)和铜(cu2+)增加(jomovak,etal.2010.mol.cell.biochem.345(1-2):91-104)。这两种阳离子都能够刺激自由基的形成。总得来说，最近的研究结果表明，σ-1伴侣蛋白的主要作用可能是调节er应激和线粒体功能。然而，两种细胞内细胞器的调节及其通讯似乎明显有助于抑制ros和氧化应激。因此，包括许多基因转录物的ros相关下游信号协同工作以预防凋亡和炎症。

因此，我们研究了伊格美新是否对小鼠模型的急性阿尔茨海默病有效。在本研究之前，没有研究报道伊格美新对于疾病病理学的标志如神经炎症、神经细胞凋亡、淀粉样蛋白斑块负荷、tau蛋白过度磷酸化或氧化应激的作用。如下面讨论的，此处给出的结果表明，伊格美新治疗能够有效地防止这些疾病特征的发展，即使在暴露于神经毒性诱导的aβ25–35肽后的24小时开始伊格美新治疗也是如此。伊格美新抵抗该模型系统中疾病相关特征发展的神经保护作用通过治疗的动物的记忆表现和神经元生化参数的正常化来证实。

重要的是，在小鼠中在约0.1mg/k至1mg/kg的令人惊奇的低剂量范围内发现伊格美新的保护作用。该有效剂量远低于伊格美新的抗抑郁作用所需的剂量，其在小鼠内的剂量范围为30-60mg/kg。另外，我们展示伊格美新与胆碱酯酶抑制剂多奈哌齐协同作用，使得多奈哌齐能够在比典型的治疗有效范围低4倍的剂量范围内表现出治疗效果，其治疗人阿尔茨海默病的剂量范围为5mg/kg至23mg/kg。此处单胺氧化酶-b抑制剂、司来吉兰、非甾体抗炎化合物布洛芬和降脂剂、阿托伐他汀显示出类似的协同作用。观察到的与伊格美新的协同作用允许布洛芬和司来吉兰各自以比对于其主要适应症通常开处方的常用剂量低3倍的剂量使用和允许阿托伐他汀以比对于其主要适应症通常开处方的常用剂量低10倍的剂量使用。因此，这些结果表明，伊格美新与这些药剂的组合可为ad提供新的治疗方案，由于伊格美新和这些另外药剂两者的剂量低，预计可提高疗效同时减少当它们以较高剂量使用时与这种药剂相关的系统性副作用，从而提高这些药物在用于本申请描述的组合治疗时的治疗指数。

基于此处描述的结果，我们估计人体中的有效剂量范围如下。在伊格美新的与其抗抑郁活性相关的i期研究中，有效剂量为25mg和100mg每天。考虑到实施例1中在小鼠中观察到的高得多的疗效(改变100倍)，我们估计仅使用伊格美新(作为单一疗法)的神经保护的有效剂量范围对于平均体重(约70kg)的人来说为约2.5mg至10mg，或约0.035mg/kg/天至0.14mg/kg/天。多奈哌齐的剂量遵循类似的计算，因为人体中的常规剂量是5mg/天、10mg/天和23mg/天，并且当多奈哌齐与伊格美新联用时，疗效高4倍。因此，我们预计多奈哌齐与伊格美新组合的有效剂量范围为1mg/天至15mg/天，优选约1mg/天、2mg/天、3mg/天或4mg/天。

实施例1：伊格美新在阿尔茨海默病的aβ25-35小鼠模型中的神经保护作用

以下表明伊格美新而不是美金刚胺在阿尔茨海默病(ad)的aβ25-35小鼠模型中展示了神经保护作用。结果表明，在剂量比抑郁症活性剂量低100倍的情况下，伊格美新能够保护动物免于学习/记忆减退和免于通过侧脑室(i.c.v)注射aβ25-35毒性肽产生脑组织的深刻生化改变。当伊格美新不仅作为预防性急性治疗(即，在肽注射前的20分钟)而且作为在肽注射后的1天开始并且在记忆测试前的1天停止的慢性治愈性治疗给药时，都观察到这种保护作用。这些结果表明，伊格美新作为神经保护剂起作用，能够保护神经元免受肽的毒性作用，而不仅仅作为记忆增强剂。此处显示的结果表明，伊格美新可以通过减缓甚至阻止疾病病理的进展，使阿尔茨海默病早期阶段的患者或那些被认为具有高发病风险的患者受益。

该研究的目的是确定伊格美新(amy-002)是否可以减轻小鼠注射侧脑室(i.c.v)寡聚淀粉样-β25-35肽(aβ25-35)诱导的病理，并且确定该药物是否能与如下物质一起诱导协同作用：其它参比药物，乙酰胆碱酯酶抑制剂(achei)多奈哌齐nmda受体拮抗剂二甲金刚mao-b抑制剂司来吉兰(deprenyl)，非甾体抗炎药(nsaid)布洛芬(advil)或3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a(hmgcoa)还原酶抑制剂阿托伐他汀(立普妥))。

在肽给药后的7天，在aβ25-35诱导的学习减退(在y型迷宫测试中使用自我交替的空间工作记忆，以及使用被动回避测试的情景长期记忆)的衰减方面评估化合物的疗效。

实验1中，每个实验组的12只小鼠在侧脑室注射aβ25-35或乱序重排的肽(sc.aβ)前的20min进行腹腔注射给药伊格美新、多奈哌齐或媒介物。小鼠在注射后的7天或在指定的时间点进行测试。

实验2中，每个实验组的12只小鼠在通过侧脑室注射的0天给药sc.aβ或aβ25-35-淀粉样肽。在aβ25-35注射后的第1天至第6天进行腹腔注射给药伊格美新、多奈哌齐或媒介物。在第7天及以后对动物进行测试。

实验3中，每个实验组的12只小鼠在腹腔注射前的20分钟通过侧脑室注射给药sc.aβ或aβ25-35-淀粉样肽。其中两个不同剂量，各自为伊格美新(0.1mg/kg和0.3mg/kg)、多奈哌齐(0.25mg/kg和0.5mg/kg)和美金刚胺(0.5mg/kg和1mg/kg)。也测试了最低剂量组合：伊格美新0.1mg/kg+多奈哌齐0.25mg/kg或伊格美新0.1mg/kg+美金刚胺0.5mg/kg，以确定药物在神经保护中的协同作用。这些剂量本身各自都不能产生任何保护作用。通过计算组合指数评估协同作用/加和性/拮抗作用。在第0天，伊格美新、多奈哌齐、美金刚胺，各组合或媒介物溶液在侧脑室注射前的20min进行腹腔注射并且每天都进行直至第7天。然后在第7天及以后对动物进行测试。

实验4中，如在实验2中，从aβ25-35注射(第1天)后的24h开始，12只小鼠给药伊格美新或媒介物，6只小鼠给药布洛芬(25mg/kg)、司来吉兰(1mg/kg)或和阿托伐他汀(1mg/kg)与低剂量的伊格美新(0.1mg/kg)的组合，每天进行直到第6天。在第7天及以后对动物进行测试。在此处测试的剂量下，所有化合物本身都不能产生任何保护作用。

对于各实验1-4，在第7天，在y型迷宫测试中测试所有动物的自发交替行为表现，其为空间工作记忆的指数。在第8天和第9天，使用步入式被动回避程序评估动物的情景长期记忆。在第9天，在停留期后立即通过断头处死动物并且解剖出海马和皮质。分析海马的脂质过氧化，同时分析皮质的tau蛋白的神经炎症、细胞凋亡、淀粉样蛋白负荷和过度磷酸化。

表1.实验1的治疗组。

表2.实验2的治疗组。

表3.实验3的治疗组。

表4.实验4的治疗组。

伊格美新(amy002)、多奈哌齐、美金刚胺、布洛芬、司来吉兰和阿托伐他汀来自商业来源。收到后，检查药物和随附文件，登录并且储存在推荐的温度下。每次给药前都要新鲜制备药物。没有制备储备溶液。在生理盐水中制备溶液。所有溶液的给药体积为100μl，重量为20g。

淀粉样-β肽

aβ25-35:

■名称：淀粉样-β蛋白(25-35)、人、小鼠、大鼠

■cas：131602-53-4

■供应商：polypeptides(france)

■参考：sc489

■批次：aw13285a

■分子量：1060.28

■储存温度：-20℃

■外观：白色粉末

sc.aβ：

■名称：乱序重排的淀粉样-β蛋白(25-35)、人、小鼠、大鼠

■cas：na

■供应商：polypeptides(france)

■参考：sc942

■批次：aw13157a

■分子量：1060.26

■储存温度：-20℃

■外观：白色粉末

aβ25-35肽的均一寡聚体根据amylgen自身的步骤进行制备。每只小鼠用2.5％异氟烷麻醉并且侧脑室注射aβ25-35肽(9nmol/小鼠)或sc.aβ肽(9nmol/小鼠)，最终体积为3μl/小鼠，根据前述方法进行(mauricet,etal.(1996)。brainres.706(2):181-193,mauricet,etal.(1998)neuroscience83(2):413-428,meunierj,etal.(2006)britishj.pharmacol.149(8):998-1012,villardv,etal.(2009)neuropsychopharmacology34(6):1552-1566,villardv,etal.(2011)j.pharmacol.sci.115(3):279-292)。

动物：雄性瑞士小鼠，6周龄和体重30-35g，janvier(saintberthevin,france)，在蒙彼利埃第二大学的动物设施大楼内保持屋内饲养和进行实验(cecema，兽医服务办公室协议#b-34-172-23)。除了在行为实验期间外，将动物圈养在随意进入食物和水的组中。将它们保持在温度和湿度受控的动物设施中，进行12h/12h光照/黑暗循环(在07:00pm关灯)。小鼠通过使用永久标志标记小鼠尾巴进行编号。所有动物程序都严格遵守2010年9月22日的欧盟指令(2010/63/ue)执行。janvier的诊断总结报告附于研究报告中。

动物的随机化：每个笼子(n＝8-10)中，每只动物接受不同的治疗方案。由不参与行为和生化实验的实验者以随机方式在第0天进行动物手术。动物编码如下：实验者代码+笼编号(字母)+笼中的小鼠数。

死亡率：每天检查急性或延迟死亡率。研究期间没有小鼠死亡。

牺牲：在被动回避停留期结束时，在第9天，将动物断头处死。解剖海马和额叶皮质并且保持在-80℃直至测量脂质过氧化和其它标志。

自发交替行为表现：如前所述，通过在y型迷宫中的单一停留期间记录自发交替行为来评估即时工作记忆行为表现(itohj,etal.(1993)eurjpharmacol236(3):341-345；hiramatsumandinouek(1999)brjpharmacol127(3):655-660)。y型迷宫由灰色聚氯乙烯制成。y型迷宫的每个臂长40cm，宽3cm，底部高13cm，顶部宽10cm，并且以相等的角度会聚。每只小鼠放置在一只臂的末端，并且允许在8分钟的过程中自由地穿过迷宫。目视检查一系列臂入口，包括进入同一臂的可能回路。交替定义为连续进入所有三个臂的入口。因此，最大交替数是臂入口总数减去2，交替的百分比计算为(实际交替数/最大交替数)×100。参数包括交替百分数(记忆指数)和臂入口总数(探索指数)。显示极端行为的动物(交替百分数<20％或>90％或臂入口数目从计算中弃去。

被动回避测试：被动回避任务用于评估伊格美新治疗的小鼠的学习和记忆。装置是两个隔室(15×20×15cm高)的盒子，其中一个隔室用白色聚氯乙烯壁照亮，另一个隔室用黑色聚氯乙烯壁和网络地板变暗。闸门将每个隔室分开。实验过程中，位于设备上方40cm处的60w灯照亮了白色隔室。使用电击发生器扰频器(lafayetteinstruments,lafayette,usa)向网格地板给予乱序的足部电击(0.3ma，共3秒)。在训练阶段闸门最初是关闭的。在训练阶段，将每只小鼠置于白色隔室中。5秒后，所述门升起。当大鼠进入黑暗隔室并且将其所有爪子置于网格地板上之后，所述门关闭，并且给予足部电击3秒。记录步入潜伏期即进入黑暗隔室所花费的潜伏期和发声的次数。训练24小时后进行停留试验。将每只大鼠再次置于白色隔室中。5秒后门升起。记录步入潜伏期和逃脱潜伏期(对应于从暗隔室重新退出)长达300秒(meunierj,etal.(2006)。britishj.pharmacol.149(8):998-1012,villardv,etal.(2009)。neuropsychopharmacology34(6):1552-1566,villardv,etal.(2011)。j.psychopharmacology25(8):1101-1117)。在训练和停留期间显示低于10秒的潜伏期的动物认为是对该过程没有响应并且从计算中弃去。

脂质过氧化测量：在第24天，使用来自每组的6个海马。解冻后，将匀浆在冷甲醇(1/10w/v)中匀浆，在1,000g离心5分钟，并且将上清液置于eppendorf管中。将每种匀浆的反应体积加至1mmfeso4、0.25mh2so4、1mm二甲酚橙中，并且在室温孵育30min。在读取580nm处的吸光度(a5801)后，向样品中加入10μl过氧化氢异丙苯(chp)1mm，并且在室温孵育30min，以确定最大氧化水平。在580nm处测定吸光度(a5802)。脂质过氧化水平根据chpe＝a5801/a5802×[chp(nmol)]测定为chp当量，并且表示为每湿重组织的chp当量和对照组数据的百分数(媒介物治疗的sc.aβ-给药小鼠)。

酶联免疫吸附试验(elisa)检测：gfap，caspase12，淀粉样-β1-40，淀粉样-β1-42，总tau和ser199上的ptau的含量通过使用商业elisa测定试剂盒分析。

gfap：供应商：uscnk#ref：sea068mu

总tau：供应商：novex#ref：kmb7011

ptau(s199)：供应商：novex#ref：kmb7041

淀粉样β1-40：供应商：novex#ref：kmb3481

淀粉样β1-42：供应商：novex#ref：kmb3441

caspase-12：供应商：lsbio#ref：ls-f11023

bax：供应商：euromedex#ref：seb343mu

bcl2：供应商：euromedex#ref：sea778mu

对于所有测定，在50mmtris-150mmnacl缓冲液(ph7.5)中解冻后将皮质均质化，并且超声处理20秒。离心(16,100g，15min，4℃)后，收集上清液，并且根据制造商的说明进一步用于elisa测定。对于每一测定，在450nm处读取吸光度，并且使用标准曲线计算样品浓度。结果以pg或ng的蛋白质标记物每mg组织表示。对来自每个实验组的6只小鼠的皮质(n＝36/elisa试剂盒)进行测定，重复一次。

统计学分析：使用单因素方差分析(f值)对不同条件进行统计学分析，然后进行dunnett事后多重比较检验。除被动回避潜伏期外，所有值均表示为均值±均值标准误差。被动回避潜伏期不遵循高斯分布，因为设置了上截止时间。因此，使用kruskal-wallis非参数anova(h值)对它们进行分析，然后进行dunn多重比较检验。认为p<0.05具有统计学意义。

实验1(预治疗)：结果

y型迷宫的自发交替：与sc.aβ/veh-注射的小鼠相比，aβ25-35治疗诱导高度显著的自发交替缺陷(图1a)。伊格美新预治疗剂量依赖性地预防aβ25-35诱导的缺陷，其中两个活性剂量为0.3mg/kg和1mg/kg(图1a)。注意到对运动没有影响(图1b)。

被动回避测试：与sc.aβ/veh-注射的小鼠相比，从在停留期间的步入潜伏期(图2a)和逃避潜伏期(图2b)两方面来看，aβ25-35治疗诱导高度显著的被动回避缺陷。

伊格美新预治疗剂量依赖性地预防aβ25-35诱导的缺陷，其中显著预防对于步入潜伏期参数测试的两个最高剂量(图2a)和对于逃避潜伏期的最高剂量(图2b)。

注意的是，治疗对步入潜伏期影响轻微，并且在训练期间不影响电击敏感性。

脂质过氧化：与sc.aβ/veh-注射的小鼠相比，aβ25-35治疗诱导高度显著增加lpo。伊格美新治疗完全正常化lpo水平的剂量为1mg/kg(图3)。

实验2(治疗后的6天)：结果

y型迷宫的自发交替:与sc.aβ/veh-注射的小鼠相比，aβ25-35治疗诱导高度显著的自发交替缺陷。伊格美新治疗后以测试的最高剂量预防aβ25-35诱导的缺陷(图4)。注意到对运动没有影响(结果未示出)。

被动回避测试：与sc.aβ/veh-注射的小鼠相比，从在停留期间步入潜伏期(图5a)和逃避潜伏期(图5b)两方面来看，aβ25-35治疗诱导高度显著的被动回避缺陷。伊格美新治疗后剂量依赖性地预防aβ25-35诱导的缺陷，其中显著预防对于步入潜伏期参数(图5a)和逃避潜伏期(图5b)测试的最高剂量。注意的是，治疗不影响步入潜伏期和训练期间的电击敏感性。

脂质过氧化：与sc.aβ/veh-注射的小鼠相比，aβ25-35治疗诱导高度显著增加lpo。伊格美新治疗完全正常化lpo水平的剂量为1mg/kg(图6)。

gfap：aβ25-35治疗诱导显著增加gfap，gfap是反应性星形胶质细胞最着名的标志之一。伊格美新治疗完全正常化通过aβ25-35治疗产生的gfap升高的剂量为1mg/kg(图7)。

caspase12：aβ25-35治疗诱导高度显著增加caspase12(内质网应激的标志)。伊格美新治疗完全正常化caspase12升高的剂量为1mg/kg(图8)。

淀粉样β加工：aβ25-35治疗诱导高度显著增加aβ1-42而不是aβ1-40皮质含量。伊格美新治疗完全正常化通过aβ25-35治疗产生的aβ1-42升高(图9)。

tau加工：与sc.aβ/veh-注射的小鼠相比，aβ25-35治疗诱导高度显著增加皮质tau蛋白过磷酸化丝氨酸199(ptaus199)。伊格美新治疗完全正常化通过aβ25-35治疗产生的tau蛋白过磷酸化丝氨酸199(ptaus199)升高(图10)。

细胞凋亡：与sc.aβ/veh-注射的小鼠相比，aβ25-35治疗诱导bax/bcl-2高度显著的皮质增加。bcl-2蛋白是进化相关蛋白家族，主要参与调节程序性细胞死亡(凋亡)。bax是该家族中研究最多的成员，具有促凋亡活性，而bcl-2本身是研究最多的具有抗细胞凋亡活性的家族成员。am002治疗完全正常化bax/bcl-2比率升高(图11)。

实验3(c多奈哌齐和美金刚胺的联合研究)：结果

y型迷宫的自发交替:与sc.aβ/veh-注射的小鼠相比，aβ25-35治疗诱导高度显著的自发交替缺陷(图12)。

对每种化合物测试的两个剂量允许确定最高亚活性剂量：伊格美新为0.1mg/kg，多奈哌齐为0.25mg/kg，美金刚胺为0.5mg/kg。然后测试基于这些剂量的组合。(伊格美新+多奈哌齐)混合物导致极为重要的保护。(伊格美新+美金刚胺)混合物不会导致极为重要的保护。

被动回避测试：与sc.aβ/veh-注射的小鼠相比，从在停留期间的步入潜伏期(图13)来看，aβ25-35治疗诱导高度显著的被动回避缺陷。对每种化合物测试的两个剂量允许确定伊格美新和美金刚胺的亚活性剂量。(伊格美新+多奈哌齐)混合物导致极为重要的保护。(伊格美新+美金刚胺)混合物不会导致极为重要的保护。

脂质过氧化：与sc.aβ/veh-注射的小鼠相比，aβ25-35治疗诱导高度显著增加lpo。以0.1mg/kg亚活性剂量进行的伊格美新治疗与亚活性剂量的多奈哌齐(0.25mg/kg)产生协同作用，而其与美金刚胺不存在这种协同作用(图14)。

实验4(与布洛芬、司来吉兰和阿托伐他汀的联合研究)：结果

布洛芬、司来吉兰和阿托伐他汀能够以剂量依赖性的方式保护小鼠免受通过aβ25-35治疗产生的伤害。当选择亚活性剂量的这三种化合物为与0.1mg/kg伊格美新(其自身无活性)联用时，我们观察到记忆减退的非常显著逆转，如图15、图16和图17所示。

讨论

本申请数据表明，使用阿尔茨海默病的急性模型，伊格美新具有神经保护作用。该药物预防了学习和记忆减退出现在评估不同类型的记忆过程的如下两个程序中：y型迷宫测试的空间工作记忆和被动回避测试的情景长期记忆。预治疗和治疗后两者均显示出显著的疗效。观察到对于记忆能力的这种保护作用与我们可以测量的如下两种作用的相似保护作用相关：脂质过氧化(lpo水平)和er应激(caspase12)。进一步的分析表明，伊格美新治疗能够调节神经炎症的活化，这可以通过gfap(星形胶质细胞活化的标志)的减少以及通过使用比率bax/bcl2升高作为标志的凋亡激活来证实。在我们的模型中，病理学的如下两个重要标志也正常化了：aβ1-42升高和ptaus199。

与已经报道的在高于30mg/kg的剂量发生的抗抑郁作用相比，在低至0.3mg/kg的剂量(当作为预防性治疗给予时)或者作为治疗性治疗的1mg/kg(从诱导毒性后的第1天开始)观察到伊格美新的效果。伊格美新的疗效确定为与在抑郁症的小鼠模型中相比，在阿尔茨海默病(ad)的小鼠模型中在神经保护作用方面高30至100倍。此外，当与多奈哌齐、布洛芬、司来吉兰或阿托伐他汀组合使用时，该药物显示出明显的协同作用，而与美金刚胺没有观察到明显的协同作用。该组合允许使用伊格美新的剂量比抑郁症活性剂量低300倍。当与伊格美新联用时，多奈哌齐的剂量可降低4倍。

类似地，布洛芬或阿托伐他汀与非常低剂量的伊格美新的共同给药得到全神经保护作用，其剂量分别比布洛芬或阿托伐他汀在人中通常规定的剂量低3倍或10倍(根据从小鼠至人的异速生长标度计算得到的值进行计算)。司来吉兰在与治疗人抑郁症的相同剂量显示出保护作用。除了其自身的神经保护作用外，伊格美新通过拓宽其它潜在治疗工具的安全窗口开辟了以低剂量治疗ad的新途径。

实施例2：伊格美新在帕金森病模型中的作用：6ohda损伤大鼠原代多巴胺能神经元

鼠多巴胺能神经元的原代培养物

大鼠多巴胺能神经元如所述进行培养(schinellis,etal.journalofneurochemistry50(6):1900-1907)。简而言之，通过颈椎脱位(ratswistar；janvier)将15天妊娠的怀孕雌性大鼠杀死并且从子宫中取出胎儿。将胚胎中脑取出并且置于含有2％青霉素-链霉素(ps；panbiotech，ref：p06-07100，批次：7511015)和1％的牛血清白蛋白(bsa；panbiotech，ref：p06-1391100，批次：h140904)的leibovitz15(l15；panbiotech，refp04-27055，批次：8810315)的冰冷培养基中。只有中脑曲的腹部用于细胞制备，因为发育中的脑的该区域富含多巴胺能神经元。将中脑通过胰蛋白酶消化在37℃解离20分钟(min)(trypsinedta1x；panbiotech，ref：p10-023100，批次：1670415)。反应通过加入如下物质终止：含有等级ii的dnasei(0.1mg/ml；panbiotech，ref：p60-37780100，批次：h140508)和10％的胎牛血清(fcs；invitrogen)的dulbecco修饰的eagle培养基(dmem；panbiotech，ref：p04-03600，批次：9021115)。然后将细胞3次通过10ml移液管进行机械解离。然后将细胞在4℃在l15培养基中的bsa(3.5％)层上以180×g离心10min。弃去上清液，将细胞团块重新悬浮在确定的由如下组成的培养基中：neurobasal(invitrogen，ref：21103，批次：1754639)，补充有b27(2％；invitrogen，ref：17504，批次：1799273)，l-谷氨酰胺(2mm；panbiotech，ref：p04-80100，批次：6620314)和2％的ps，10ng/ml的bdnf(panbiotech，ref：cb-1115002，批次：121027)和1ng/ml的gdnf(panbiotech，ref：cb-1116001，批次：h151004)。使用台盼蓝排除试验用neubauer细胞计数器计数活细胞。将细胞以4×10⁴个细胞/孔的密度接种于96孔板(预涂有聚-d-赖氨酸；greiner，ref：e150033vj)中并且在37℃在潮湿的空气(95％)/二氧化碳(5％)的气氛中培养。每2天用新鲜培养基更换一半培养基。在这些条件下，培养5天后，星形胶质细胞存在于培养物中并且释放生长因子，从而允许神经元分化。5％至6％的神经元细胞群是多巴胺能神经元。

伊格美新对于大鼠多巴胺能神经元的神经保护作用

简而言之，在培养的第6天，用测试化合物或参考化合物预处理细胞1h，然后用6ohda(20μm)使其中毒48h。

完成以下条件：

_对照(dmso0.1％)

_+6ohda(20μm，48h)/dmso0.1％

_+6ohda(20μm，48h+bdnf(50ng/ml)作为参考化合物

_+6ohda(20μm，48h)+伊格美新(0.1μm，0,3μm，1μm，3μm，10μm，30μm，100μm)

每种条件下以6个孔进行一次培养。

终点评价：测量大鼠多巴胺能神经元的总数

在存在或不存在测试化合物的情况下48小时中毒后，在室温通过4％多聚甲醛溶液(sigma，ref6148，批次：slbh4356v)固定细胞20min，对照条件也遵循相同程序固定。然后使细胞透化，将非特异性位点用含有0.1％皂苷(sigma；ref：s7900，批次：bcbj8417v)和1％胎牛血清(fcs)的磷酸盐缓冲盐水溶液(pbs；panbiotech；ref：p04-36500，批次：7250616)在室温封闭15min。将细胞与小鼠中产生的单克隆抗酪氨酸羟基激酶抗体(th，抗体-sigma；ref：t1299，批次：101m4796)在含有1％fcs、0.1％皂苷的pbs在室温孵育2h。针对th的抗体染色多巴胺能神经元。

将抗体与alexafluor488山羊抗小鼠igg(分子探针，ref：a11001，批次：1752514)在含有1％fcs、0.1％皂苷的pbs中在室温显示1h。将细胞核在相同溶液中用荧光标记(hoechst溶液，sigma；ref：b1155，批次：011m4004v)标记。

对于每一条件，使用incellanalyzertm2000(gehealthcare)以20×放大率拍摄20张图片每孔。每一培养孔的图像在相同条件拍摄。th阳性神经元的细胞体分析使用developer软件(gehealthcare)进行。每一实验条件共提供6个数据。

统计学

数据表示为均值±均值标准误差(6个数据每一条件，1个培养物)。对数据使用dunnett检验然后进行单因素方差分析(anova)分析，认为p<0.05具有统计学意义。

结果

根据图18，以20μm施用6ohda48h诱导大幅和显著减少th阳性神经元(**，p<0.01，相对于对照为57.14％)。施用bdnf(50ng/ml)显示针对6ohda损伤的保护作用(#p<0.05，相对于对照组为91.03％)。该结果证实了该研究。伊格美新(amy002)在0.3μm、1μm(##p<0.01，相对于对照分别为94.58％和100.49％)和3μm(#p<0.05，相对于对照为87.68％)，显示了对6ohda的重要保护作用。th阳性神经元数目(用偶联至alexa488的二抗标记)通过施用6ohda显著降低。伊格美新保护神经元免受由6ohda治疗诱导的细胞死亡。

结论

在0.3μm、1μm和3μm的伊格美新显示对由6ohda(20μm，48小时)损伤的多巴胺能神经元存活的保护作用。这些结果表明，伊格美新可对帕金森病的治疗具有治疗意义。

实施例3：伊格美新对于亨廷顿病模型的作用：培养物中的谷氨酸损伤后大鼠gaba能神经元的存活率。

中型多棘神经元的大鼠原代培养物

大鼠msn的纹状体如所述进行培养(ivkovics,etal,(1999)thejournalofneuroscience:theofficialjournalofthesocietyforneuroscience19(13):5409-5419)。

简而言之，通过颈椎脱位(ratswistar；janvier)将15天妊娠的怀孕雌性大鼠杀死并且从子宫中取出胎儿。将胚胎中脑取出并且置于含有2％青霉素-链霉素(ps；panbiotech，ref：p06-07100，批次：7511015)和1％的牛血清白蛋白(bsa；panbiotech，ref：p06-1391100，批次：h140904)的leibovitz15(l15；panbiotech，refp04-27055，批次：8810315)的冰冷培养基中。只有中脑曲的腹部用于细胞制备，因为发育中的脑的该区域富含多巴胺能神经元。将中脑通过胰蛋白酶消化在37℃解离20分钟(min)(trypsinedta1x；panbiotech，ref：p10-023100，批次：1670415)。反应通过加入如下物质终止：含有等级ii的dnasei(0.1mg/ml；panbiotech，ref：p60-37780100，批次：h140508)和10％的胎牛血清(fcs；invitrogen，ref：10270-098，批次：41g8542k)的dulbecco修饰的eagle培养基(dmem；panbiotech，ref：p04-03600，批次：9021115)。然后将细胞3次通过10ml移液管进行机械解离。然后将细胞在4℃在l15培养基中的bsa(3.5％)层上以180×g离心10min。弃去上清液，将细胞团块重新悬浮在确定的由如下组成的培养基中：neurobasal(invitrogen，ref：21103，批次：1754639)，补充有b27(2％；invitrogen，ref：17504，批次：1799273)，l-谷氨酰胺(2mm；panbiotech，ref：p04-80100，批次：6620314)和2％的ps。使用台盼蓝排除试验用neubauer细胞计数器计数活细胞。将细胞以70000个细胞/孔的密度接种于96孔板(预涂有聚-d-赖氨酸；greiner，ref：e150033vj)中并且在37℃在潮湿的空气(95％)/二氧化碳(5％)的气氛中培养。每2天用新鲜培养基更换一半培养基。在这些条件下，培养5天后，星形胶质细胞存在于培养物中并且释放生长因子，从而允许神经元分化。5％至6％的神经元细胞群是多巴胺能神经元。

伊格美新(amy002)对于大鼠msn的神经保护作用

简而言之，培养11天后，除去培养基，在中毒前2小时加入含有测试化合物的新鲜培养基。然后加入谷氨酸(40μm，20分钟内)和测试化合物。中毒20min后，在谷氨酸中毒后接下来的24小时期间，用不含谷氨酸和含有伊格美新的培养基更换上清液。完成以下条件：

_在20min内和接下来的24小时内的培养基

_在20分钟内的谷氨酸(40μm)，在接下来的24小时内的对照培养基。

_20min内的谷氨酸(40μm)+伊格美新(0.1μm，0,3μm，1μm，3μm，10μm，30μm，100μm)和在接下来的24小时内的对照培养基+伊格美新(0.1μm，0,3μm，1μm，3μm，10μm，30μm，100μm)。

_20min内的谷氨酸(40μm)+bdnf(10ng/ml)和在接下来的24小时内的对照培养基+bdnf(10ng/ml)。

每种条件下以6个孔进行一次培养。

终点评价：测量darpp32神经元的总数

中毒结束时，在室温通过4％多聚甲醛溶液(sigma，ref6148，批次：slbh4356v)固定细胞20min，对照条件也遵循相同程序固定。然后使细胞透化，将非特异性位点用含有0.1％皂苷(sigma；ref：s7900，批次：bcbj8417v)和1％胎牛血清(fcs)的磷酸盐缓冲盐水溶液(pbs；panbiotech；ref：p04-36500，批次：7250616)在室温封闭15min。将细胞与兔多克隆一抗抗darpp32(millipore)和小鼠单克隆一抗抗map2(sigma，)在含有1％fcs、0.1％皂苷的pbs在室温孵育2h。将抗体与alexafluor488山羊抗小鼠igg(分子探针，ref：a11001，批次：011m4004v)和alexafluor568山羊抗兔(分子探针，ref：a11011，批次：1670154)在含有1％fcs、0.1％皂苷的pbs中在室温显示1h。将细胞核在相同溶液中用荧光标记(hoechst溶液，sigma；ref：b1155，批次：011m4004v)标记。

对于每一条件，使用incellanalyzertm2000(gehealthcare)以20×放大率拍摄20张图片每孔。darpp32阳性神经元的细胞体分析使用developer软件(gehealthcare)进行。每一实验条件共提供6个数据。

统计学

数据表示为均值±均值标准误差(6个数据每一条件，1个培养物)。对数据使用单因素方差分析(anova)然后dunnett检验进行了全局分析。显著性水平设定为p<0.05。

结果

根据图19，以40μm施用谷氨酸20min诱导大幅和显著减少darpp32阳性神经元(***p<0.001，相对于对照为53.00％)。施用bdnf(10ng/ml)显示针对6ohda损伤的保护作用(##p<0.01，相对于对照为90.14％)。该结果证实了该研究。伊格美新(amy002)在0.3μm和1μm显示出针对谷氨酸的显著保护作用(##p<0.01，相对于对照为89.28％，和#p<0.05，相对于对照为81.60％)。谷氨酸诱导大幅和显著减少darpp32阳性神经元数目(map2和darpp32标记的细胞)。在0.3μm和1μm的伊格美新保护神经元免受由谷氨酸诱导的细胞死亡。

结论

在0.3μm和1μm的伊格美新显示了对于由谷氨酸损伤(40μm，20min)的msn存活的保护作用，这表明该化合物对于治疗亨廷顿病的潜在意义。

实施例4：评价伊格美新(amy002)对谷氨酸损伤后运动神经元存活的神经保护作用：研究mnd/als(运动神经元疾病/肌萎缩侧索硬化症)发病机制的模型。

运动神经元培养

大鼠运动神经元如所述进行培养(camuetal.(1994)journaloftheneurologicalsciences124suppl:73-74)。简而言之，通过颈椎脱位(ratswistar；janvierlab)将14天妊娠的怀孕雌性大鼠杀死并且从子宫中取出胎儿。将脊髓取出并且置于冰冷的pbs中。将组织切片离心，在0.025％(w/v)胰蛋白酶-edta(panbiotech，ref：p10-023100)中于37℃孵育10min。将片段转移到1ml含有bsa(0.4％，dustcher，ref：p06-1391100)和等级ii的dnase1(0.1mg/ml，panbiotech，ref：p60-37780100)的完全leibovitz培养基中。然后将细胞通过几轮研磨进行解离，在4％bsa垫上以470g离心5min，并且重新悬浮于2ml补充的l15培养基中。使用台盼蓝排除试验以neubauer细胞计数器计数运动神经元。将细胞以96孔板的1.5×10⁴细胞/孔的密度在neurobasal(invitrogen，ref：21103)中的星形胶质细胞单层上在37℃在潮湿的空气(95％)/二氧化碳(5％)的气氛中培养，所述neurobasal含有1％的b27(invitrogen，ref：17504)，2mml-谷氨酰胺(panbiotech，ref：p04-80100)，1％的pssolution,25mm2-mercaptoethanol(invitrogen，ref：31350-010)，2％马血清(invitrogen，ref：16050-122)，1ng/ml的脑源性神经营养因子(bdnf，panbiotech，ref：cb-1115002)，和1ng/ml的胶质源性神经营养因子(gdnf，dustcher，ref：cb-1116001)。

谷氨酸中毒和药物治疗

简而言之，培养10天后，除去培养基，在谷氨酸中毒前的1小时加入100μl不含测试化合物或含有测试化合物的新鲜培养基(补充的neurobasal，不含神经营养因子)。然后，在培养基中加入不存在或不存在测试化合物的40μm谷氨酸，并且孵育20min。细胞用孵育溶液冲洗(3次洗脱)，并使其在含有化合物或对照培养基的neurobasal培养基中24h。

以下是实验条件：

_以媒介物培养基模拟的对照培养基

_以谷氨酸模拟(40μm，20min)的对照培养基

_以谷氨酸模拟(40μm，20min)的7种浓度(定义)的伊格美新(amy002)

_以谷氨酸模拟(40μm，20min)的50ng/ml的bdnf

终点评价：测量islet1/2阳性运动神经元的总数

中毒结束时，在室温通过4％多聚甲醛溶液(sigma，ref6148，批次：slbh4356v)固定细胞20min，对照条件也遵循相同程序固定。然后使细胞透化，将非特异性位点用含有0.1％皂苷(sigma；ref：s7900，批次：bcbj8417v)和4％山羊血清(gibco，ref：16210072，批次：1517955)和1％bsa(dutsher，ref：p06-1391100，批次：h140904)的磷酸盐缓冲盐水溶液(pbs；panbiotech；ref：p04-36500，批次：1871016)在室温封闭15min。将细胞与小鼠单抗抗-islet1/2(杂交瘤库，参考：39.4d5-c，批次：2/25/16-311ag/ml)和鸡单抗抗-map2(abcam，ref：ab5392，批次：gr286806-3)在含有4％山羊血清，1％bsa，0.1％皂苷的pbs中在室温孵育过夜。将这些抗体与alexafluor488山羊抗小鼠igg(分子探针，ref：a11001，批次：1752514)和alexafluor633山羊抗鸡(分子探针，ref：a21449，批次：1698677)在含有4％山羊血清、1％bsa、0.1％皂苷的pbs中在室温显示1h。将细胞核在相同溶液中用荧光标记(dapi，sigma；ref：b1155，批次：011m4004v)标记。

对于每一条件，使用incellanalyzertm2000(gehealthcare)以20×放大率拍摄20张图片每孔。每一培养孔的图像在相同条件拍摄。islet1/2阳性神经元的细胞体使用developer软件(gehealthcare)进行分析。每一实验条件共提供6个数据。

数据处理/统计学分析

数据表示为均值±均值标准误差(6个数据每一条件，1个培养物)。对数据使用单因素方差分析(anova)，然后dunnett检验进行了全局分析。统计学上的显著性水平设定为p<0.05。

结果

根据图20，以40μm施用谷氨酸20min诱导以红色标记的islet1/2阳性神经元大幅和显著减少(***p<0.001，相对于对照为47.17％)。施用bdnf(50ng/ml)显示出保护作用(##p<0.01，相对于对照为96.43％)。该结果证实了该研究。

在0.1μm、0.3μm、1μm、3μm和10μm的伊格美新(amy002)显示出针对谷氨酸的显著保护作用。其作用在10μm是最强的(###p<0.001，相对于对照为126％)。有趣的是，与在对照条件下相比，即使在存在谷氨酸中毒的情况下，当测试化合物以3μm和10μm施用时，运动神经元存活率也较高(但不是显著的)。

结论：

在0.1μm、0.3μm、1μm、3μm和10μm的伊格美新显示出对于由谷氨酸损伤(40μm，20min)的运动神经元存活的保护作用。这些结果明显表明该化合物对治疗mnd/als的潜在意义。

实施例5：伊格美新对于未折叠蛋白反应(upr)的作用

以下表明伊格美新促进σ-1受体从另一er伴侣免疫球蛋白重链结合蛋白(bip)/grp78的解离。当σ-1受体与bip形成复合物时，伴侣活性最小化。相比之下，从bip解离的σ-1受体对负责upr的错误折叠蛋白发挥最大伴侣活性。

材料与方法

cho细胞在6孔板中生长，并且用化合物在培养基中于37℃以1μm和10μm最终浓度处理30min。通过除去培养基并且在37℃加入3mlpbs终止反应。收获cho细胞并且将其悬浮于50mmhepes(ph7.4)中，然后与50μg/ml的二硫代(双)琥珀酰亚胺丙酸酯(thermofisherscientific，waltham，ma)在4℃交联30min。加入tris-hcl(ph8.8，最终50mm)终止反应。在冰上孵育15分钟后，细胞用ripa缓冲液[50mmtris(ph7.4)，150mmnacl，1％tritonx-100，0.3％脱氧胆酸钠，0.1％sds，蛋白酶抑制剂混合物(rochecomplete)]裂解。在12,000g离心1min后，将上清液在44℃与sig-1r抗体(abcam)一起孵育过夜。将细胞裂解物与sepharose蛋白-a(invitrogen)一起孵育90min。在12,000g离心1min后，弃去上清液，将丸粒在0.5mlripa缓冲液中洗涤。在12,000g第二次离心20min后，弃去上清液，将丸粒在0.5ml2×样品缓冲液/bmce缓冲液中洗涤。在12,000g第三次离心1min后，根据制造商的方案(uscnk#sec343mu)通过elisa测定分析上清液。

结果和讨论

如图21所示，伊格美新以剂量依赖性的方式产生了从σ-1受体bip的解离。该解离通过σ拮抗剂ne100得到预防。

这些结果表明，伊格美新能够促进σ-1受体从bip的解离。该解离促进了σ-1受体的分子伴侣活性，从而减弱了错误折叠的蛋白质在细胞中的积累。这种错误折叠的蛋白质(积累)将引发未折叠蛋白反应(upr)，其导致激活细胞死亡途径。因此，σ-1受体对upr的负调控限制了通过错误折叠蛋白积累诱导的细胞凋亡。伊格美新对σ-1受体伴侣活性的激活作用使伊格美新成为神经退行性疾病和障碍的可行治疗候选者，所述神经退行性疾病和障碍如阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症、多发性硬化症、帕金森病、亨廷顿病和额颞叶变性。另外，同样的作用机制表明，伊格美新也可对传染性朊病毒脑病如克罗伊茨费尔特-雅各德病有效，这些障碍在错误折叠的蛋白质和受影响的神经元群体方面存在差异。