含有肉毒杆菌毒素和稳定剂的液体制剂及其制备方法与流程

本发明涉及含有肉毒杆菌毒素和稳定剂的液体制剂及其制备方法。
背景技术：
：从19世纪90年代到现在，已经发现了许多能够分泌具有神经毒性作用的毒素的梭菌属(clostridiumsp.)菌株，并且在过去的70年中已经对这些菌株分泌的毒素进行了表征(schant，e.j.等，microbiol.rev.，56：80,1992)。在这些毒素中，肉毒杆菌毒素(botulinumtoxin)在具有神经功能的动物的神经肌肉连接的胆碱能突触前抑制乙酰胆碱的胞吐，从而导致虚弱。因此，最近已经努力将肉毒杆菌毒素的神经毒性用于美容或治疗目的。已经提出或尝试使用肉毒杆菌毒素治疗视神经疾病(美国专利号6,265,379)、疼痛(美国专利号6,113,915)、各种自主神经疾病，包括汗腺疾病(美国专利号5,766,605)、偏头痛(美国专利号5,714,468)、术后疼痛和内脏疼痛(美国专利号6,464,986)、牛皮癣和皮炎(美国专利号5,670,484)、各种癌症(美国专利号6,139,845和6,063,768)及神经源性炎症(美国专利号6,063,768)等的技术。然而，肉毒杆菌毒素作为一种蛋白质制剂，其存在的问题是，它不易配制成药物组合物，也不易储存、分配和管理。这是由于蛋白质的不稳定性造成的，而在肉毒杆菌毒素等蛋白质制剂在极低浓度下被配制成药物成分的情况下，问题非常严重。肉毒杆菌毒素蛋白具有附着于固体表面的特性，因此，当将蛋白质注入容器中时，一部分蛋白质可能附着在容器的内壁上从而导致活性成分的损失，并且蛋白质可能容易被氧化或降解成小片段。因此，为了最大限度地防止肉毒杆菌毒素变性，在其生产过程中纯化的肉毒杆菌毒素被配制为冻干粉末，其在临床应用前立即在盐水中稀释，并以液体的形式给患者服用。然而，在这种情况下，还存在一个问题，即由于人为错误(如使用者造成的稀释因子错误或稀释盐水污染)，很可能发生医疗事故。因此，迫切需要开发即使在肉毒杆菌毒素液体制剂的生产和分配过程中也能防止蛋白质变性的稳定剂。在现有技术中，白蛋白被积极地用作维持肉毒杆菌毒素活性的稳定剂。然而，由于交叉感染的风险和动物源性成分的副作用，最近需要开发非动物制剂。为了响应于该要求，美国专利申请公开号2007-0134199公开了包含谷氨酰胺和谷氨酸或天冬酰胺和天冬氨酸作为氨基酸的肉毒杆菌毒素组合物，并且韩国专利号1087017公开了包含甲硫氨酸作为稳定剂的肉毒杆菌毒素组合物。然而，这些专利文件并没有显示出在适合于人体的温度和ph的条件下具有显著的效果。因此，本发明涉及一种含有肉毒杆菌毒素和稳定剂的液体制剂及其制备方法。根据本发明，包含肉毒杆菌毒素的药物组合物可以含有精氨酸，谷氨酸或天冬氨酸作为稳定剂，或者可以含有葡糖糖酸内酯缓冲剂或酒石酸缓冲剂作为肉毒杆菌毒素的稳定缓冲剂。根据人体的温度和酸碱度，在适宜的条件下对肉毒杆菌毒素的稳定性有显著影响。因此，期望本发明的药物组合物对肉毒杆菌毒素的安全、方便的医疗使用具有很大的帮助。技术实现要素：技术问题本发明是为了解决现有技术中出现的上述问题，本发明的目的是提供一种含有肉毒杆菌毒素和稳定剂的液体制剂及其制备方法。然而，本发明要实现的技术目的不限于上述技术目的，并且本领域技术人员从以下描述中可以清楚地理解上面未提及的其他目的。技术方案在下文中，将参考附图描述本文的各种实施方式。在以下描述中，阐述了许多具体细节，例如具体形式、组成和工艺等，以便提供对本发明的透彻理解。然而，某些实施方式可以在没有这些具体细节中的一个或多个的情况下实施，或者与其他已知方法和形式组合实施。在其他情况下，没有特别详细地描述已知的方法和制备技术，以免不必要地模糊本发明。贯穿本说明书中，对“一个实施方式”或“一实施方式”的引用是指结合该实施方式描述的特定特征、形式、组成或特性包括在本发明的至少一个实施方式中。因此，贯穿本说明书在多处地方出现的短语“在一个实施方式中”或“一实施方式”不一定是指本发明的相同实施方式。另外，特定特征、形式、组成或特性可以在一个或多个实施方式中以任何合适的方式组合。除非说明书中另有规定，说明书中使用的所有科学和技术术语的含义与本发明所属
技术领域：
的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的一个实施方式中，肉毒杆菌毒素是由细菌肉毒杆菌(clostridiumbotulinum)产生的神经毒性蛋白。根据其形态和功能分组，梭菌属(clostridium)有超过127种。厌氧、革兰氏阳性细菌肉毒杆菌(clostridiumbotulinum)产生有效的多肽神经毒素，肉毒杆菌毒素，其在人和动物中引起一种被称为肉毒杆菌中毒的神经麻痹性疾病。肉毒杆菌的孢子存在于土壤中，可以生长在家用罐头的消毒和密封不当的食品容器中，这是造成许多肉毒杆菌中毒的原因。肉毒杆菌中毒的症状通常在食用被肉毒杆菌培养物或孢子感染的食品后18至36小时出现。肉毒杆菌毒素似乎能无衰减通过肠腔，对胆碱能运动神经元具有很高的亲和力。肉毒杆菌毒素中毒的症状可以包括行走困难、吞咽困难、说话困难发展到呼吸肌麻痹和死亡。a型肉毒杆菌毒素被认为是对人类最致命的天然生物剂。市售a型肉毒杆菌毒素(纯化的神经毒素复合物)的ld50(即1单位)为约50pg。有趣的是，以摩尔计，a型肉毒杆菌毒素的致死率约为白喉的18亿倍，比氰化钠的致死高约6亿倍，比眼镜蛇毒素致死高3000万倍，比霍乱致死高约1200万倍。将肉毒杆菌毒素的一个单位(u)定义为注射到雌性瑞士韦伯斯特(swisswebster)小鼠(每只体重18至20克)腹腔内的ld50。在免疫学上不同的7种肉毒杆菌神经毒素通常被表征为肉毒杆菌神经毒素血清型(serotypes)a、b、c1、d、e、f和g，每一种都是通过用特定类型的抗体中和来区分。肉毒杆菌毒素的不同血清型根据动物种类和诱发的瘫痪的严重程度和持续时间而异。例如，根据大鼠产生的瘫痪率测定，a型肉毒杆菌毒素的效价是b型肉毒杆菌毒素的500倍。此外，剂量为480u/kg(是a型肉毒杆菌毒素灵长类ld50的约12倍)的b型肉毒杆菌毒素在灵长类动物中被确定为无毒。与胆碱能运动神经元具有很高的亲和力的肉毒杆菌毒素转移进入神经元，阻断乙酰胆碱的释放。额外的摄取可以通过低亲和力受体以及吞噬作用和胞饮作用进行。无论血清型如何，毒素中毒的分子机制似乎是相似的，涉及至少3个步骤。在该过程的第一步中，毒素通过重链(h链或hc)与细胞表面受体之间的特异性相互作用与靶神经元的突触前膜结合。对于每种类型的肉毒杆菌毒素和破伤风毒素，受体被认为是不同的。hc的羧基末端区段似乎对肉毒杆菌毒素靶向于细胞表面很重要。在第二步中，肉毒杆菌毒素穿过靶细胞的质膜。肉毒杆菌毒素首先通过受体介导的内吞作用被细胞吞噬，形成含有肉毒杆菌毒素的内体。然后毒素从内体逃逸到细胞的细胞质中。这一步骤被认为是由重链的氨基末端部分，hn介导的，它在约5.5或更低的ph下触发毒素的构象变化。众所周知，内体具有一个质子泵，该质子泵降低了内体内的ph值。构象位移暴露了毒素中的疏水残基，从而使肉毒杆菌毒素嵌入内体膜中。然后肉毒杆菌毒素(或者至少是肉毒杆菌毒素的轻链)通过内体膜转移到细胞质中。肉毒杆菌毒素活性机制的最后一步似乎涉及到连接重链和轻链的二硫键的减少。肉毒杆菌毒素和破伤风毒素的全部毒性活性都包含在全毒素的轻链中；轻链是一种锌(zn++)肽链内切酶，它选择性地切割蛋白质，这些蛋白质对于识别和对接具有质膜细胞质表面的含神经递质的囊泡和以及囊泡与质膜融合所必需的。破伤风神经毒素、b、d、f和g型肉毒杆菌毒素可导致突触(小)泡蛋白(也称为囊泡相关膜蛋白(vamp)(一种突触体膜蛋白)的降解。存在于突触囊泡细胞质表面的大多数腺瘤都由于这些切割切作用中的任何一个而被移除。血清型a和e切割snap-25。血清型c1最初被认为是切割突触融合蛋白，但被发现是切割突触融合蛋白和snap-25。每一种肉毒杆菌毒素特定切割不同的键，除了b型(和破伤风毒素)切割相同的键。每一个切割都会阻碍囊泡膜对接的过程，从而阻止囊泡内容物的胞吐。肉毒杆菌毒素已用于临床中，用于治疗以过度活跃骨骼肌(即运动障碍)为特征的神经肌肉疾病。1989年，美国食品药品监督管理局批准了一种a型肉毒杆菌毒素复合物，用于治疗眼睑痉挛、斜视和面肌痉挛。随后，fda还批准了a型肉毒杆菌毒素用于治疗宫颈肌张力障碍和眉间皱纹(glabellarlines)，批准了b型肉毒杆菌毒素用于治疗宫颈肌张力障碍。与a型肉毒杆菌毒素相比，非a型肉毒杆菌毒素血清型似乎具有较低的效价和/或较短的活性持续时间。外周肌内注射a型肉毒杆菌毒素的临床效果通常在注射后一周内出现。单次a型肉毒杆菌毒素肌肉注射后症状缓解的典型持续时间平均约为3个月，尽管已经报道了明显更长时间的治疗活性。尽管所有肉毒杆菌毒素血清型都明显抑制神经肌肉连接处神经递质乙酰胆碱的释放，但它们通过影响不同的神经分泌蛋白和在不同的位置切割这些蛋白来实现。例如，a型和e型肉毒杆菌都能切割25kda突触体相关蛋白(snap-25)，但它们针对的是该蛋白内不同的氨基酸序列。b、d、f和g型肉毒杆菌毒素作用于囊泡相关膜蛋白(vamp，也称为小突触泡蛋白)，每种血清型在不同的位置切割蛋白质。最后，c1型肉毒杆菌毒素似乎能切割突触融合蛋白和snap-25。这些作用机制的差异可能影响各种肉毒杆菌毒素血清型的相对效价和/或作用持续时间。特别地，肉毒杆菌毒素的底物可以在多种不同的细胞类型中发现。对于所有七种已知的肉毒杆菌毒素血清型，肉毒杆菌毒素的分子量约为150kda。有趣的是，肉毒杆菌毒素由梭菌属(clostridial)细菌释放，作为包含150kda肉毒杆菌毒素蛋白质分子和相关非毒素蛋白质的复合物。因此，a型肉毒杆菌毒素复合物可以由梭菌属细菌产生900kda、500kda或300kda形式。b型和c1型肉毒杆菌毒素显然仅以700kda或500kda复合物产生。d型肉毒杆菌毒素以300kda或500kda复合物产生。最后，e型和f型肉毒杆菌毒素仅以300kda复合物产生。复合物(即分子量大于约150kda)被认为含有非毒血凝素蛋白质，非毒素和无毒性的非血凝素蛋白质。这两种非毒性蛋白(其与肉毒杆菌毒素分子一起构成相关的神经毒素复合物)可起到防止肉毒杆菌毒素分子变性稳定作用，并在肉毒杆菌毒素被摄入时防止消化酸。另外，较大的(大于约150kda分子量)肉毒杆菌毒素复合物可能导致在远离肌内注射肉毒杆菌毒素复合物的部位肉毒杆菌毒素的扩散速度较慢。体外研究表明，肉毒杆菌毒素抑制钾离子诱导的乙酰胆碱和去甲肾上腺素从脑干组织的原代细胞培养物中释放。此外，据报道，肉毒杆菌毒素抑制脊髓神经元原代培养物中甘氨酸和谷氨酸的诱发释放，而在脑突触体制剂中，肉毒杆菌毒素抑制每种神经递质乙酰胆碱、多巴胺、去甲肾上腺素、cgrp、p物质和谷氨酸的释放。因此，当使用足够浓度时，大多数神经递质的刺激诱发释放可被肉毒杆菌毒素阻断。a型肉毒杆菌毒素可以通过在发酵罐中接种和培养肉毒杆菌培养物后根据已知方法获得和纯化发酵混合物来获得。所有肉毒杆菌毒素血清型最初都被合成为非活性单链蛋白，其必须经蛋白酶切割或剪切后变成神经活性的。制备肉毒杆菌毒素血清型a和g的细菌菌株具有内源性蛋白酶，因此，血清型a和g可以从细菌培养物中主要以活性形式回收。相比之下，肉毒杆菌毒素血清型c1、d和e是由非蛋白水解酶菌株合成的，因此通常在从培养物中回收时失活。血清型b和f由蛋白水解酶和非蛋白水解酶菌株产生，因此可以以活性或非活性形式回收。然而，即使是产生例如血清型b型肉毒杆菌毒素的蛋白水解酶菌株，也只能切割一部分产生的毒素。切割与未切割分子的确切比例取决于培养时间和培养温度。因此，例如b型肉毒杆菌毒素的任何制剂中，有一定比例的制剂可能是非活性的，这可能是b型肉毒杆菌毒素与a型肉毒杆菌毒素相比，已知效价明显较低的原因。临床制剂中存在非活性肉毒杆菌毒素分子将有助于该制剂的总蛋白负载，这与抗原性提高有关，但不影响其临床疗效。此外，众所周知，b型肉毒杆菌毒素肌肉注射后的活性持续时间较短，在相同剂量水平下的功效价也低于a型肉毒杆菌毒素。高质量的结晶a型肉毒杆菌毒素可由霍尔a型肉毒杆菌菌株(hallastrainofclostridiumbotulinum)产生，其特征为≥3×107u/mg，a260/a278小于0.60，凝胶电泳条带明显。已知的schantz方法可用于获得结晶a型肉毒杆菌毒素。通常，a型肉毒杆菌毒素复合物可通过在合适的培养基中培养a型肉毒杆菌而从厌氧发酵中分离和纯化。在分离出无毒蛋白质后，也可以使用已知方法获得纯肉毒杆菌毒素，例如：纯化的a型肉毒杆菌毒素，分子量约150kda，具体效价为1-2×108ld50u/mg或更高；纯化的b型肉毒杆菌毒素的分子量约156kda，具体效价为1-2×108ld50u/mg或更高；纯化的f型肉毒杆菌毒素的分子量约为155kd，具体效价为1-2×107ld50u/mg或更高。肉毒杆菌毒素和/或肉毒杆菌毒素复合物可从本领域已知的化合物制造商商购获得，纯肉毒杆菌毒素也可用于制备药物组合物。通常与酶一样，肉毒杆菌毒素(其为细胞内肽酶)的生物活性至少部分依赖于其三维构象。因此，a型肉毒杆菌毒素通过加热、各种化学物质表面拉伸和表面干燥来解毒。此外，众所周知，将通过已知培养、发酵和纯化获得的肉毒杆菌毒素复合物稀释到用于药物组合物制剂的极低毒素浓度，会导致毒素快速解毒，除非存在合适的稳定剂。将毒素从毫克量稀释到每毫升含有纳克的溶液存在着很大的困难，这是由于在如此大的稀释作用下，特异性毒性迅速丧失。由于肉毒杆菌毒素可在含有毒素的药物组合物配制后数月或数年内使用，应使用合适的稳定剂稳定毒素。因此，如本发明所公开的，开发最佳稳定剂技术对于控制肉毒杆菌毒素在体内缓慢释放是必要的。据报道，a型肉毒杆菌毒素已在临床环境中使用如下：体内单剂量施用肌肉注射肉毒杆菌毒素的持续时间通常约为3至4个月。然而，在某些情况下，a亚型肉毒杆菌毒素的有效期可以长达12个月(欧洲神经病学杂志6(europeanj.neurology6)(增刊4)：s111-s1150:1999)，在某些情况下，当用于治疗腺体时，如用于治疗多汗症时，有效期可达27个月。肉毒杆菌毒素除了在周边部位具有药理作用外，还可能对中枢神经系统具有抑制作用。weigand等人的工作，n-sarch药理学(nauny-schmiedeberarchpharmacol).1976；292,161-165和habermann,n-sarch药理学(habermann,nauny-schmiedebergarchpharmacol).1974；281,47-56表明肉毒杆菌毒素可以通过逆行运输上升到脊髓区域。因此，在周围部位注射(例如肌内注射)的肉毒杆菌毒素可以逆行运输到脊髓。肉毒杆菌毒素也已被提出或已被用于治疗皮肤骨骼和肌腱损伤(美国专利号6,447,787)、鞘内疼痛(见美国专利号6,113,915)、各种自主神经疾病，包括汗腺疾病(见美国专利号5.766.605和高曼(goldman)(2000)、美容整形手术(aestheticplasticsurgery)7-8月，24(4)：280-282)、紧张性头痛(美国专利号6,458,365)、偏头痛(美国专利号5,714,468)、术后疼痛和内脏疼痛(美国专利号6,464,986)、毛发生长和毛发保留(美国专利号6,299,893)、银屑病和皮炎(美国专利号5,670,484)、肌肉损伤(美国专利号6,423,319)、各种癌症(美国专利号6,139,845和6,063,768)，平滑肌疾病(美国专利号5,437,291)、神经压迫综合征(美国专利申请号2003-0224019)、痤疮(wo03/011333)、神经源性炎症(美国专利号6,063,768)、视神经疾病(见美国专利号6,265,379)、胰腺疾病(见美国专利号6,143,306和6,261,572)、前列腺疾病，包括前列腺增生、前列腺癌和尿失禁(见美国专利号6,365,164和6,667,041和doggweilerr.等人，a型肉毒杆菌毒素引起大鼠前列腺弥漫性和高度选择性萎缩(acausesdiffuseandhighlyselectiveatrophyofratprostate)，神经性尿路痛(neurourolurodyn)199817(4):363)、纤维肌痛(美国专利号6,623,742)和梨状肌综合征(见childers等人.(2002年)，美国物理医学与康复杂志(americanjournalofphysicalmedicine&rehabilitation,)，81:751-759)。美国专利号5,989,545公开经修饰的梭菌神经毒素或其片段，优选与特定靶向部分化学结合或重组融合的肉毒杆菌毒素，可通过将药剂给予脊髓来用于治疗疼痛。此外，已公开靶向肉毒杆菌毒素(即具有非天然结合部分)可用于治疗各种病症(参见wo96/33273、wo99/17806、wo98/07864、wo00/57897、wo01/21213、wo00/10598)。此外，将肉毒杆菌毒素注入胸肌以控制胸痉挛(西尼尔m.(seniorm.,肉毒杆菌毒素和子宫颈植入术后胸痉挛的处理(botoxandthemanagementofpectoralspasmaftersubpectoralimplantinsertion)，整形与再造外科杂志(plasticandreconsurg)，2000年7月，224-225)。控制释放的毒素植入物是已知的(参见美国专利号6,306,423和6,312,708)，其为透皮肉毒杆菌毒素给药(美国专利申请序列号10/194,805)。众所周知，肉毒杆菌毒素可用于：减弱口腔的咀嚼或咬合肌肉，从而使自身导致的伤口和由此产生的溃疡得以愈合(paynem.，等.肉毒杆菌毒素治疗莱施-尼汉综合征自残的新方法(botulinumtoxinasanoveltreatmentforselfmutilationinlesch-nyhansyndrome)，神经病学史(annneurol)2002年9月；52(3增刊1)：s157)；允许良性囊性病变或肿瘤愈合(blugermang.，等,多发性汗腺囊肿：肉毒杆菌毒素治疗的新选择(multipleeccrinehidrocystomas：anewtherapeuticoptionwithbotulinumtoxin)，皮肤外科(dermatolsurg)2003年5月；29(5)：557-9)；治疗肛裂(jostw.，肛裂肉毒杆菌毒素治疗十年经验(tenyears'experiencewithbotulinumtoxininanalfissure),国际结直肠病杂志(intjcolorectaldis)2002年9月；17(5)：298-302)；治疗某些类型的特应性皮炎(heckmannm.，等，a型肉毒杆菌毒素注射治疗单纯苔藓:开放的试点研究(botulinumtoxintypeainjectioninthetreatmentoflichensimplex：anopenpilotstudy)，皮肤病学杂志(jamacaddermatol，2002年4月；46(4)：617-9)。此外，在大鼠福尔马林模型中，肉毒杆菌毒素可能具有减轻诱导的炎症性疼痛的作用(aokik.等人，皮下肉毒杆菌的镇痛效应的作用机制：周围和中央疼痛过程的抑制(mechanismsoftheantinociceptiveeffectofsubcutaneousbotox:inhibitionofperipheralandcentralnociceptiveprocessing)，头痛(cephalalgia)，2003年9月；23(7)：649)。此外，据报道肉毒杆菌毒素神经阻塞可导致表皮厚度减少(liy等人，感官和运动去神经影响大鼠足无毛皮肤的表皮厚度(sensoryandmotordenervationinfluencesepidermalthicknessinratfootglabrousskin)，神经肽(expneurol)1997；147:452-462)。最后，已知对脚施用肉毒杆菌毒素以治疗过度的足部出汗(katsambasa.等人，足部皮肤病：未经批准的治疗(cutaneousdiseasesofthefoot:unapprovedtreatments,)，临床皮肤病(clindermatol)，2002年11-12月；20(6)：689-699；sevim，s.等人，肉毒杆菌毒素-掌跖多汗症的治疗(botulinumtoxin-atherapyforpalmarandplantarhyperhidrosis)，比利时神经病学学报(actaneurolbelg)，2002年12月；102(4)：167-70)，痉挛性脚趾(suputtitada，a.，a型肉毒杆菌毒素局部注射治疗痉挛性脚趾(localbotulinumtoxintypeainjectionsinthetreatmentofspastictoes)，美国医学杂志(amjphysmedrehabil)2002年10月；81(10)：770-5)，特发性脚趾行走(tacks，l.，等，特发性脚趾行走：肉毒杆菌毒素a注射治疗(idiopathictoewalking:treatmentwithbotulinumtoxinainjection)，发展医学与儿童神经学(devmedchildneurol2002；44(增刊91)：6)和足部张力障碍(rogersj.，等，肉毒杆菌毒素a注射治疗足肌张力障碍(injectionsofbotulinumtoxinainfootdystonia)，神经病学(neurology)，1993年4月；43(4增刊2))。破伤风毒素及其衍生物(即具有非天然靶向部分)、片段、杂交体和其嵌合体也可具有治疗用途。破伤风毒素与肉毒杆菌毒素具有许多相似之处。因此，破伤风毒素和肉毒杆菌毒素都是由紧密相关的梭状芽孢杆菌(clostridium)(分别是破伤风梭菌(clostridiumtetani)和肉毒杆菌(clostridiumbotulinum))制成的多肽。此外，破伤风毒素和肉毒杆菌毒素都是由轻链(分子量约50kda)通过一个二硫键共价结合到重链(分子量约100kda)组成的双链蛋白。因此，破伤风毒素和7种肉毒杆菌毒素(未复合)每一种的分子量约为150kda。此外，对于破伤风毒素和肉毒杆菌毒素，轻链均具有显示细胞内生物(蛋白酶)活性的结构域，而重链则包含受体结合(免疫原性)和细胞膜易位结构域。此外，破伤风毒素和肉毒杆菌毒素对突触前胆碱能神经元表面的神经节苷脂受体表现出高度的特异性亲和力。在外周胆碱能神经元中受体介导的破伤风毒素内吞作用导致逆向轴突转运，阻止中枢突触释放抑制性神经递质，并导致痉挛性麻痹。相反，认为在外周胆碱能神经元中受体介导的肉毒杆菌毒素内吞作用几乎不会导致逆向转运、抑制中枢突触的乙酰胆碱胞吐作用和松弛性麻痹。然而，最近的报告表明，肉毒杆菌毒素也可以沿轴突逆向转运，并可能抑制中枢突触中乙酰胆碱的释放(bombawarczak等人，破伤风毒素和肉毒杆菌神经毒素a和d在中枢神经元中的神经元间转移和远端作用(interneuronaltransferanddistalactionoftetanustoxinandbotulinumneurotoxinsaanddincentralneurons)，细胞评论(cellreports)，2016年8月:16,1974—1987)。最后，破伤风毒素和肉毒杆菌毒素在生物合成和分子结构上彼此相似。因此，破伤风毒素与a型肉毒杆菌毒素的蛋白质序列总体一致性为34％，某些功能域的序列一致性高达62％(binzt.等人，a型肉毒杆菌神经毒素的完整序列及与其他梭菌神经毒素的比较(thecompletesequenceofbotulinumneurotoxintypeaandcomparisonwithotherclostridialneurotoxins)，生物化学(jbiologicalchemistry)265(16):9153-9158:1990)。在本发明的一个实施方式中，“乙酰胆碱”是胆碱和乙酸的酯，是第一种已知的神经递质。乙酰胆碱分布于神经元，化学式为c7h16no2，分子量为146.21kda。通常，哺乳动物神经系统中的每种神经元只释放一种小分子神经递质，尽管有证据表明相同神经元可以释放几种神经调节剂。神经递质乙酰胆碱由大脑许多区域的神经元分泌，特别是由运动皮层的大锥体细胞、基底神经节中的几种不同的神经元、支配骨骼肌的运动神经元、自主神经系统的节前神经元(交感神经和副交感神经)，肌梭状纤维的袋1纤维，副交感神经系统的节后神经元和一些交感神经系统的神经节后神经元分泌。基本上，只有到汗腺、毛肌和少数血管的神经节后交感神经纤维是胆碱能的，因为交感神经系统的大多数神经节后神经元分泌神经递质去甲肾上腺素。在大多数情况下，乙酰胆碱具有兴奋作用。然而，众所周知乙酰胆碱在一些外周副交感神经末梢具有抑制作用(例如，通过迷走神经抑制心率)。自主神经系统的传出信号通过交感神经系统或副交感神经系统传递给身体。交感神经系统的神经节前神经元从位于脊髓中间外侧角的神经节前交感神经元细胞体延伸。从细胞体延伸的神经节前交感神经纤维与位于椎旁交感神经节或椎前神经节中的神经节后神经元突触。由于交感神经系统和副交感神经系统的神经节前神经元都是胆碱能的，因此将乙酰胆碱应用于神经节将激发交感神经和副交感神经节后神经元。乙酰胆碱激活两种受体，毒蕈碱受体和烟碱受体。毒蕈碱受体存在于由副交感神经系统的神经节后神经元刺激的所有效应细胞中以及由交感神经系统的神经节后胆碱能神经元刺激的那些细胞中。烟碱受体存在于肾上腺髓质和自主神经节内，即位于交感神经和副交感神经系统的神经节前和神经节后神经元之间的突触处的神经节后神经元的细胞表面上。烟碱受体也存在于许多自主神经末梢中，例如在神经肌肉接头处的骨骼肌纤维膜中。当小而透明的细胞内囊泡与突触前神经元细胞膜融合时，乙酰胆碱从胆碱能神经元释放。各种非神经元分泌细胞，如肾上腺髓质(以及pc12细胞系)和胰岛细胞分别从大而密的核心囊泡中释放儿茶酚胺和甲状旁腺激素。pc12细胞系是大鼠嗜铬细胞瘤细胞的克隆，广泛用作研究交感肾上腺发育症状的组织培养模型。当失神经的细胞被渗透(如电穿孔)或直接注射毒素时，肉毒杆菌毒素抑制两种类型的化合物在体外从两种类型的细胞释放。肉毒杆菌毒素也被认为能阻止神经递质谷氨酸从皮质突触体细胞培养中释放。在骨骼肌中，轴突靠近肌肉细胞形成神经肌肉连接。通过神经系统传输的信号在末端轴突处产生动作电位，激活离子通道并导致神经递质乙酰胆碱从神经细胞内突触小泡释放，例如在神经肌肉接头的运动终板处。乙酰胆碱穿过细胞外间隙，与肌肉终板表面的乙酰胆碱受体蛋白结合。一旦发生足够的结合，肌肉细胞的动作电位引起特定的膜离子通道改变，导致肌肉细胞收缩。乙酰胆碱随后从肌肉细胞释放，并在细胞外空间被胆碱酯酶代谢。代谢物被循环回末端轴突，再进一步加工成乙酰胆碱。在本发明的一个实施方案中，术语“稳定剂”或“稳定剂”是指为增加活性成分的稳定性而加入的任何添加剂，并防止活性成分被氧化，结晶，稳定剂没有特别限制，只要是药学上可接受的。可以在不限制温度的情况下对稳定剂的稳定作用进行评估，但应当理解的是，稳定作用在较低温度下通常比在高温下保持较长时间。因此，可以用在高温下短时间进行的“加速试验”来代替低温下长期稳定作用的评价。例如，特定稳定剂在37℃下9天的稳定作用的评价结果与在4℃下3个月的稳定作用相同，特定稳定剂在37℃下74天的稳定作用的评价结果与在24℃下24个月的稳定作用相同(http://iso-inc.com/medical-package-testing/accelerated-aging.html)。在本发明中，添加稳定剂以保持或维持包含肉毒杆菌毒素的梭状芽孢杆菌型神经毒素蛋白的生物活性，并且优选地选自精氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、葡萄糖酸内酯、酒石酸或硫代硫酸钠，并且更优选精氨酸、天冬氨酸或谷氨酸，但不限于此。在本发明的一个实施方式中，术语“稳定缓冲剂”或“稳定缓冲剂”是指稳定剂和缓冲效果。它可以通过向普通缓冲液中添加具有稳定作用的物质来制备，可以预期包括其它稳定剂在内的稳定协同作用。在本发明中，稳定缓冲剂优选为葡萄糖酸内酯(gluconolactone)缓冲剂或酒石酸缓冲剂，但不限于此。在本发明的一个实施方式中，“精氨酸”是一种碱性氨基酸，分子式为c6h14n4o2，分子量为174.21，为水溶性。残基缩写为“arg”，用单个字母“r”表示。由m.j.s.schulze和e.steiger首次从羽扇豆(一种豆类)幼苗中分离得到。精氨酸之所以被命名是因为它的硝酸盐是银色的。l-精氨酸是构成蛋白质的一种氨基酸，存在于鱼类精子中的蛋白质鱼精蛋白中。鲱鱼和鲑鱼中大约70％的组成氨基酸是精氨酸。在植物种子中，精氨酸以游离状态存在。精氨酸残基由于其胍基而具有强碱性。因它与α-萘酚和碱性次氯酸盐反应时呈现出独特的红色，可以被定量。体内代谢途径中，精氨酸是h.a.krebs等人发现的鸟氨酸途径的一个组成部分，通过精氨酸酶的作用裂解成尿素和鸟氨酸。精氨酸由瓜氨酸和天冬酰胺酸产生。在成人中是一种非必需氨基酸，但在婴儿中是一种必需氨基酸。它可以防止氨或大量氨基酸的毒性。精氨酸酶存在于脑中并控制作为γ-胍基丁酸前体的精氨酸的量。在无脊椎动物中，以精氨酸磷酸盐形式存在的精氨酸在与磷酸肌酸肌肉收缩中起着重要作用，并且作为一种特定的胍基(马格马汀(magmatin)、真蛸碱(octopine))前体广泛存在。在本发明的一个实施方式中，“谷氨酸”是一种氨基酸，也被称为“谷氨酸”，由残基“glu”或“e”表示，分子式为c5h9no4。在小麦面筋蛋白水解物中首次发现。它是最丰富的蛋白质氨基酸之一，尤其是在小麦麸朊中，含有43.7％的蛋白质。用饱和氯化氢从小麦、大豆等蛋白质水解液中分离盐酸盐是可行的。在本发明的一个实施方式中，“天冬氨酸”是一种氨基酸，也被称为“天冬氨酸”，由残基“asp”或“d”表示，分子式为c4h7no4。它是构成蛋白质的氨基酸之一。它是一种分子中有两个羧基(cooh)的酸性氨基酸，天然被归类为非必需氨基酸。与谷氨酰胺一样，已知它在体内氨基酸的转氨化中起着核心作用。在本发明的一个实施方式中，“葡萄糖酸内酯”是指没有或很少气味的白色晶体或结晶粉末，开始表现出甜味，随后表现出轻微的酸味，分子式为c6h10o6。它是一种合成烘焙剂，易溶于水，微溶于乙醇，但不溶于乙醚。水溶液缓慢水解，在葡萄糖酸、δ-内酯和γ-内酯之间形成平衡状态，温度和ph越高，水解速度越快。在25℃室温下约2小时后，完全水解成55-60％葡萄糖酸和40-50％内酯的溶液。虽然葡萄糖酸-δ-内酯不是酸，但它被水解溶解在水中呈现酸性。因此，最好将其用作膨胀剂的酸度调节剂，即使与碳酸氢钠(碳酸氢钠)混合，也不会发生反应。此外，由于水解反应缓慢，当用作膨胀剂的酸度调节剂时，它可以与碳酸氢钠反应，使产品具有非常精细的质地。此外，它还具有抗氧化能力，因为它与金属形成复合物。虽然它不是酸，但它用于降低软化产品的ph值，因为水溶液通过加热显示酸性。在本发明的一个实施方式中，“酒石酸”是通过向锡中添加碳酸钙形成的沉淀处理硫酸而得到的有机化合物。它也被称为二恶英琥珀酸，因为它包含在酿酒时沉淀的锡中。由化学式c4h6o6表示。存在右旋l-酒石酸、左旋l-d酒石酸、外消旋酒石酸(又称葡萄酸)，无光学活性的m-酒石酸等异构体。当天然存在时，以l-酒石酸为主，以游离酸、钙盐和钾盐的形式广泛分布于植物系统中。在本发明的一个实施方式中，术语“药物组合物”是指为特定目的施用的组合物。就本发明而言，本发明的药物组合物是包含精氨酸、谷氨酸或天冬氨酸作为稳定剂的肉毒杆菌毒素组合物，或包含葡萄糖酸内酯缓冲剂或酒石酸缓冲剂作为稳定缓冲剂的肉毒杆菌毒素组合物，并且可以包含与给药相关的蛋白质和药学上的可接受的载体、赋形剂或稀释剂。术语“药学上可接受的”载剂或赋形剂是指经政府监管机构批准或列入药典或其他公认的用于哺乳动物的药典，尤其是人类的药典。对于肠胃外给药，本发明药物组合物可以是油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液形式，且可以以固体或半固体的形式制备。更优选地，它可以是液体形式。此外，本发明的药物组合物可含有如悬浮剂、稳定剂、增溶剂和/或分散剂等配方剂，并且可灭菌。所述药物组合物在制造和储存条件下稳定，并且能够防止例如细菌或真菌等微生物的污染。或者，本发明包含精氨酸作为稳定剂的肉毒杆菌毒素组合物可以是无菌粉末形式，在使用前使用合适的载体进行重构。所述药物组合物可以单位剂量形式、微针贴片、在安瓿或其他单位剂量容器或多剂量容器内存在。或者，所述药物组合物可以储存在冷冻干燥(冻干)条件下，仅需要在使用前立即添加无菌液体载体，例如注射用水。临时注射溶液和悬浮液可由无菌粉末、颗粒或片剂制备。在一些非限制性实施方式中，本发明的含有精氨酸作为稳定剂的肉毒杆菌毒素组合物可配制为液体，或以微球形式存在于液体中。在任何非限制性实施方式中，含有精氨酸作为稳定剂的肉毒杆菌毒素组合物可含有浓度为0.001-100000u/kg的肉毒杆菌毒素或药学上可接受的化合物和/或其混合物。在任何非限制性实施方式中，适用于含有精氨酸作为稳定剂的肉毒杆菌毒素组合物的赋形剂包括防腐剂、悬浮剂、稳定剂、染料、缓冲剂、抗菌剂、抗真菌剂、等渗剂(例如糖或氯化钠)和其他添加剂。如本文所用，术语“其它稳定剂”是指除本发明的稳定剂(精氨酸、谷氨酸或天冬氨酸)或稳定缓冲剂(葡萄糖酸内酯缓冲剂或酒石酸缓冲剂)外的另外包含的稳定剂。只要所属领域内普遍已知，“其它稳定剂”可以没有限制地获得。此外，本发明的药物组合物可以包含一个或多个药学上可接受的载体。载体可以是溶剂或分散介质。药学上可接受的载体的非限制性实例包括水、盐水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇及液态聚乙二醇)、油及其合适混合物。应用于本发明药物组合物的灭菌技术的非限制性示例包括通过细菌保留过滤器过滤、终端灭菌、加入灭菌剂、照射、无菌气体辐照、加热、真空干燥和冷冻干燥。在本发明的一个实施方式中，术语“给药”意指通过任何适宜方法将本发明的组合物引入患者。本发明的组合物可以通过任何通常途径给药，只要它可以到达靶组织即可。本发明的组合物可经口服、腹膜内、静脉内、肌内、皮下、皮内、鼻内、肺内、直肠内或鞘内给药。然而，本发明的肉毒杆菌毒素组合物最优地作为液体制剂通过肌内注射给药，但不限于此。本发明的治疗方法可以包括施用药学有效量的药物组合物。在本发明中，有效量可以根据不同的因素而变化，包括疾病的种类、疾病的严重程度、组合物中所含的活性成分和其他成分的种类和含量、配方的种类、患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食、给药时间，给药途径，组合物的分泌速率，治疗时间和同时使用的药物。在本发明的一个实施方式中，提供了一种含有神经毒素和稳定剂的药物制剂。在药物组合物中，神经毒素可以为肉毒杆菌毒素、破伤风毒素、霍乱毒素和百日咳毒素中的任何一种或多种。肉毒杆菌毒素可选自下组：a型、b型、c型、d型、e型、f型和g型肉毒杆菌毒素。肉毒杆菌毒素优选为a型肉毒杆菌毒素。此外，肉毒杆菌毒素可为不含复合蛋白的形式或含有复合蛋白的复合形式。在所述药物制剂中，所述稳定剂为选自精氨酸、谷氨酸和天冬氨酸的任何一种或多种，并且所述稳定剂以稳定缓冲剂的形式提供，其中所述稳定缓冲剂为选自葡萄糖酸内酯缓冲剂和酒石酸缓冲剂的任何一种或多种。此外，稳定剂的浓度为每100单位肉毒杆菌毒素0.01-1000mm。药物制剂的ph值可为5.5-7.0。此外，药物制剂还可含有局部麻醉剂。在药物制剂中，局部麻醉剂可以是利多卡因，并且基于药物制剂的总重量计，其含量可以为0.1-1wt％。此外，所述药物制剂还可含有聚山梨醇酯。此外，所述药物制剂可以是液体。在本发明的另一实施方式中，提供了一种制备药物制剂的方法，其包括以下步骤：(a)纯化神经毒素；和(b)向神经毒素中添加稳定剂。在所述方法中，神经毒素优选为a型肉毒杆菌毒素。在所述方法中，所述稳定剂为选自精氨酸、谷氨酸和天冬氨酸的任何一种或多种，并且所述稳定剂以稳定缓冲剂的形式提供，其中所述稳定缓冲剂是选自葡萄糖酸内酯缓冲剂和酒石酸缓冲剂的任何一种或多种。此外，所述药物制剂可以是液体。下文将详细描述本发明的每一步骤。有利效果肉毒杆菌毒素在具有神经功能的动物神经肌肉接点的胆碱能突触前抑制乙酰胆碱的胞吐，从而导致虚弱。肉毒杆菌毒素由于具有神经毒性作用，对各种疾病有很强的治疗作用，但由于其强毒性，即使是极少量的肉毒杆菌也能致死。因此，当肉毒杆菌毒素用于活体时，必须对肉毒杆菌毒素的浓度进行精细控制。然而，现有的含有肉毒杆菌毒素的药物组合物存在与蛋白质变性有关的问题。由于这些问题，目前的药物组合物是以冻干制剂的形式制备和分发的，并在临床应用前由使用者立即用液体盐水稀释。因此，就目前的药物组合物而言，存在一个问题，即由人为错误(如稀释因子错误或稀释盐水污染)引起的医疗事故风险高。本发明包含肉毒杆菌毒素的药物组合物可以含有精氨酸、谷氨酸或天冬氨酸作为稳定剂，或者可以含有葡萄糖酸内酯缓冲剂或酒石酸缓冲剂作为肉毒杆菌毒素的稳定缓冲剂。本发明的组合物对肉毒杆菌毒素的稳定性具有显著的影响，即使是以液体制剂形式分发。因此，期望本发明的组合物对肉毒杆菌毒素的安全、方便的医疗使用有很大的帮助。附图说明图1显示肉毒杆菌毒素与精氨酸或甲硫氨酸一起温育28-56天后测量肉毒杆菌毒素的剩余效价的结果。图2显示含有精氨酸或甲硫氨酸的肉毒杆菌毒素组合物在ph6.0-7.0下温育56天后测定肉毒杆菌毒素剩余效价的结果。详细地，图2a中的ph值为6.0，图2b中的ph值为6.5，图2c中的ph7.0。图3显示在含有各种抗氧化剂的肉毒杆菌毒素组合物温育28天后测定肉毒杆菌毒素剩余效价的结果。图4显示含有各种缓冲剂的肉毒杆菌毒素组合物温育28天后测定肉毒杆菌毒素剩余效价的结果。图5显示本发明一个实施例中的用于测定肉毒杆菌毒素效价的descr测定的每个步骤。图6显示比较精氨酸和甲硫氨酸对本发明的一个实施例的液体肉毒杆菌制剂的稳定化的影响结果。具体而言，图6a显示对不含局部麻醉剂的制剂的比较结果。图6b显示对含有局部麻醉剂(0.3％利多卡因)的制剂的比较结果。图7显示评价液体制剂容器的材料对bont/a功效稳定化的影响结果。具体而言，图7a显示对不含局部麻醉剂的制剂的评价结果。图7b显示对含有局部麻醉剂(0.3％利多卡因)的制剂的评价结果。图8显示根据本发明一个实施例通过使用玻璃容器比较精氨酸对含有酒石酸或葡糖糖酸内酯作为缓冲剂的制剂的稳定作用的结果。具体而言，图8a显示对不含局部麻醉剂的制剂的比较结果。图8b显示对含有局部麻醉剂(0.3％利多卡因)的制剂的比较结果。图9显示根据本发明的一个实施例除了酒石酸或葡糖糖酸内酯缓冲剂之外，评价精氨酸作为稳定剂对含有谷氨酸的制剂的影响的结果。具体而言，图9a显示对不含局部麻醉剂的制剂的评价结果。图9b显示对含有局部麻醉剂(0.3％利多卡因)的制剂的评价结果。图10显示根据本发明的一个实施例谷氨酸最佳浓度的评价结果，所述谷氨酸的最佳浓度有助于精氨酸对含有葡萄糖内酯作为缓冲剂的制剂的稳定作用。具体而言，图10a显示对不含局部麻醉剂的制剂的评价结果。图10b显示对含有局部麻醉剂(0.3％利多卡因)的制剂的评价结果。图11显示根据本发明的一个实施例评价天冬氨酸对精氨酸的bont/a稳定功效的影响结果。具体而言，图11a显对不含局部麻醉剂的制剂的评价结果。图11b显示对含有局部麻醉剂(0.3％利多卡因)的制剂评价结果。图12显示根据本发明的一个实施例，比较当将精氨酸或甲硫氨酸加入到产品中时由具有新组合物的液体制剂制备的bont/a产品的稳定性结果。本发明最佳方案本发明的实验结果表明，精氨酸和甲硫氨酸对肉毒杆菌毒素的稳定作用具有ph依赖性。基于这些结果，将液体bont/a制剂的ph值设置为6.0，并将液体bont/a制剂中的精氨酸浓度改变为不同的浓度。将bont/a添加到制剂中，初始效价为80单位/毫升(units/ml)，然后制剂在37℃下温育8周，通过descr法测定bont/a的效价。结果表明，不含稳定剂的对照组2周后bont/a的剩余效价为10％，含50mm甲硫氨酸的实验组2周、4周和8周后的剩余效价分别为67％、47％和27％。这表明甲硫氨酸具有显著的稳定作用。同时，精氨酸在50-100mm浓度下比甲硫氨酸具有更强的稳定作用，而8周后含有甲硫氨酸制剂中的bont/a的剩余效价仍为31-65％。具体实施方式在下文中，将参考实施例进一步详细描述本发明。对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施例仅用于说明目的，并不意图限制本发明的范围。本发明实施例中使用的所有试剂的来源列于下列(*)中。*葡萄糖酸内酯(西格玛(sigma)g2164)；l(+)-酒石酸(默克(merck)100804)；利多卡因盐酸盐一水合物(西格玛l5647)；辛酸(西格玛c2875)；l-甲硫氨酸(默克k45023607414)；l-精氨酸(默克k45895542534)；甘氨酸(bioshopgln001-1)；l-谷氨酸(默克100291)；天冬氨酸(默克k45895542534)；马来酸(默克s6858580534)；丁基羟基茴香醚(西格玛slbm1210v)；没食子酸丙酯(西格玛p3130)；亚硫酸氢钠(西格玛mkbr6468v)；巯基乙酸(西格玛t3758)；l-半胱氨酸盐酸盐(k46446495513)；琥珀酸(默克k46618782533)；磷酸二氢钠(西格玛s5011)；磷酸氢二钠(西格玛s7907)；氯化钠(默克k47013904548)；聚山梨醇酯(西格玛p7949)；和dl-二硫苏糖醇(西格玛d0632)。本发明实施例使用的缓冲剂的缩写和组成列于下列(**)中。**l-甲硫氨酸(met或“m”)，l-精氨酸(arg或“r”)，l-谷氨酸(glu或“e”)，天冬氨酸(asp或“d”)，缓冲剂p(10mmnapo4，ph6.0，45mmnacl和0.05％聚山梨醇酯)，缓冲剂g(10mm葡糖糖酸内酯，ph6.0，45mmnacl和0.05％聚山梨醇酯)，缓冲剂r(添加有50mm精氨酸的缓冲剂g)。实施例1：利用博斯特(botest)开发肉毒杆菌毒素稳定剂实施例1-1：实验准备本发明使用的肉毒杆菌毒素是由胡格尔生物有限公司(hugelpharmaco.，ltd)(韩国)生产并且调节至浓度为0.1mg/ml和效价为1,529单位/微升(units/μl)(基于博斯特(botest))。在用于鉴定具有稳定作用的添加剂的所有实验中，在用具有组合物(50mmnapo4，ph7.0，1mmdtt，0.05wt％聚山梨醇酯和20wt％甘油)的“蛋白质稀释缓冲剂”将其稀释至50单位/微升(units/μl)后使用肉毒杆菌毒素。为了鉴定具有稳定作用的添加剂候选物，通过在“稳定液体组合物(10mmnapo4(ph5.5-7.0)，0.01wt％聚山梨醇酯，130mmnacl)中稀释200单位肉毒杆菌毒素和稳定剂添加剂候选物来制备每个实验组(100μl)。然后，将每个实验组在37℃的温度下培养1-11周，并将其一部分(25％)用于其剩余效价的测定。使用肉毒杆菌神经毒素检测试剂盒(botulinumneurotoxindetectionkit)(比森特(biosentinel)，usa)测量肉毒杆菌毒素的效价。为此，将5mmhepes-naoh(ph7.1)、0.1wt％聚山梨醇酯、10μmzncl2(西格玛229997)、0.2μm博斯特(botest)/e报道分子和25μl稳定化实验组彼此混合以制备最终反应溶液(100μl)，将反应溶液在37℃下保温21小时。使用协同神经2多模式阅读器(synergyneo2multi-modereader)(生物科技(biotek)，美国)测定温育的反应溶液的cfp/fret比率，并应用于标准曲线，从而确定肉毒杆菌毒素的剩余效价。此外，将用于研究本发明的肉毒杆菌毒素稳定化所使用的所有试剂溶解在三蒸水中，加入盐酸和氢氧化钠调节ph至5.5-7.0。实施例1-2：不同ph值下精氨酸或甲硫氨酸稳定作用的比较研究比较在ph5.5～7.0下精氨酸和甲硫氨酸作为稳定剂对肉毒杆菌毒素稳定性的影响。为此，将肉毒杆菌毒素添加到实施例1所述的稳定液体组合物中，并将50mm精氨酸或甲硫氨酸也添加到液体组合物中。将所得组合物在37℃下温育28-56天，然后测定肉毒杆菌毒素的剩余效价。测量结果见下表1和图1。表1从实验结果可以看出，在不含稳定候选物的阴性对照组中，肉毒杆菌毒素在所有ph下都不稳定，因此在28天后基本上没有检测到肉毒杆菌毒素的剩余效价。含有甲硫氨酸作为稳定剂的实验组在ph5.5-7.0下具有约10％的剩余效价，而含有精氨酸的实验组显示出高达30％的剩余效价。此外，测定表明精氨酸对肉毒杆菌毒素稳定性的效果在5.5至6.0的ph范围内比在6.5至7.0的ph范围内更高。实施例1-3：精氨酸或甲硫氨酸稳定作用的比较研究为了验证精氨酸或甲硫氨酸对肉毒杆菌毒素稳定化的影响，将含有精氨酸(50mm)或甲硫氨酸(50mm)作为稳定添加剂的肉毒杆菌毒素组合物温育56天，并且在三个独立实验中测定肉毒杆菌毒素的剩余效价。对测量结果进行统计处理，从而比较验证精氨酸和甲硫氨酸的作用。作为对照组，使用不含添加剂的样品。为了确定三个实验组之间的显著性，使用单因素方差分析法(one-wayanova)法。当显著性概率(p值)为0.05或更小时，确定三个实验组之间存在显著性差异，并且通过lsd(最小显著性差异(leastsignificantdifference))方法进行事后分析。测量结果如下表2和图2所示。表2在该实施例中获得的结果表明精氨酸和甲硫氨酸在ph6.0下都显示出高稳定作用，并且这些实验结果与上述实验结果一致。然而，在相同的ph条件下，与所有实验组中的甲硫氨酸相比，精氨酸显示出更高的稳定作用。例如，在不含稳定剂的对照组中，温育56天后在所有条件下均未测定到肉毒杆菌毒素的效价，但在含有甲硫氨酸的实验组中，在ph6.0下测定剩余效价为22.6％。在含有精氨酸的实验组中，在相同条件下测定剩余效价为69.1％。使用单因素方差分析法(one-wayanova)法检测精氨酸和甲硫氨酸的相对稳定作用的显著性，结果表明，在ph6.0时，温育14天除了实验组外，所有实验组的稳定作用值均显著。对于这样的结果，通过lsd(最小显著性差异)方法进行事后分析，结果显示在p<0.05至p<0.001的水平上精氨酸的稳定作用显著优于甲硫氨酸。例如，在ph7.0下温育28天后测量的值的比较表明含有甲硫氨酸的实验组显示出17.1％的剩余效价，含有精氨酸的实验组显示出55.8％的剩余效价，因此，两组间的稳定作用上存在显著性差异(p<0.001)。此外，在ph6.0下温育56天后测定的值的比较表明含有甲硫氨酸的实验组显示出22.6％的剩余效价，含有精氨酸的实验组显示出69.1％的剩余效价，因此，两组间的稳定作用上存在显著性差异(p<0.001)。并且本发明人研究了聚山梨醇酯表面活性剂性质对添加甲硫氨酸或精氨酸时的肉毒杆菌毒素稳定作用的影响。为此，将肉毒杆菌毒素和50mm精氨酸或甲硫氨酸加入到含有0-0.05wt％聚山梨醇酯的稳定液体组合物中，并将所得组合物在37℃下温育28-56天，之后测量肉毒杆菌毒素的剩余效价。从实验结果来看，在含有甲硫氨酸稳定化组合物的情况下，在ph5.5至6.0的范围内，稳定作用显示出与聚山梨醇酯浓度成比例增加的趋势，并且在ph6.5至7.0范围内，聚山梨醇酯的作用一般不会出现。在含有精氨酸的实验组的情况下，在ph5.5至6.5范围内，聚山梨醇酯的添加显示出有助于稳定作用的趋势，但聚山梨醇酯的效果不是那么显著。这些结果表明，向含有精氨酸作为稳定剂的液体肉毒杆菌毒素制剂中加入聚山梨醇酯不是必需的。实施例1-4：用于肉毒杆菌毒素液体制剂的新型稳定剂的鉴定实施例1-2至1-3的结果表明，与甲硫氨酸相比，精氨酸对肉毒杆菌毒素液体制剂的稳定效果更好。然而，与精氨酸类似的作用的新添加剂能够开发各种产品。为此，本发明人比较性地测定下表3中所示的各种稳定候选物的肉毒杆菌毒素稳定作用。检查结果如图3和图4所示。表3稳定肉毒杆菌毒素的候选药物稳定效果精氨酸+++葡萄糖酸内酯++甘氨酸-酒石酸++亚硫酸氢钠-半胱氨酸-没食子酸丙酯-连二亚硫酸钠+巯基乙酸盐-图3显示了在培养含有上表3中所示抗氧化剂的肉毒杆菌毒素组合物28天后测定肉毒杆菌毒素剩余效价的结果。测定结果表明，实验中使用的所有抗氧化添加剂的稳定效果均低于对照甲硫氨酸。然而，在缓冲剂的情况下，葡糖糖酸内酯在ph6.5下显示出显著的稳定作用，酒石酸在ph5.5-6.5范围内显示出稳定作用(图4)。这些结果表明开发具有显著效果的新添加剂的可能性。实施例2使用descr开发肉毒杆菌毒素稳定剂实施例2-1实验准备在实施例1中，在聚丙烯管中制备含有具有相对高效价(200单位/0.1毫升)的肉毒杆菌毒素的液体制剂样品，并使用botest测定法测量肉毒杆菌毒素的剩余效价。然而，这种肉毒杆菌毒素浓度与市售可供临床使用的肉毒杆菌毒素浓度显著不同。因此，在本发明中，使用具有与目前市售肉毒杆菌产品相似组合物的制剂对肉毒杆菌毒素稳定性制剂进行研究，即肉毒杆菌毒素初始效价为40-80单位/毫升的制剂。由于botest法需要至少50单位的效价，因此不能测量在上述条件下制备的液体制剂中肉毒杆菌毒素的剩余效价。因此，本发明人开发了一种descr(直接酶联免疫吸附结合体外snap25裂解反应(directelisacoupledwithinvitrosnap25cleavagereaction))法，能够定量测定微量存在的bont/a的效价。descr法将在下面的实施例2-2中详细描述。简而言之，尽管将200单位的bont/a添加到100μl的每种液体制剂样品中，并且通过实施例1中的botest法测量其在所有制剂样品中的剩余效价，将40-80单位/mlbont/a添加到0.1至1ml每种液体制剂样品中，并且通过实施例2中的descr方法(本发明人最新开发的)测定所有制剂样品中的剩余效价。为了确定具有稳定作用的添加剂候选物，每个实验组的样品(其含有10mmnapo4(ph6.0)、10mm酒石酸(ph6.0)或10mm葡糖糖酸内酯(ph6.0)作为缓冲剂)用作阴性对照，并且所有制剂样品通常含有0.05％聚山梨醇酯、45-130mmnacl、肉毒杆菌毒素和稳定剂添加剂候选物。将这些制剂样品在37℃下培养2至8周，并将10μl(0.4单位)的每种制剂样品用于测定肉毒杆菌毒素的剩余效价。省略详细描述的实验方法如上文实施例1中所述。实施例2-2.descr测定法的开发descr(直接酶联免疫吸附结合体外snap25裂解反应)包括以下两个步骤：(1)在bont/a和作为底物的高纯度重组蛋白(gst-snap25)之间进行体外酶促反应(体外snap25裂解反应)；和(2)通过酶联免疫吸附测定(elisa)定量测定酶促反应的程度。通过显色反应检测反应程度。具体地，可以通过使用第一抗体通过显色反应来检测，所述第一抗体与通过bont/a切割的形式(snap25197)和hrp(辣根过氧化物酶)偶合的第二抗体特异性反应。每个步骤如下进行。(1)体外snap25裂解反应将实验中使用的肉毒杆菌毒素稀释至各种浓度(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.2和1.6单位)，并在20μl缓冲溶液(20mmhepes-naoh(ph7.1)、0.1％吐温20、10μmzncl2和1μggst-snap25)中于37℃中进行酶促反应21h。(2)elisa将80μlrsb(反应终止缓冲剂；125mm碳酸盐(ph9.6，西格玛(sigma)s6014)和6.25mmedta)加入到反应溶液中以终止bont/a反应，并将反应溶液转移到玛谱免疫板(maxisorpimmuno-plate)上(nunc，目录号(catno).170-6531)，然后在37℃下包被2小时。用wb(洗涤缓冲液；含有0.05％tween-20和0.2mnacl的1xpbs)将每个孔洗涤三次，然后在37℃下用bs(封闭溶液；1xpbs中5％脱脂乳)封闭15分钟。接下来，用wb洗涤每个孔一次，并将在bs中稀释的100μlsnap25197-特异性抗体(1：250稀释，r&d)分配到每个孔中，并使其在37℃下反应1小时。在用wb洗涤三次后，将在bs中稀释的100μlhrp-偶合的第二抗体(1：1000稀释，艾福(abfrontier)，lf-sa8001)分配到每个孔中，并使其在37℃下反应1小时。用wb洗涤三次后，将100μltmb底物(赛默飞，目录号34028)分配到每个孔中以诱导显色反应。通过加入相同量的2m硫酸(西格玛(sigma)，目录号258105)终止反应，并使用吸收分析仪(多模式阅读器协同神经2(multi-modereadersynergyneo2)，生物科技(biotek))系统测定450nm处的吸光度，计算au值。这些步骤如图5所示。实施例2-3.比较精氨酸和甲硫氨酸对液体肉毒杆菌制剂稳定作用实施例1的结果表明，精氨酸和甲硫氨酸对肉毒杆菌毒素的稳定作用是ph依赖性的。具体地，在含有甲硫氨酸作为稳定剂的实验组中，肉毒杆菌毒素在ph5.5-7.0范围内显示出高达约10％的剩余效价，但在含有精氨酸的实验组中，剩余效价高达约30％。此外，显示精氨酸对bont/a稳定化的作用在ph5.5-6.0下比在ph6.5-7.0下更高。在含有稳定剂添加剂候选物的阴性对照组中，bont/a在所有ph条件下趋于不稳定，因此在28天后未检测到bont/a的剩余效价。基于这些结果，液体bont/a制剂的ph设定为6.0，并且液体bont/a制剂中精氨酸的浓度变改变为各种浓度。将bont/a加入到制剂中至初始效价为80单位/毫升，然后将制剂在37℃下培养8周，并通过descr法测量bont/a的效价。测定结果如图6所示。结果显示，2周后，不含稳定剂的对照组中bont/a的剩余效价为10％，含有50mm甲硫氨酸的实验组分别在2周、4周和8周后显示出67％、47％和27％的剩余效价。这表明甲硫氨酸具有显著的稳定作用。同时，精氨酸在50-100mm的浓度下显示出比甲硫氨酸更高的稳定效果，并且即使在8周后，在含有甲硫氨酸的制剂中bont/a的剩余效价为31至65％。在含有0.3％利多卡因的制剂中也观察到甲硫氨酸和精氨酸的相对稳定作用的差异。换句话说，8周后，含有甲硫氨酸的实验组显示出27％的剩余效价，含有精氨酸的实验组显示出44-62％的剩余效价。以上结果表明：(1)无论各种测量方法(包括botest法和descr法)如何，都证实了精氨酸的稳定作用；(2)即使在含有肉毒杆菌毒素的制剂(所述肉毒杆菌毒素具有与实际制备/分配供临床使用的产品类似的效价)中，精氨酸也具有稳定作用；(3)即使在含有利多卡因的制剂中也能保持精氨酸的稳定作用。实施例2-4评价液体制剂容器材料对bont/a效价稳定性的影响上面的实施例2-3显示通过在聚丙烯管中制备含有肉毒杆菌毒素的制剂得到的结果。然而，由于实际分配用于临床使用的肉毒杆菌毒素液体制剂是在玻璃容器中制备的，因此使用玻璃容器再次评价甲硫氨酸和精氨酸对肉毒杆菌毒素剩余效价的稳定作用。具体地，将bont/a制备成初始效价为40单位/毫升且含有20mm甲硫氨酸或100mm精氨酸的液体制剂，在37℃下温育制剂8周，通过descr法测定制剂中bont/a的剩余效价。测量结果如图7所示。结果，在含有甲硫氨酸的制剂中的bont/a的剩余效价为在2周、4周和8周后分别为41％、15％和8％。同时，在相同时间后，在含有精氨酸的制剂中的bont/a的剩余效价为84％、64％和43％，与含有甲硫氨酸的制剂中的bont/a的剩余效价具有很大差异。甚至当液体制剂含有利多卡因时，甲硫氨酸和精氨酸都显示出稳定作用。具体地，在含有甲硫氨酸的制剂中bont/a的剩余效价在2周、4周和8周后分别测定为47％、21％和16％，在含有精氨酸的制剂中bont/a的剩余效价测定为79％、71％和55％，表明精氨酸的稳定作用显著不同于甲硫氨酸的稳定作用。以上结果表明：(1)在聚丙烯管中制备的制剂样品中bont/a的效价比在玻璃容器中制备的制剂样品中bont/a的效价更稳定，即使配方具有相同的成分；(2)精氨酸对在玻璃容器中制备的bont/a液体制剂的稳定作用比甲硫氨酸强。实施例2-5。评价缓冲剂和谷氨酸对精氨酸稳定作用的影响上述实施例1-4表明，作为缓冲剂的酒石酸和葡糖糖酸内酯具有稳定作用，并且在ph6.0附近均显示出最佳效果。因此，使用玻璃容器测定精氨酸对含有酒石酸或葡糖糖酸内酯作为缓冲剂的bont/a制剂的稳定作用。用作阴性对照的缓冲剂是最常用的磷酸钠(napo4，ph6.0)。比较结果如图8所示。结果表明，精氨酸的稳定作用在所有液体制剂中显示出相似的模式，并且即使在8周后，含有精氨酸的制剂中bont/a的剩余效价测定为57-70％。在实验中使用的所有缓冲剂中，精氨酸对含有葡萄糖酸内酯的制剂的稳定作用显著高，且该制剂中bont/a的剩余效价比其他制剂样品高约10％。这种趋势也表现在含有利多卡因的制剂中。此外，除了酒石酸或葡糖酸内酯缓冲剂外，还评价了精氨酸作为稳定剂在含有谷氨酸的制剂中的作用。评价结果如图9所示。在上面的实施例2-3中，显示当将50mm谷氨酸加入到含有磷酸钠缓冲液和50mm精氨酸的bont/a液体制剂中时，在8周后制剂中bont/a的剩余效价为65％。当未在制剂中加入谷氨酸时，制剂中bont/a的剩余效价为32％。对于含有利多卡因的制剂也获得了类似的结果，具体地，在8周后测定该制剂中bont/a的剩余效价为71％。在这种情况下，当制剂不含谷氨酸时，测定的剩余效价为45％(参见图6)。基于实验结果，为了选择用于稳定含精氨酸和谷氨酸的bont/a液体制剂的最佳缓冲剂，用玻璃容器比较在含有磷酸钠、酒石酸或葡萄糖酸内酯的制剂中bont/a的效价。结果显示，在含有葡糖糖酸内酯作为缓冲剂的制剂中，在2周、4周和8周后通过descr法测量的descr的剩余效价明显高。具体地，当制剂不含利多卡因时，2周、4周和8周后的剩余效价分别达到96％、87％和71％，并且当制剂含有利多卡因时，剩余效价测定为96％、86％和68％。最后，为了评估有助于精氨酸稳定作用的谷氨酸的最佳浓度，在含有葡萄糖酸内酯作为缓冲剂的制剂中加入50mm精氨酸和10-50mm谷氨酸，以及在聚丙烯管中测定制剂中bont/a的效价。测量结果如图10所示。结果，在仅含有谷氨酸不含精氨酸的制剂中也检测到显著水平的bont/a效价，并且在含有利多卡因的制剂中效价更明显。具体地，在37℃温育8周后测定的剩余效价在阴性对照中为15％，在仅含有谷氨酸的制剂中为41％。然而，当仅使用谷氨酸时，其对bont/a稳定化的作用低于精氨酸。具体地，在37℃温育8周后，仅含有精氨酸的制剂显示出61％的剩余效价。测定在含有10-50mm谷氨酸和50mm精氨酸的制剂中bont/a的效价，结果表明，在2至8周后测量的剩余效价与在几乎所有实验组中仅含有精氨酸的制剂的剩余效价非常相似。这种趋势也出现在含有利多卡因的制剂中。具体地，在仅含有精氨酸的制剂中，温育8周后测量的剩余效价为61％，并且在含有精氨酸和谷氨酸的制剂中为约57-65％，没有显示出与浓度的显著关系。以上结果表明以下重要事实。谷氨酸具有在液体制剂中稳定bont/a的作用，但与单独精氨酸作用相比，单独谷氨酸的作用不明显。含有谷氨酸和精氨酸的制剂即使在8周的相对长的储存期后也没有显示出协同效应，并且该制剂中bont/a的剩余效价保持在恒定水平(60-80％)。实施例2-6.评价天冬氨酸对精氨酸稳定剂稳定作用的影响研究了酸性氨基酸(如谷氨酸)天冬氨酸对精氨酸的bont/a稳定作用的影响，结果示于图11中。仅含有天冬氨酸的制剂中的bont/a在温育2至8周后显示出相对高的剩余效价，并且天冬氨酸的这种稳定作用显著地出现在含有利多卡因的制剂中。在阴性对照组中，在2周、4周和8周后测定的剩余效价分别为73％、30％和15％，但在含有天冬氨酸的实验组中，剩余效价测定为88％、73％和52％。在含有10-50mm天冬氨酸和50mm精氨酸的制剂中，测定8周后bont/a的剩余效价，结果显示在仅含有精氨酸的制剂中剩余效价为61％，除了精氨酸之外，含有天冬氨酸的制剂中剩余效价为约58-73％，与浓度没有显著关系。与8周后测定的剩余效价不同，在2至4周后测定的bont/a剩余效价显示出统计学上显著差异。具体地，在仅含有精氨酸的制剂中，分别在2周和4周后测定的剩余效价分别为82％和76％，但是当将天冬氨酸添加到制剂中时，测得剩余效价为92-100％和85-94％。此外，在含有谷氨酸的制剂中，在同一时期出现类似的稳定作用，但作用程度相对较低，测得剩余效价为83-98％和76-88％。含有天冬氨酸的制剂的测定结果如下表4中所示，含有谷氨酸的制剂的测定结果如下表5中所示。表4表5实施例2-7.由新型液体制剂制备的bont/a产品稳定性测定基于系统地和比较分析各种液体可注射添加剂的结果而建立一种用于bont/a的新型液体组合物(其安全性由本发明人证实)，包含10mm葡糖糖酸内酯(ph6.0)、45-130mm氯化钠、50mm精氨酸、50mm天冬氨酸和0.05％聚山梨醇酯。为了通过小鼠ld50测定验证液体制剂的安全性，使用玻璃容器制备具有上述组合物的bont/a制剂，以具有40单位/毫升的初始效价。使用含有甲硫氨酸代替精氨酸的液体制剂产品作为对照，比较测定产品的稳定性。测定结果如图12所示。结果表明，由新型液体组合物制备的bont/a产品的稳定性与体外研究中获得的结果非常相似。具体地，在2周、4周和8周后测定的该bont/a产品的剩余效价分别为96％、84％和66％，在2周、4周和8周后测定的对照的剩余效价分别为41％、15％和8％。工业适用性肉毒杆菌毒素抑制具有神经功能的动物的神经肌肉接头的胆碱能突触前的乙酰胆碱的胞吐作用，从而引起虚弱。因此，最近已经努力将肉毒杆菌毒素的神经毒性用于美容或治疗目的。然而，肉毒杆菌毒素(一种蛋白质试剂)的问题在于它不易配制成药物组合物并且也不易于储存、分配和管理。这是由于蛋白质的不稳定性，而肉毒杆菌毒素等蛋白质制剂在极低浓度下被配制成药物组合物的情况下，这种问题非常严重。本发明的含有肉毒杆菌毒素和稳定剂的液体制剂易于储存和分配。在适合人体的温度和ph的适当条件下证明对肉毒杆菌毒素稳定化具有显著影响。因此，期望本发明的药物组合物对肉毒杆菌毒素的安全、方便的医疗使用具有很大的帮助。当前第1页12