整合素α9的阻断抑制淋巴管瓣形成并促进移植物存活的制作方法
本申请要求2016年10月27日提交的美国临时申请号62/413,863的优先权。以上提及的申请的全部内容特此以引用的方式并入本文中。
关于联邦资助研究的声明
本发明是在政府支持下以国家卫生研究院(nationalinstitutesofhealth)授予的ey017392和国防部(departmentofdefense)授予的w81xwh-14-1-0496取得。政府对本发明具有某些权力。
发明背景
淋巴管网渗透大多数组织并且其功能障碍与广泛的病症相关联，所述病症如癌症转移、发炎、移植排斥反应、高血压、肥胖症和淋巴水肿。由于历史原因和技术限制而被忽视了几个世纪之后，淋巴管研究近年来已经获得显著关注和重大进展。然而，当前对于淋巴管疾病存在极少治疗。因此，需要用于淋巴管疾病和预防移植排斥反应的新治疗。
技术实现要素：
在某些实施方案中，本发明提供了一种在有需要的哺乳动物中抑制移植的组织或器官中的淋巴管中的瓣生成(vg)的方法，其包括将有效量的抗整合素α9(itga-9)治疗剂施用于所述哺乳动物。
在某些实施方案中，本发明提供了一种抑制淋巴管中的整合素α9(itga-9)的方法，其包括使所述淋巴管与抗itga-9治疗剂接触。
在某些实施方案中，本发明提供了一种预防或治疗有需要的哺乳动物中的角膜瓣生成(vg)的方法，其包括将有效量的包含抗itga-9抗体的治疗剂施用于所述哺乳动物。
在某些实施方案中，本发明提供了一种包含含有抗itga-9结合剂的治疗剂的组合物，其用于治疗性处理组织或器官中的病理性淋巴管形成。
在某些实施方案中，本发明提供了抗itga-9结合剂的用途，其用以制备适用于抑制哺乳动物中的lg的药剂。
在某些实施方案中，本发明提供了一种包含治疗剂和抗itga-9结合剂的组合物，其用于医学疗法中。
在某些实施方案中，本发明提供了一种抑制有需要的哺乳动物中的移植排斥反应的方法，其包括将有效量的治疗剂施用于所述哺乳动物，其中所述治疗剂是抗itga-9治疗剂。
如本文所用的“治疗”是指改善vg的至少一种症状、治愈vg和/或预防vg的发展。
在某些实施方案中，所述方法还包括施用vegfr-3。
附图说明
图1a-1c.淋巴管瓣生成在角膜移植之后受itga-9的阻断抑制。(图1a)在itga-9阻断抗体处理的角膜中与同型对照处理的角膜相比展示显著更少的瓣的代表性整片免疫染色图像。红色：itga-9；绿色：lyve-1。比例尺，100μm。(图1b)在对照和处理条件下对淋巴管瓣和淋巴管侵入面积的比较性定量。抗itga-9处理仅减少瓣形成。用对照中的7只小鼠和处理组中的8只小鼠重复实验两次。*p<0.05；n.s.：不显著。(图1c)响应抗itga-9处理显示瓣与淋巴管侵入面积的显著更低比率的比较性定量。用对照中的7只小鼠和处理组中的8只小鼠重复实验两次。*p<0.05。
图2a-2b.itga-9的阻断在角膜移植之后对淋巴管的极化分布无影响。(图2a)用于定量的鼻和颞象限区的示意图。围绕时钟的八个短线指示沿着移植物边界放置的缝合线。外实线圆：异色边缘。内虚线圆：移植物边界。竖直线：鼻与颞侧之间的间隔。灰色阴影区域：所评价的鼻和颞区。(图2b)在对照与处理两种条件下在鼻中相比颞侧显示显著更高的淋巴管侵入面积的比较性定量。用对照中的7只小鼠和处理组中的8只小鼠重复实验两次。*p<0.05。
图3a-3b.itga-9的阻断促进角膜移植物存活。(图3a)分别来自在对照和处理条件下排斥的和存活的移植物的裂隙灯检查的代表性图像。(图3b)在处理组中显示显著更高的存活率的卡普兰-梅尔存活曲线(kaplan-meiersurvivalcurve)。*p<0.05。
图4.itga-9的阻断对角膜lg的这种极性无影响。
图5.itga-9在瓣上的表达比管壁上更高。
图6a和6b.ltga-9和vegfr-3的组合阻断抑制高风险角膜移植之后的淋巴管瓣和管形成(图6，以绿色示出的管和瓣)并且促进移植物存活(图6b，卡普兰-梅尔存活曲线)。
图7a和7b.itga-9的阻断体内抑制角膜瓣形成。(图7a)在itga-9阻断抗体处理的角膜中与对照同型处理的样品相比显示显著更少的瓣的代表性免疫荧光显微镜图像。红色：itga-9；绿色：lyve-1。比例尺，50lm。(图7b)定量瓣形成的汇总数据。*p<0.05。
图8a和8b.人类皮肤lec中的itga-9的表达和耗竭。(图8a)显示人类lec中的itga-9表达的代表性免疫细胞荧光显微镜图像。红色：itga-9；蓝色：dapi。比例尺，50lm。(图8b)显示与杂乱sirna相比使用itga-9sirna的itga-9基因敲落的实时pcr分析。*p<0.05。
图9a和9b.itga-9敲落对lec活力无影响。(图9a)使用guavaviacount测定显示在转染后48小时在对照与itga-9sirna转染的细胞之间的细胞活力无显著差异的流式细胞术分析。来自重复性研究的汇总数据在图9b中呈现。n.s.，不显著。
图10a-10b.itga-9敲落抑制lec的增殖和粘附功能。(图10a)使用mts增殖测定显示在用itga-9sirna转染之后lec增殖的显著抑制的汇总数据。*p<0.05。(图10b)显示在用itga-9sirna转染之后lec粘附至纤连蛋白的显著减少的汇总数据。*p<0.05。
图11a-11b.itga-9敲落抑制lec迁移。(图11a)使用划痕测定显示经过72小时时段lec迁移的显著减少的汇总数据。*p<0.05。(图11b)在72小时的细胞迁移的代表性图像。比例尺，100lm。红色：tritc缀合的鬼笔环肽。
图12a-12b.itga-9敲落抑制lec管形成。(图12a)显示基质胶(matrigel)上管形成的显著减少的代表性显微镜图像。比例尺，500lm。(图12b)关于总管长度的汇总数据。*p<0.05。
具体实施方式
不同于在过去几个世纪已经研究的血管，淋巴管研究表示一个新发现的领域并且近年来已经经历指数增长(alitalo,k.thelymphaticvasculatureindisease.nat.med.2011；17:1371-1380；tammelat,alitalok:lymphangiogenesis:molecularmechanismsandfuturepromise.cell2010；140:460-476；chenl:ocularlymphatics:state-of-the-artreview.lymphology2009；42:66-76；alitalok,tammelat,petrovatv:lymphangiogenesisindevelopmentandhumandisease；nature2005；438:946-953；brownp:lymphaticsystem:unlockingthedrains.nature2005；436:456-458；folkmanj,kaipainena:genestelllymphaticstosproutornot.natimmunol2004；5:11-12；rocksonsg:thebroadspectrumoflymphatichealthanddisease.lymphatresbiol；8:101)。淋巴管网渗透身体中的大多数组织并且在广泛的功能中起关键作用，所述功能如免疫监视、体液调控以及脂肪和维生素吸收。众多疾病和疾患因此与淋巴管功能障碍相关联，包括但不限于癌症转移、组织和主要器官(心、肾和肺)移植排斥反应、炎性和免疫疾病、感染、哮喘、肥胖症、糖尿病、爱滋病、高血压和淋巴水肿。这些病症可以致残、毁容并且甚至威胁生命。迄今，对于淋巴管病症存在极少的有效治疗，因此，这个领域迫切需要新的治疗方案。
角膜归因于其可及位置、透明性质和无淋巴管但可诱导的特征而提供用于淋巴管研究的理想部位(chenl:ocularlymphatics:state-of-the-artreview.lymphology2009；42:66-76；rogersms,birsnerae,d'amatorj:themousecorneamicropocketangiogenesisassay.natprotoc2007；2:2545-2550；cursiefenc,chenl,danamr,streileinjw:corneallymphangiogenesis:evidence,mechanisms,andimplicationsforcornealtransplantimmunology.cornea2003；22:273-281；chenl,hannb,wul:experimentalmodelstostudylymphaticandbloodvascularmetastasis,"fromlocalinvasiontometastaticcancer".stanleyp.l.leong(编),humanapress.2011)。使用角膜用于淋巴管研究的成功可以从以下事实预测：据肿瘤血管生成研究的始祖judahfolkman估计，在过去几个世纪期间，超过三分之一的关于血管的基础知识从使用角膜的研究获得。
尽管在正常状态下不是由淋巴管供给，但在炎性、感染性、创伤性、免疫原性或化学损伤之后淋巴管形成(淋巴管生成，lg)伴随许多角膜疾病。在诱导后，这些角膜疾病增强免疫细胞的高容量递送并且还介导移植排斥反应。汇集数据已经显示，淋巴管路径是角膜移植排斥反应的主要介体(dietricht,bockf,yuend等:cuttingedge:lymphaticvessels,notbloodvessels,primarilymediateimmunerejectionsaftertransplantation.jimmunol2010；184:535-539；zhangh,grimaldos,yuend,chenl:combinedblockadeofvegfr-3andvla-1markedlypromoteshigh-riskcornealtransplantsurvival.investophthalmolvissci2011)。此外，lg已经与身体的其它部分(例如肾、心、肺、骨植入物)中的移植排斥反应相关联(kerjaschkid:lymphaticneoangiogenesisinrenaltransplants:adrivingforceofchronicrejection？jnephrol2006；19:403-406；kerjaschkid,huttaryn,raabi等:lymphaticendothelialprogenitorcellscontributetodenovolymphangiogenesisinhumanrenaltransplants.natmed2006；12:230-234；jellg,kerjaschkid,revellp,al-saffarn:lymphangiogenesisinthebone-implantinterfaceoforthopedicimplants:importanceandconsequence.jbiomedmaterresa2006；77:119-127；geisslerhj,dashkevicha,fischerum等:firstyearchangesofmyocardiallymphaticendothelialmarkersinhearttransplantrecipients.eurjcardiothoracsurg2006；29:767-771)。
角膜移植是所有实体器官和组织移植当中最常见的形式。尽管角膜移植享有未发炎和无淋巴管的宿主红血球的高存活率，但当对发炎和富含淋巴管的角膜进行移植时排斥率可能高达50-90％。迄今，对这种高排斥反应的情况仍然存在极少的有效管控。不幸的是，许多由于角膜疾病而失明的患者属于这种高排斥反应的类别(在创伤性、炎性、感染性或化学损伤之后)。归因于不良预后，这些患者甚至不被认为是移植手术的良好候选者并且不得不放弃其视力恢复的希望。我们因此关注于鉴别新的治疗标靶以治疗lg和其相关病症，包括移植排斥反应。角膜提供用于lg研究的理想部位。归因于角膜的可及位置、透明性质和在正常状态下的无淋巴管特征，这种组织提供一种有利的模型来研究可诱导的淋巴管生长而无需与现有或背景管相区分(chenl.ocularlymphatics:state-of-the-artreview.lymphology2009；42:66-76)。角膜lg可以由许多病理性伤害诱导，例如发炎、感染、创伤和化学灼伤，并且其为移植排斥反应的主要介体(chenl.ocularlymphatics:state-of-the-artreview.lymphology2009；42:66-76；dietricht,bockf,yuend等cuttingedge:lymphaticvessels,notbloodvessels,primarilymediateimmunerejectionsaftertransplantation.jimmunol2010；184:535-539；yuend,pytowskib,chenl.combinedblockadeofvegfr-2andvegfr-3inhibitsinflammatorylymphangiogenesisinearlyandmiddlestages.investophthalmolvissci2011；52:2593-2597)。
本发明具有许多潜在的应用，例如，预防或治疗角膜瓣生成(vg)以促进移植物存活。
在某些实施方案中，本发明提供了一种在有需要的哺乳动物中抑制移植的组织或器官中的淋巴管中的瓣生成(vg)的方法，其包括将有效量的抗整合素α9(itga-9)治疗剂施用于所述哺乳动物。
在某些实施方案中，淋巴管在眼组织中。
在某些实施方案中，眼组织是角膜组织。
在某些实施方案中，移植的组织是角膜移植物。
在某些实施方案中，抗itga-9治疗剂是对itga-9有特异性的结合剂。
在某些实施方案中，结合剂是抗体或抗体片段。
在某些实施方案中，结合剂是抑制itga-9的产生或活性的rnai分子。
在某些实施方案中，治疗剂是通过结膜下注射施用。
在某些实施方案中，与对照管相比，vg抑制至少10％。
在某些实施方案中，淋巴管瓣的数目与未处理的对照相比减少至少10％。
在某些实施方案中，淋巴管的数目与未处理的对照是可比的。
在某些实施方案中，本发明提供了一种抑制淋巴管中的整合素α9(itga-9)的方法，其包括使所述淋巴管与抗itga-9治疗剂接触。
在某些实施方案中，本发明提供了一种预防或治疗有需要的哺乳动物中的角膜瓣生成(vg)的方法，其包括将有效量的包含抗itga-9抗体的治疗剂施用于所述哺乳动物。
在某些实施方案中，角膜vg是由移植、发炎、感染、干眼、创伤或化学损伤诱导。
在某些实施方案中，哺乳动物是人类。
在某些实施方案中，治疗剂存在于药物组合物内。
在某些实施方案中，施用是通过局部或全身施用。
在某些实施方案中，施用是通过结膜下、眼内、眼周、眼球后、肌肉内、表面、静脉内、腹膜内或皮下施用。
在某些实施方案中，所述方法还包括施用另一种增效因子，例如vegfr-3。
在某些实施方案中，本发明提供了一种包含含有抗itga-9结合剂的治疗剂的组合物，其用于治疗性处理组织或器官中的病理性淋巴管形成。
在某些实施方案中，组合物还包含另一种增效因子，例如vegfr-3。
在某些实施方案中，本发明提供了抗itga-9结合剂的用途，其用以制备适用于抑制哺乳动物中的lg的药剂。
在某些实施方案中，本发明提供了抗itga-9结合剂和另一种增效因子(例如vegfr-3)的用途，其用以制备适用于抑制哺乳动物中的lg的药剂。在某些实施方案中，本发明提供了一种包含治疗剂抗itga-9结合剂的组合物，其用于医学疗法中。
在某些实施方案中，组合物还包含另一种增效因子，例如vegfr-3。
在某些实施方案中，本发明提供了一种抑制有需要的哺乳动物中的移植排斥反应的方法，其包括将有效量的治疗剂施用于所述哺乳动物，其中所述治疗剂是抗itga-9治疗剂。
在某些实施方案中，所述方法还包括施用另一种增效因子，例如vegfr-3。
本发明者已经发现，整合素α9的阻断抑制淋巴管瓣形成并且促进移植物存活。本发明数据指示，itga-9阻断剂可以用于抑制组织，例如角膜中的病理性淋巴管瓣形成。itga-9阻断剂可以局部或全身施用以治疗眼病(结膜下、眼内、眼周、眼球后、肌肉内、表面、静脉内、皮下，等等)。本发明还可以用于治疗身体中的其它淋巴管病症，例如癌症转移以及炎性和免疫疾病。itga-9阻断策略可以潜在地用于抑制淋巴管瓣形成并且治疗淋巴管病症，例如移植排斥反应。在某些实施方案中，瓣生成(vg)抑制至少10％。在某些实施方案中，vg抑制至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％。在某些实施方案中，vg在足以产生治疗作用的水平上受抑制。如本文所用的术语“治疗作用”是指疾病病况的相关异常(包括病理性和行为缺损)的变化；疾病病况的进展时间的变化；疾病症状的减少、减轻或改变；或罹受疾患的人的生活质量提高。治疗作用可以由医师定量地测量，或由罹受阻断剂所靶向的vg的患者定性地测量。
在一个实施方案中，本发明的特征在于一种用于治疗或预防受试者或生物体中的vg的方法，其包括经由局部施用于相关组织或细胞，例如，通过将itga-9阻断剂施用于相关细胞，使所述受试者或生物体与本发明的itga-9阻断剂分子接触。
itga-9阻断剂的递送方法包括但不限于静脉内施用和直接施用于患者的眼中。
结合剂
本发明提供了一种特异性地结合至itga-9的纯化的结合剂(或配体)，即，“抗itga-9治疗剂”。抗itga-9治疗剂可以是抗体或小分子药剂。作为抗itga-9治疗剂的药剂的实例包括单克隆或多克隆抗体、肽、小分子、小干扰rna，等等。
抗体
如本文所用的术语“抗体”包括scfv、人源化、完全人类或嵌合抗体、单链抗体、双体抗体，以及不含fc区的抗体的抗原结合片段(例如fab片段)。在某些实施方案中，抗体是人类抗体或人源化抗体。“人源化”抗体仅含有来自以重组方式连接至人类抗体序列的对应的框架和恒定区上的每个供体抗体可变区的三个cdr(互补决定区)并且有时含有几个精心选择的“框架”残基(可变区的非cdr部分)。“完全人源化抗体”是在来自经过基因工程改造以仅具有源自人类的抗体基因的小鼠的杂交瘤中建立或通过从源自人类的抗体基因的噬菌体展示文库选择来建立。
如本文所用的术语“抗体”包括单链可变片段(scfv或“纳米抗体”)、人源化、完全人类或嵌合抗体、单链抗体、双体抗体，以及抗体的抗原结合片段(例如fab片段)。scfv是借助于连接子肽连接的免疫球蛋白的重链(vh)和轻链(vl)的可变区的融合蛋白。连接子通常是短的，长度约为10-25个氨基酸。如果柔性是重要的，那么连接子将含有相当多的甘氨酸。如果可溶性是重要的，那么连接子中将利用丝氨酸或苏氨酸。连接子可以将vh的氨基端连接至vl的羧基端，或连接子可以将vh的羧基端连接至vl的氨基端。二价(也称为双价)scfv可以通过连接两个scfv产生。举例来说，二价scfv可以通过产生含有两个vh和两个vl区的单一肽而制成。或者，各自含有单一vh和单一vl区的两个肽可以二聚(也称为“双体抗体”)。holliger等,"diabodies:smallbivalentandbispecificantibodyfragments",pnas,1993年7月,90:6444-6448。二价性允许抗体以高亲合力结合至多聚抗原，并且双特异性允许两个抗原交联。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从一组大体上均质的抗体，即，构成组的抗体除了少量存在的天然产生的突变体以外均质的抗体组获得的抗体。单克隆抗体是高度特异性的并且与单一抗原位点相互作用。此外，与通常含有针对多样化的抗原决定簇的各种抗体的常见多克隆抗体制剂相比，每个单克隆抗体靶向抗原上的单一抗原决定簇(表位)。除了其特异性之外，单克隆抗体的有利之处在于其从不受其它免疫球蛋白污染的杂交瘤培养物产生。
形容词“单克隆”指示从大体上均质的抗体组获得的抗体的特征，并且不特指通过特定方法产生的抗体。举例来说，有待用于本发明中的单克隆抗体可以通过例如杂交瘤方法(kohler和milstein,nature256:495,1975)或重组方法(美国专利号4,816,567)产生。用于本发明中的单克隆抗体还可以从噬菌体抗体文库分离(clackson等,nature352:624-628,1991；marks等,j.mol.biol.222:581-597,1991)。本发明的单克隆抗体尤其包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重(h)链和/或轻(l)链的一部分来源于特定物种或特定抗体种类或子类，并且链的剩余部分来源于另一个物种或另一个抗体种类或子类。此外，突变体抗体和其抗体片段也包括在本发明中(美国专利号4,816,567；morrison等,proc.natl.acad.sci.usa81:6851-6855,1984)。
如本文所用的术语“突变体抗体”是指包含一个或多个氨基酸残基已经改变的变体氨基酸序列的抗体。举例来说，可以修饰抗体的可变区以改善其生物特性，例如抗原结合。此类修饰可以通过定点诱变(参见kunkel,proc.natl.acad.sci.usa82:488(1985))、基于pcr的诱变、盒式诱变等等来达成。此类突变体包含与抗体的重或轻链可变区的氨基酸序列至少70％相同、更优选至少75％、甚至更优选至少80％、甚而更优选至少85％、进而更优选至少90％并且最优选至少95％相同的氨基酸序列。如本文所用的术语“序列同一性”定义为在比对序列并且必要时适当地引入空位以使序列同一性达到最大之后确定，与抗体的原始氨基酸序列中的那些相同的残基的百分比。
具体地说，一个核苷酸序列或氨基酸序列与另一个序列的同一性可以使用由karlin和altschul(proc.natl.acad.sci.usa,90:5873-5877,1993)提供的算法blast确定。例如blastn和blastx的程序是基于这种算法开发的(altschul等,j.mol.biol.215:403-410,1990)。为了根据基于blast的blastn分析核苷酸序列，将参数设置成例如分数＝100和字长＝12。另一方面，用于通过基于blast的blastx分析氨基酸序列的参数包括例如分数＝50和字长＝3。当使用blast和空位blast程序时使用每个程序的缺省参数。用于此类分析的特定技术在本领域中是已知的(参见国家生物技术信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation，ncbi)的网站，基本局部比对搜索工具(basiclocalalignmentsearchtool，blast)；http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。
多克隆和单克隆抗体可以通过本领域技术人员已知的方法制备。
在另一个实施方案中，抗体或抗体片段可以从通过使用mccafferty等(nature348:552-554(1990))报道的技术产生的抗体噬菌体文库分离。clackson等(nature352:624-628(1991))和marks等(j.mol.biol.222:581-597(1991))报道了小鼠和人类抗体从噬菌体文库的相应分离。还有报道描述了基于链改组(marks等,bio/technology10:779-783(1992))以及组合的感染和体内重组产生高亲和力(nm范围)人类抗体，这些是用于构建大规模噬菌体文库的方法(waterhouse等,nucleicacidsres.21:2265-2266(1993))。这些技术还可以用于分离单克隆抗体，以替代使用用于单克隆抗体产生的常规杂交瘤技术。
有待用于本发明中的抗体可以通过从已知方法适当选择的方法来纯化，已知方法如蛋白质a-琼脂糖方法、羟基磷灰石色谱法、使用硫酸盐的盐析法、离子交换色谱法和亲和色谱法，或通过组合使用上述方法。
本发明可以使用通过基因工程改造产生的重组抗体。编码通过上文所描述的方法获得的抗体的基因从杂交瘤分离。将基因插入适当载体中，然后引入宿主中(参见例如carl,a.k.borrebaeck,james,w.larrick,therapeuticmonoclonalantibodies,由英国麦克米兰出版有限公司(macmillanpublishersltd)出版,1990)。本发明提供了编码本发明的抗体的核酸，和包含这些核酸的载体。具体地说，使用逆转录酶，从杂交瘤的mrna合成编码抗体的可变区(v区)的cdna。在获得编码所关注的抗体的可变区的dna之后，使其与编码抗体的所需恒定区(c区)的dna接合，并且将所得dna构建体插入表达载体中。或者，可以将编码抗体的可变区的dna插入包含抗体c区的dna的表达载体中。将这些dna插入表达载体中以在表达调控区，例如增强子和启动子的调控下表达基因。然后，用表达载体转化宿主细胞以表达抗体。本发明提供了表达本发明的抗体的细胞。表达本发明的抗体的细胞包括用此种抗体的基因转化的细胞和杂交瘤。
本发明的抗体还包括包含互补决定区(cdr)或与cdr功能上等效的区域的抗体。术语“功能上等效”是指包含与实施例中分离的单克隆抗体中的任一种的cdr的氨基酸序列类似的氨基酸序列。术语“cdr”是指抗体可变区(也称为“v区”)中的区域，并且决定抗原结合的特异性。h链和l链各自具有三个cdr，从n端起命名为cdr1、cdr2和cdr3。存在四个侧接这些cdr的区域：这些区域被称作“框架”，并且其氨基酸序列是高度保守的。可以将cdr移植至其它抗体中，并且因此可以通过组合cdr与所需抗体的框架来制备重组抗体。可以修饰cdr的一个或多个氨基酸而不损失结合至其抗原的能力。举例来说，可以取代、缺失和/或添加cdr中的一个或多个氨基酸。
在某些实施方案中，氨基酸残基突变为允许氨基酸侧链的特性保守的残基。氨基酸侧链的特性的实例包括：疏水氨基酸(a、i、l、m、f、p、w、y、v)，亲水氨基酸(r、d、n、c、e、q、g、h、k、s、t)，以及包含以下侧链的氨基酸：脂肪族侧链(g、a、v、l、i、p)；含羟基侧链(s、t、y)；含硫原子侧链(c、m)；含羧酸和酰胺侧链(d、n、e、q)；含碱侧链(r、k、h)；和含芳香族侧链(h、f、y、w)。括号中的字母指示单字母氨基酸代码。在每个组内的氨基酸取代被称为保守取代。众所周知，包含缺失、添加和/或取代一个或多个氨基酸残基的经过修饰的氨基酸序列的多肽可以保留原始生物活性(markd.f.等,proc.natl.acad.sci.u.s.a.81:5662-5666(1984)；zollerm.j.和smithm.,nucleicacidsres.10:6487-6500(1982)；wanga.等,science224:1431-1433；dalbadie-mcfarlandg.等,proc.natl.acad.sci.u.s.a.79:6409-6413(1982))。突变的氨基酸的数目不受限制，但数目一般处于每个cdr的40％氨基酸以内并且优选35％以内并且甚而更优选30％以内(例如25％以内)。氨基酸序列的同一性可以如本文所描述来确定。
在本发明中，可以使用经过人工修饰以减少对人类的异源抗原性的重组抗体。实例包括嵌合抗体和人源化抗体。这些经过修饰的抗体可以使用已知方法产生。嵌合抗体包括包含彼此不同的物种的可变和恒定区的抗体，例如，包含非人类哺乳动物(例如小鼠)的抗体重链和轻链可变区以及人类的抗体重链和轻链恒定区的抗体。此种抗体可以通过以下方式获得：(1)使编码小鼠抗体的可变区的dna接合至编码人类抗体的恒定区的dna；(2)将此并入表达载体中；以及(3)将载体引入宿主中用于产生抗体。
人源化抗体，也称为改形人类抗体，是通过用人类抗体的互补决定区(cdr)取代非人类哺乳动物(例如小鼠)的抗体的h或l链cdr来获得。用于制备此类抗体的常规基因重组技术是已知的(参见例如jones等,nature321:522-525(1986)；reichmann等,nature332:323-329(1988)；prestacurr.op.struct.biol.2:593-596(1992))。具体地说，经过设计以使小鼠抗体的cdr与人类抗体的框架区(fr)接合的dna序列是通过pcr使用若干被构建成在末端包含重叠部分的寡核苷酸来合成。人源化抗体可以通过以下方式获得：(1)使所得dna接合至编码人类抗体恒定区的dna；(2)将此并入表达载体中；以及(3)将载体转染至宿主中以产生抗体(参见欧洲专利申请号ep239,400和国际专利申请号wo96/02576)。选择经由cdr接合的人类抗体fr，其中cdr形成有利的抗原结合位点。人源化抗体可以包含在引入接受者抗体中的cdr中和框架序列中都不包括的一个或多个额外氨基酸残基。通常引入此类氨基酸残基以更准确地优化抗体识别并结合至抗原的能力。举例来说，必要时，可以取代抗体可变区的框架区中的氨基酸以使得改形人类抗体的cdr形成适当的抗原结合位点(sato,k.等,cancerres.(1993)53,851-856)。
本发明的抗体的同型不受限制。同型包括例如igg(igg1、igg2、igg3和igg4)、igm、iga(iga1和iga2)、igd和ige。本发明的抗体也可以是包含负责抗原结合的部分的抗体片段或其经过修饰的片段。术语“抗体片段”是指全长抗体的一部分，并且一般是指包含抗原结合结构域或可变区的片段。此类抗体片段包括例如fab、f(ab')2、fv、包含用适当连接子偶联在一起的重链fv和轻链fv的单链fv(scfv)、双体抗体、线性抗体，以及从抗体片段制备的多特异性抗体。先前，通过用蛋白酶消化天然抗体来产生抗体片段；当前，使用基因工程改造技术将天然抗体表达为重组抗体的方法也是已知的(参见morimoto等,journalofbiochemicalandbiophysicalmethods24:107-117(1992)；brennan等,science229:81(1985)；co,m.s.等,j.immunol.,1994,152,2968-2976；better,m.和horwitz,a.h.,methodsinenzymology,1989,178,476-496,academicpress,inc.；plueckthun,a.和skerra,a.,methodsinenzymology,1989,178,476-496,academicpress,inc.；lamoyi,e.,methodsinenzymology,1989,121,663-669；bird,r.e.等,tibtech,1991,9,132-137)。
“fv”片段是最小抗体片段，并且含有完整抗原识别位点和结合位点。这个区域是二聚体(vh-vl二聚体)，其中重链和轻链中的每个链的可变区由非共价键强连接。可变区中的每个区的三个cdr彼此相互作用以在vh-vl二聚体的表面上形成抗原结合位点。换句话说，来自重链和轻链的总共六个cdr一起充当抗体的抗原结合位点。然而，还已知单独的可变区(或一半fv，其仅含有三个抗原特异性cdr)能够识别并结合至抗原，不过其亲和力低于整个结合位点的亲和力。因此，本发明的优选抗体片段是fv片段，但不限于此。此种抗体片段可以是多肽，所述多肽包含保守的重链或轻链cdr的抗体片段，并且可以识别并结合其抗原。
fab片段(也称作f(ab))还含有轻链恒定区和重链恒定区(ch1)。举例来说，抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个种类的片段：含有重链和轻链的可变区的抗原结合片段，称为fab片段，其充当单一抗原结合结构域；和剩余部分，由于其容易结晶而称为“fc”。fab'片段与fab片段的不同之处在于fab'片段还具有来源于重链ch1区的羧基端的若干残基，其含有一个或多个来自抗体的铰链区的半胱氨酸残基。然而，fab'片段与fab结构上等效之处在于这两个片段都是包含重链和轻链的可变区的抗原结合片段，其充当单一抗原结合结构域。在本文中，充当单一抗原结合结构域并且等效于通过木瓜蛋白酶消化所获得的片段的包含重链和轻链的可变区的抗原结合片段被称作“fab样抗体”，甚至当其不同于通过蛋白酶消化产生的抗体片段时。fab'-sh是在恒定区中具有一个或多个具有游离硫醇基的半胱氨酸残基的fab'。f(ab')片段是通过使f(ab')2的铰链区中的半胱氨酸残基之间的二硫键裂解而产生。其它化学交联的抗体片段也为本领域技术人员所知。抗体的胃蛋白酶消化得到两种片段；一种是包含两个抗原结合结构域并且可以与抗原交叉反应的f(ab')2片段，并且另一种是剩余片段(称作pfc')。在本文中，等效于通过胃蛋白酶消化所获得的片段的抗体片段当其包含两个抗原结合结构域并且可以与抗原交叉反应时被称作“f(ab')2样抗体”。此类抗体片段还可以例如通过基因工程改造而产生。此类抗体片段还可以例如从上文所描述的抗体噬菌体文库分离。或者，f(ab')2-sh片段可以直接从例如大肠杆菌的宿主回收，然后通过化学交联形成f(ab')2片段(carter等,bio/technology10:163-167(1992))。在替代性方法中，f(ab')2片段可以直接从重组宿主的培养物分离。
术语“双体抗体(db)”是指通过基因融合构建的双价抗体片段(例如，p.holliger等,proc.natl.acad.sci.usa90:6444-6448(1993)；ep404,097；wo93/11161)。一般来说，双体抗体是两个多肽链的二聚体。在多肽链中的每个链中，同一链中的轻链可变区(vl)和重链可变区(vh)经由短连接子，例如约五个残基的连接子连接，以使其无法结合在一起。因为这两个区之间的连接子过短，所以相同多肽链中的vl和vh无法形成单链v区片段，而是形成二聚体。因此，双体抗体具有两个抗原结合结构域。当针对两种类型的抗原(a和b)的vl和vh区经由约五个残基的连接子组合形成vla-vhb和vlb-vha，然后共同表达时，其作为双特异性db分泌。本发明的抗体可以是此类db。
单链抗体(也称作“scfv”)可以通过连接抗体的重链v区和轻链v区来制备(对于scfv的评述，参见pluckthun"thepharmacologyofmonoclonalantibodies"第113卷,rosenburg和moore编,springerverlag,n.y.,第269-315页(1994))。用于制备单链抗体的方法在本领域中是已知的(参见例如美国专利号4,946,778、5,260,203、5,091,513和5,455,030)。在此类scfv中，重链v区和轻链v区经由连接子、优选多肽连接子连接在一起(huston,j.s.等,proc.natl.acad.sci.u.s.a,1988,85,5879-5883)。scfv中的重链v区和轻链v区可以来源于相同抗体，或来源于不同抗体。用于接合v区的肽连接子可以是由12至19个残基组成的任何单链肽。编码scfv的dna可以通过pcr扩增，所述pcr使用整个dna或编码所需氨基酸序列的部分dna作为模板，所述dna选自编码上述抗体的重链或重链的v区的dna和编码上述抗体的轻链或轻链的v区的dna；并且使用界定两个末端的引物对。随后可以使用编码肽连接子部分的dna与界定有待分别接合至重链和轻链的dna的两个末端的引物对的组合进行进一步扩增。在构建编码scfv的dna之后，常规方法可以用于获得包含这些dna的表达载体和由这些表达载体转化的宿主。此外，scfv可以根据常规方法使用所得宿主获得。这些抗体片段可以在宿主中通过获得编码抗体片段的基因并且如上文所概述表达这些基因而产生。结合至各种类型的分子，例如聚乙二醇(peg)的抗体可以用作经过修饰的抗体。用于修饰抗体的方法已经在本领域中确立。本发明中的术语“抗体”还涵盖上文所描述的抗体。
可以将所获得的抗体纯化至均质。抗体可以通过常规用于分离和纯化蛋白质的方法来分离和纯化。抗体可以通过组合使用一种或多种适当选自以下的方法来分离和纯化：柱色谱法、过滤、超滤、盐析、透析、制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦，例如(strategiesforproteinpurificationandcharacterization:alaboratorycoursemanual,danielr.marshak等编,coldspringharborlaboratorypress(1996)；antibodies:alaboratorymanual.harlow和davidlane编,coldspringharborlaboratory,1988)。此类方法不限于上文所列的那些。色谱方法包括亲和色谱法、离子交换色谱法、疏水色谱法、凝胶过滤、反相色谱法和吸附色谱法。这些色谱方法可以使用液相色谱法，例如hplc和fplc实施。有待用于亲和色谱法中的柱包括蛋白质a柱和蛋白质g柱。举例来说，蛋白质a柱包括hyperd、poros和琼脂糖f.f.(pharmacia)。抗体还可以通过利用抗原结合，使用上面已经固定抗原的载体来纯化。
本发明的抗体可以根据标准方法配制(参见例如remington'spharmaceuticalscience,最新版,markpublishingcompany,easton,u.s.a)，并且可以包含药学上可接受的载体和/或添加剂。本发明涉及包含本发明的抗体和药学上可接受的载体和/或添加剂的组合物(包括试剂和药品)。例示性载体包括表面活性剂(例如peg和tween)、赋形剂、抗氧化剂(例如抗坏血酸)、着色剂、调味剂、防腐剂、稳定剂、缓冲剂(例如磷酸、柠檬酸和其它有机酸)、螯合剂(例如edta)、悬浮剂、等张剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动促进剂和矫味剂。然而，本发明中可以采用的载体不限于这个清单。事实上，可以适当采用其它常用载体：轻质无水硅酸、乳糖、结晶纤维素、甘露糖醇、淀粉、羧甲基纤维素钙(carmelosecalcium)、羧甲基纤维素钠(carmelosesodium)、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯醇缩乙醛二乙氨基乙酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、中链脂肪酸甘油三酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、蔗糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐，等等。组合物还可以包含其它低分子量多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶和免疫球蛋白；以及氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸和赖氨酸。当将组合物制备成注射用水溶液时，其可以包括包含例如生理盐水、葡萄糖和其它佐剂，包括例如d-山梨糖醇、d-甘露糖、d-甘露糖醇和氯化钠的等张溶液，所述等张溶液还可以含有适当增溶剂，例如，醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇和peg)和非离子洗涤剂(聚山梨醇酯80和hco-50)。
如有必要，本发明的抗体可以封装于微胶囊(由羟基纤维素、明胶、聚甲基丙烯酸甲酯等制成的微胶囊)中，并且制成胶体药物递送系统(脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)的组分(例如，参见"remington'spharmaceuticalscience16thedition",oslo编(1980))。此外，用于制造持续释放药物的方法是已知的，并且这些方法可以应用于本发明的抗体(langer等,j.biomed.mater.res.15:167-277(1981)；langer,chem.tech.12:98-105(1982)；美国专利号3,773,919；ep专利申请号58,481；sidman等,biopolymers22:547-556(1983)；ep:133,988)。
rna干扰(rnai)分子
rnai分子可以是“小干扰rna”或“短干扰rna”或“sirna”或“短发夹rna”或“shrna”或“微小rna”或“mirna”。rnai分子是靶向所关注的核酸序列，例如itga-9的核苷酸的rna双链体。如本文所用的术语“rnai分子”是涵盖shrna的子组的通用术语。“rna双链体”是指通过rna分子的两个区域之间的互补配对形成的结构。rnai分子“靶向”基因，因为rnai分子的双链体部分的核苷酸序列与所靶向的基因的核苷酸序列互补。在某些实施方案中，rnai分子靶向编码itga-9的序列。在一些实施方案中，rnai分子的双链体的长度小于30个碱基对。在一些实施方案中，双链体的长度可以是29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10个碱基对。在一些实施方案中，双链体的长度是19至25个碱基对长度。在某些实施方案中，双链体的长度是19或21个碱基对长度。rnai分子的rna双链体部分可以是发夹结构的一部分。除了双链体部分之外，发夹结构可以含有定位于形成双链体的两个序列之间的环部分。环的长度可以变化。在一些实施方案中，环的长度是5、6、7、8、9、10、11、12或13个核苷酸。在某些实施方案中，环的长度是9个核苷酸。发夹结构还可以含有3'或5'悬突部分。在一些实施方案中，悬突是0、1、2、3、4或5个核苷酸长度的3'或5'悬突。
rnai分子可以由核酸序列编码，并且核酸序列还可以包括启动子。核酸序列还可以包括多腺苷酸化信号。在一些实施方案中，多腺苷酸化信号是合成最小多腺苷酸化信号。
“敲落”、“敲落技术”是指基因沉默技术，其中靶基因的表达与引入rnai分子之前的基因表达相比减少，所述rnai分子可以使得靶基因产物的产生受抑制。术语“减少”在本文中用于指示靶基因表达降低1-100％。换句话说，可用于翻译成多肽或蛋白质的rna的量降至最低。举例来说，蛋白质的量可以减少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。在一些实施方案中，表达减少约90％(即，与尚未施用rnai分子的细胞相比在细胞中仅观测到约10％的蛋白质的量)。基因表达的敲落可以例如通过使用dsrna、sirna或mirna引导。
“rna干扰(rnai)”是由rnai分子起始的序列特异性、转录后基因沉默的过程。在rnai期间，rnai分子诱导靶mrna的降解，结果引起基因表达的序列特异性抑制。涉及使用rnai分子的rnai已经成功地应用于敲落植物、黑腹果蝇(d.melanogaster)、秀丽隐杆线虫(c.elegans)、锥虫、涡虫、水螅和若干脊椎物种(包括小鼠)中的特异性基因的表达。
根据本发明的方法，itga-9的表达可以经由rnai修饰。举例来说，可以在细胞中抑制itga-9的累积。术语“抑制”是指特定细胞中存在的转录物的数目或量的减少、降低或消除。举例来说，在细胞中通过rna干扰(rnai)可以抑制编码itga-9的mrna的累积，例如，由序列特异性双股rna(dsrna)使基因沉默，所述dsrna也被称为短干扰rna(sirna)。这些sirna可以是已经杂交在一起的两个独立的rna分子，或其可以是单一发夹，其中rna分子的两个部分已经杂交在一起以形成双链体。
术语“基因”广泛地用于指代与生物功能相关联的核酸的任何区段。因此，基因包括其表达所需要的编码序列和/或调控序列。举例来说，“基因”是指表达mrna、功能rna或特异性蛋白质的核酸片段，包括调控序列。“基因”还包括非表达的dna区段，其例如形成其它蛋白质的识别序列。“基因”可以从多种来源获得，包括从所关注的来源克隆或从已知或预测的序列信息合成，并且可以包括经过设计以具有所需参数的序列。“等位基因”是占据染色体上的给定基因座的基因的若干替代性形式之一。
术语“核酸”是指呈单股或双股形式的脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)和其聚合物，其由含有糖、磷酸和碱基的单体(核苷酸)组成，所述碱基是嘌呤或嘧啶。除非特别限制，否则这个术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有与参考核酸类似的结合特性并且以类似于天然产生的核苷酸的方式代谢。除非另外指示，否则特定核酸序列还涵盖其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)和互补序列，以及明确指示的序列。具体地说，简并密码子取代可以通过产生一个或多个所选(或所有)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来达成。“核酸片段”是给定核酸分子的一部分。
“核苷酸序列”是dna或rna的聚合物，其可以是单股或双股，任选地含有能够并入dna或rna聚合物中的合成、非天然或改变的核苷酸碱基。
术语“核酸”、“核酸分子”、“核酸片段”、“核酸序列或区段”或“多核苷酸”可互换使用并且还可以与基因、由基因编码的cdna、dna和rna互换使用。
本发明涵盖分离或大体上纯化的核酸组合物。在本发明的情形中，“分离”或“纯化”的dna分子或rna分子是远离其原生环境存在并且因此不是自然界的产物的dna分子或rna分子。分离的dna分子或rna分子可以呈纯化的形式存在或可以存在于非原生环境，例如转基因宿主细胞中。举例来说，“分离”或“纯化”的核酸分子或其生物活性部分大体上不含其它细胞物质或当通过重组技术产生时不含培养基，或当化学合成时大体上不含化学前体或其它化学品。在一个实施方案中，“分离”的核酸不含在核酸所来源的生物体的基因组dna中天然地侧接核酸的序列(即，位于核酸的5'和3'末端的序列)。举例来说，在各种实施方案中，分离的核酸分子可以含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的在核酸所来源的细胞的基因组dna中天然地侧接核酸分子的核苷酸序列。所公开的核苷酸序列的片段和变体也由本发明涵盖。“片段”或“部分”意指全长或小于全长的核苷酸序列。
“天然产生”、“原生”或“野生型”用于描述与人工产生不同的可以在自然界中发现的事物。举例来说，可以从自然界中的来源分离并且尚未在实验室中被人有意修饰的在生物体(包括病毒)中存在的蛋白质或核苷酸序列是天然产生的。
分子的“变体”是大体上类似于原生分子的序列的序列。对于核苷酸序列，变体包括由于遗传密码的简并而编码原生蛋白质的相同氨基酸序列的那些序列。例如这些的天然产生的等位基因变体可以借助于分子生物学技术来鉴别，例如，聚合酶链反应(pcr)和杂交技术。变体核苷酸序列还包括合成得到的核苷酸序列，例如，通过例如使用定点诱变产生的编码原生蛋白质的那些，以及编码具有氨基酸取代的多肽的那些。一般来说，本发明的核苷酸序列变体将与原生(内源)核苷酸序列具有至少40％、50％、60％至70％，例如71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％至79％，一般至少80％，例如81％-84％，至少85％，例如86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％至98％的序列同一性。
术语“嵌合”是指含有以下的基因或dna：1)dna序列，包括在自然界中不一起发现的调控和编码序列，或2)编码不天然毗连的蛋白质的部分的序列，或3)不天然毗连的启动子的部分。因此，嵌合基因可以包括来源于不同来源的调控序列和编码序列，或包括来源于相同来源，但以不同于自然界中发现的方式排列的调控序列和编码序列。
“转基因”是指已经通过转化引入基因组中的基因。转基因包括例如与有待转化的特定细胞的dna异源或同源的dna。另外，转基因可以包括插入非原生生物体中的原生基因，或嵌合基因。
术语“内源基因”是指在生物体的基因组中处于其天然位置中的原生基因。
“外来”基因是指已经通过基因转移引入的在宿主生物体中通常未发现的基因。
术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”在本文中可互换使用。
特定核酸序列的“保守修饰的变异”是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸序列。由于遗传密码的简并，大量功能上相同的核酸编码任何给定的多肽。举例来说，密码子cgt、cgc、cga、cgg、aga和agg全部编码氨基酸精氨酸。因此，在精氨酸由密码子指定的每个位置处，密码子可以变成在不改变所编码的蛋白质的情况下描述的对应的密码子中的任一个。此类核酸变异是“沉默变异”，其为“保守修饰的变异”的一个种类。除非另外注明，否则编码多肽的本文所描述的每个核酸序列还描述每个可能的沉默变异。本领域技术人员将认识到，可以通过标准技术修饰核酸中的每个密码子(通常是甲硫氨酸的唯一密码子的atg除外)以得到功能上相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个“沉默变异”隐含在每个所描述的序列中。
“重组dna分子”是使用例如sambrook和russell(2001)所描述的用于将dna序列连接在一起的重组dna技术和程序而连接在一起的dna序列的组合。
术语“异源基因”、“异源dna序列”、“外源dna序列”、“异源rna序列”、“外源rna序列”或“异源核酸”各自是指源于对于特定宿主细胞来说是外来的来源，或来自相同来源但从其原始或原生形式修饰的序列。因此，宿主细胞中的异源基因包括对于特定宿主细胞来说是内源的，但已经通过例如使用dna改组而修饰的基因。这些术语还包括天然产生的dna或rna序列的非天然产生的多个拷贝。因此，这些术语是指对于细胞来说是外来或异源的，或对于细胞来说是同源的但在宿主细胞核酸内处于通常未发现所述元件的位置中的dna或rna区段。表达外源dna区段以得到外源多肽。
“同源”dna或rna序列是与引入其的宿主细胞天然相关联的序列。
“野生型”是指在自然界中发现的正常基因或生物体。
“基因组”是指生物体的完整遗传物质。
“载体”定义为尤其包括任何病毒载体，以及任何质粒、粘粒、噬菌体或呈双股或单股线性或环状形式的二元载体，所述载体可能或可能不可自传递或可移动，并且可以通过整合至细胞基因组中来转化原核或真核宿主或存在于染色体外(例如，具有复制起点的自主复制质粒)。
如本文所用的“表达盒”意指能够在适当宿主细胞中引导特定核苷酸序列的表达的核酸序列，其可以包括可操作地连接至所关注的核苷酸序列的启动子，所述核苷酸序列可以可操作地连接至终止信号。编码区通常编码所关注的功能rna，例如rnai分子。包括所关注的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的。表达盒还可以是天然产生的，但已经以适用于异源表达的重组形式获得的表达盒。表达盒中核苷酸序列的表达可以在组成型启动子的控制下或在仅当宿主细胞暴露于某种特定刺激物时起始转录的可调控启动子的控制下。在多细胞生物体的情况下，启动子也可以对特定组织或器官或发育阶段有特异性。
此类表达盒可以包括连接至所关注的核苷酸序列的转录起始区。此种表达盒具有多个用于在调控区的转录调控下插入所关注的基因的限制位点。表达盒另外可以含有可选择标志基因。
“编码序列”是指编码特异性氨基酸序列的dna或rna序列。其可以构成“不间断编码序列”，即，缺乏内含子，例如在cdna中，或其可以包括一个或多个由适当剪接接头结合的内含子。“内含子”是包含在初级转录物中，但通过细胞内rna的裂解和再接合而去除以建立可以翻译成蛋白质的成熟mrna的rna序列。
术语“开放阅读框架”(orf)是指在编码序列的翻译起始与终止密码子之间的序列。术语“起始密码子”和“终止密码子”是指在编码序列中分别指定蛋白质合成(mrna翻译)的起始和链终止的三个相邻核苷酸的单位(‘密码子’)。
“功能rna”是指可能未翻译，但仍对至少一个细胞过程具有作用的正义rna、反义rna、核酶rna、sirna或其它rna。
术语“rna转录物”或“转录物”是指由rna聚合酶催化的dna序列转录产生的产物。当rna转录物是dna序列的完美互补的拷贝时，其被称作初级转录物，或其可以是来源于初级转录物的转录后加工的rna序列并且被称作成熟rna。“信使rna”(mrna)是指不含内含子并且可以由细胞翻译成蛋白质的rna。“cdna”是指与mrna互补并且来源于mrna的单股或双股dna。
“调控序列”是位于编码序列的上游(5'非编码序列)、内部或下游(3'非编码序列)并且影响相关联的编码序列的转录、rna加工或稳定性、或翻译的核苷酸序列。调控序列包括增强子、启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化信号序列。调控序列包括天然和合成序列以及可以是合成和天然序列的组合的序列。如上文所注明，术语“适合的调控序列”不限于启动子。然而，适用于本发明中的一些适合的调控序列将包括但不限于组成型启动子、组织特异性启动子、发育特异性启动子、可调控启动子和病毒启动子。
“5'非编码序列”是指位于编码序列的5'处(上游)的核苷酸序列。其存在于起始密码子上游的完全加工的mrna中并且可以影响初级转录物加工成mrna、mrna稳定性或翻译效率。
“3'非编码序列”是指位于编码序列的3'处(下游)的核苷酸序列并且可以包括多腺苷酸化信号序列和编码能够影响mrna加工或基因表达的调控信号的其它序列。多腺苷酸化信号通常特征为影响多腺苷酸束添加至mrna前体的3'末端。
术语“翻译前导序列”是指在启动子与编码序列之间的基因的dna序列部分，其被转录成rna并且存在于翻译起始密码子上游(5')的完全加工的mrna中。翻译前导序列可以影响初级转录物加工成mrna、mrna稳定性或翻译效率。
术语“成熟”蛋白质是指不含信号肽的翻译后加工的多肽。“前体”蛋白质是指mrna翻译的初级产物。“信号肽”是指多肽的氨基端延伸，其与形成前体肽的多肽联合翻译并且是多肽进入分泌路径中所需要的。术语“信号序列”是指编码信号肽的核苷酸序列。
“启动子”是指通常在编码序列上游(5')的核苷酸序列，其通过为rna聚合酶提供识别并且提供适当转录所需要的其它因子来引导和/或控制编码序列的表达。“启动子”包括最小启动子，其为由用以指定转录起始位点的tata框和其它序列组成的短dna序列，向其中添加调控元件用于控制表达。“启动子”还指包括最小启动子加上调控元件的核苷酸序列，其能够控制编码序列或功能rna的表达。这种类型的启动子序列由近端和更远端的上游元件组成，后面的元件常常被称作增强子。因此，“增强子”是可以刺激启动子活性并且可以是启动子的固有元件或被插入以增强启动子的水平或组织特异性的异源元件的dna序列。增强子能够以两种定向(正常或翻转)操作并且能够甚至当从启动子向上游或下游移动时起作用。增强子与其它上游启动子元件都结合介导其作用的序列特异性dna结合蛋白质。启动子可以全部来源于原生基因，或由来源于自然界中发现的不同启动子的不同元件组成，或甚至由合成dna区段组成。启动子还可以含有蛋白质因子的结合中所涉及的dna序列，其响应生理或发育状况来控制转录起始的效力。可以用于本发明中的启动子的实例包括小鼠u6rna启动子、合成人类h1rna启动子、sv40、cmv、rsv、rna聚合酶ii和rna聚合酶iii启动子。
“起始位点”是围绕作为转录的序列的一部分的第一核苷酸的位置，其也被定义为位置+1。关于这个位点，将基因和其控制区的所有其它序列编号。下游序列(即，在3'方向上的其它蛋白质编码序列)命名为正的，而下游序列(主要是在5'方向上的控制区)命名为负的。
非活性的或在无上游活化的情况下具有大大降低的启动子活性的启动子元件、尤其tata元件，被称作“最小或核心启动子”。在适合的转录因子存在下，最小启动子起作用以允许转录。“最小或核心启动子”因此仅由转录起始所需的所有基本元件组成，例如，tata框和/或起始子。
“组成型表达”是指使用组成型或调控型启动子的表达。“条件型”和“调控型表达”是指由调控型启动子控制的表达。
“可操作地连接”是指单一核酸片段上的核酸序列的关联以使得这些序列中的一个序列的功能受另一个序列影响。举例来说，调控dna序列被称为与编码rna或多肽的dna序列“可操作地连接”或“关联”，条件是这两个序列经过定位以使得调控dna序列影响编码dna序列的表达(即，编码序列或功能rna处于启动子的转录控制下)。编码序列可以可操作地连接至呈正义或反义定向的调控序列。
“表达”是指细胞中内源基因、异源基因或核酸区段、或转基因的转录和/或翻译。举例来说，在sirna构建体的情况下，表达可以指仅sirna的转录。另外，表达是指正义(mrna)或功能rna的转录和稳定累积。表达还可以指蛋白质的产生。
“改变的水平”是指不同于正常或未转化的细胞或生物体的水平的转基因细胞或生物体中的表达水平。
“过度表达”是指超过正常或未转化的细胞或生物体中的表达水平的转基因细胞或生物体中的表达水平。
“反义抑制”是指能够抑制来自内源基因或转基因的蛋白质的表达的反义rna转录物的产生。
“转录终止片段”是指能够终止转录的含有一个或多个调控信号，例如多腺苷酸化信号序列的核苷酸序列。实例包括编码胭脂碱合成酶的基因的3'非调控区和核酮糖二磷酸羧化酶的小亚单位。
“翻译终止片段”是指能够终止翻译的在所有三个框架中含有一个或多个调控信号，例如一个或多个终止密码子的核苷酸序列。邻近或接近于在编码序列的5'末端处的起始密码子插入翻译终止片段将导致无翻译或不当翻译。通过位点特异性重组删除翻译终止片段将在编码序列中留下不干扰使用起始密码子的适当翻译的位点特异性序列。
术语“顺式作用序列”和“顺式作用元件”是指dna或rna序列，其功能需要其处于同一分子上。复制子上的顺式作用序列的一个实例是病毒复制起点。
术语“反式作用序列”和“反式作用元件”是指dna或rna序列，其功能不需要其处于同一分子上。
“染色体整合”是指外来基因或核酸构建体由共价键整合至宿主dna中。在基因并未“染色体整合”的情况下，其可以“瞬时表达”。基因的瞬时表达是指未整合至宿主染色体中，但独立地充当例如自主复制质粒或表达盒的一部分或充当另一个生物系统(例如病毒)的一部分的基因的表达。
以下术语用于描述两个或更多个核酸或多核苷酸之间的序列关系：(a)“参考序列”，(b)“比较窗口”，(c)“序列同一性”，(d)“序列同一性百分比”，以及(e)“大体同一性”。
(a)如本文所用的“参考序列”是用作序列比较的基础的定义序列。参考序列可以是指定序列的子组或整体；例如，作为全长cdna或基因序列的区段，或完整cdna或基因序列。
(b)如本文所用的“比较窗口”提及多核苷酸序列的相连和指定区段，其中比较窗口中的多核苷酸序列与参考序列(不包含添加或缺失)相比可以包含添加或缺失(即，空位)用于两个序列的最佳比对。一般来说，比较窗口的长度是至少20个相连核苷酸，并且任选地可以是30个、40个、50个、100个或更长。本领域技术人员了解，为了避免由于多核苷酸序列中包括空位而与参考序列高度相似，通常引入空位罚分并且从匹配数目中扣除。
用于比较的序列的比对方法在本领域中是众所周知的。因此，任何两个序列之间的同一性百分比的确定可以使用数学算法来完成。
这些数学算法的计算机实施可以用于序列比较以确定序列同一性。此类实施包括但不限于：pc/gene程序(可获自intelligenetics,mountainview,california)中的clustal；align程序(版本2.0)，以及wisconsingenetics软件包版本8(可获自geneticscomputergroup(gcg),575sciencedrive,madison,wisconsin,usa)中的gap、bestfit、blast、fasta和tfasta。使用这些程序的比对可以使用缺省参数执行。
用于执行blast分析的软件通过国家生物技术信息中心公开可用。这种算法涉及首先通过鉴别查询序列中长度w的短字来鉴别高分序列对(hsp)，所述短字当与数据库序列中相同长度的字比对时匹配或满足某一正值阈值分数t。t被称作邻域字分数阈值。这些初始邻域字击中充当种子用于起始搜索以发现含有其的更长hsp。字击中然后在两个方向上沿着每个序列延伸直到累计比对分数可以增加。对于核苷酸序列，使用参数m(一对匹配残基的奖励分数；始终>0)和n(错配残基的处罚分数；始终<0)计算累计分数。对于氨基酸序列，计分矩阵用于计算累计分数。当累计比对分数从其最大达成值下降了数量x，累计分数由于一个或多个负分残基比对的累积而归于零或低于零，或到达任一个序列的末端时，停止字击中在每个方向上的延伸。
除了计算序列同一性百分比之外，blast算法还执行两个序列之间的相似性的统计分析。由blast算法提供的相似性的一个量度是最小和概率(p(n))，其提供了两个核苷酸序列之间的匹配将偶然发生的概率的指示。举例来说，如果在测试核酸序列与参考核酸序列的比较中的最小和概率小于约0.1、更优选小于约0.01并且最优选小于约0.001，那么测试核酸序列被认为与参考序列相似。
为了获得空位比对用于比较目的，可以利用空位blast(在blast2.0中)。或者，psi-blast(在blast2.0中)可以用于执行检测分子之间的远缘关系的迭代搜索。当利用blast、空位blast、psi-blast时，可以使用相应程序(例如，用于核苷酸序列的blastn)的缺省参数。blastn程序(用于核苷酸序列)使用字长(w)11、期望值(e)10、截止值100、m＝5、n＝-4作为缺省值，并且使用两个股的比较。比对还可以通过检视手动执行。
出于本发明的目的，用于确定与本文所公开的启动子序列的序列同一性百分比的核苷酸序列的比较优选地使用blastn程序(版本1.4.7或更新版本)以其缺省参数或任何等效程序来进行。“等效程序”意图为对于讨论中的任何两个序列，当与由优选程序产生的对应的比对相比较时产生具有相同核苷酸匹配和相同序列同一性百分比的比对的任何序列比较程序。
(c)如本文所用的“序列同一性”或“同一性”在两个核酸序列的情形中提及如通过序列比较算法或通过目测检视测量，当在指定比较窗口上比对最大对应时在两个序列中相同的核苷酸的指定百分比。
(d)如本文所用的“序列同一性百分比”意指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列确定的值，其中在比较窗口中的多核苷酸序列的部分与参考序列(不包含添加或缺失)相比可以包含添加或缺失(即，空位)用于两个序列的最佳比对。百分比是通过以下方式计算：确定相同核酸碱基或氨基酸残基在两个序列中出现的位置的数目以得到匹配位置的数目，用匹配位置的数目除以比较窗口中的位置的总数，以及用结果乘以100以得到序列同一性百分比。
(e)术语多核苷酸序列的“大体同一性”意指多核苷酸包含使用所描述的比对程序之一使用标准参数与参考序列相比，具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％或79％，优选至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％，更优选至少90％、91％、92％、93％或94％，并且最优选至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列。
核苷酸序列大体上相同的另一个指示是两个分子是否在严格条件下彼此杂交。一般来说，严格条件被选为比在规定的离子强度和ph值下特异性序列的热力学熔点(tm)约低5℃。然而，严格条件涵盖约1℃至约20℃的范围内的温度，这取决于如本文另外限定的所需严格度。
对于序列比较，通常一个序列充当与测试序列比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机中，如有必要指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。序列比较算法然后基于指定的程序参数计算一个或多个测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
如上文所注明，两个核酸序列大体上相同的另一个指示是两个分子在严格条件下彼此杂交。短语“特异性地杂交至”是指当那个序列存在于复杂混合物(例如总细胞)dna或rna中时，在严格条件下分子仅结合、双联或杂交至特定核苷酸序列。“大体上结合”是指探针核酸与靶核酸之间的互补杂交并且包涵少量错配，所述错配可以通过降低杂交介质的严格度来容纳以达成靶核酸序列的所需检测。
“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”在例如南方和北方杂交的核酸杂交实验的情形中是序列依赖性的，并且在不同实验参数下是不同的。更长序列在更高温度下特异性地杂交。tm是50％的靶序列杂交至完美匹配的探针的温度(在规定的离子强度和ph值下)。特异性通常是杂交后洗涤的函数，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于dna-dna杂交体，tm可以从meinkoth和wahl的方程式近似得出：
tm81.5℃+16.6(logm)+0.41(％gc)-0.61(％form)-500/l；
其中m是一价阳离子的摩尔浓度，％gc是dna中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form是杂交溶液中甲酰胺的百分比，并且l是碱基对中杂交体的长度。tm对于每个1％的错配降低约1℃；因此，可以调整tm、杂交和/或洗涤条件以杂交至所需同一性的序列。举例来说，如果寻找具有>90％同一性的序列，那么tm可以降低10℃。一般来说，严格条件被选为比在规定的离子强度和ph值下特异性序列和其补体的热力学熔点(tm)约低5℃。然而，重度严格条件可以利用在比tm低1、2、3或4℃下的杂交和/或洗涤；中度严格条件可以利用在比tm低6、7、8、9或10℃下的杂交和/或洗涤；低严格度条件可以利用在比tm低11、12、13、14、15或20℃下的杂交和/或洗涤。使用方程式、杂交和洗涤组合物以及所需的t，普通技术人员将了解，固有地描述了杂交和/或洗涤溶液的严格度的变化。如果所需的错配程度得到小于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)的t，那么优选的是增加ssc浓度以便可以使用更高温度。一般来说，高度严格的杂交和洗涤条件被选为比在规定的离子强度和ph值下特异性序列的tm约低5℃。
高度严格的洗涤条件的一个实例是0.15mnacl在72℃下持续约15分钟。严格洗涤条件的一个实例是在65℃下0.2xssc洗涤15分钟(对于ssc缓冲液的描述，参见sambrook和russell2001)。高严格度洗涤之前常常有低严格度洗涤以去除背景探针信号。对于短核酸序列(例如约10至50个核苷酸)，严格条件通常涉及在ph7.0至8.3下小于约1.5m、更优选约0.01至1.0mna离子浓度(或其它盐)的盐浓度，并且温度通常是至少约30℃。严格条件也可以通过添加例如甲酰胺的去稳定剂来达成。一般来说，在特定杂交测定中对于无关探针所观测到的2倍(或更高)的信噪比指示检测到特异性杂交。极严格条件被选为等于特定核酸分子的tm。
极严格条件被选为等于特定探针的tm。在南方或北方印迹法中在过滤器上具有多于100个互补残基的互补核酸的杂交的严格条件的一个实例是50％甲酰胺，例如在37℃下在50％甲酰胺、1mnacl、1％sds中杂交，以及在60至65℃下在0.1xssc中洗涤。例示性低严格度条件包括在37℃下用30％至35％甲酰胺、1mnacl、1％sds(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液杂交，以及在50至55℃下在1x至2xssc(20xssc＝3.0mnacl/0.3m柠檬酸三钠)中洗涤。例示性中严格度条件包括在37℃下在40％至45％甲酰胺、1.0mnacl、1％sds中杂交，以及在55至60℃下在0.5x至1xssc中洗涤。
术语“转化”是指核酸片段转移至宿主细胞的基因组中，得到基因稳定的遗传。“宿主细胞”是已经由外源核酸分子转化，或能够由外源核酸分子转化的细胞。含有转化的核酸片段的宿主细胞被称作“转基因”细胞。
“转化”、“转导”、“转基因”和“重组”是指已经引入异源核酸分子的宿主细胞。如本文所用的术语“转染”是指dna递送至真核(例如哺乳动物)细胞中。术语“转化”在本文中用于指代dna递送至原核(例如大肠杆菌)细胞中。术语“转导”在本文中用于指代用病毒粒子感染细胞。核酸分子可以稳定地整合至本领域中一般已知的基因组中。已知的pcr方法包括但不限于使用以下引物的方法：成对引物、巢式引物、单一特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物，等等。举例来说，“转化”、“转化体”和“转基因”细胞已经通过转化过程并且含有整合至其染色体中的外来基因。术语“未转化”是指尚未通过转化过程的正常细胞。
“基因改变的细胞”表示已经通过引入重组或异源核酸(例如一个或多个dna构建体或其rna配对物)而修饰的细胞并且还包括保留此种基因修饰的一部分或全部的此类细胞的子代。
如本文所用的关于核苷酸分子的术语“源自”或“针对”意指这个分子与所关注的特定分子具有互补序列同一性。
“基因沉默”是指基因表达，例如转基因、异源基因和/或内源基因表达的抑制。基因沉默可以通过影响转录的过程和/或通过影响转录后机制的过程介导。在一些实施方案中，当sirna起始所关注的基因的mrna经由rna干扰以序列特异性方式降解时发生基因沉默。在一些实施方案中，基因沉默可以是等位基因特异性的。“等位基因特异性”基因沉默是指基因的一个等位基因的特异性沉默。
“敲落”、“敲落技术”是指基因沉默技术，其中靶基因的表达与引入rnai分子之前的基因表达相比减少，所述rnai分子可以使得靶基因产物的产生受抑制。术语“减少”在本文中用于指示靶基因表达降低1-100％。举例来说，表达可以减少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或甚至99％。基因表达的敲落可以通过使用dsrna或sirna引导。举例来说，可以涉及使用sirna的“rna干扰(rnai)”已经成功地应用于敲落植物、黑腹果蝇、秀丽隐杆线虫、锥虫、涡虫、水螅和若干脊椎物种(包括小鼠)中的特异性基因的表达。
“rna干扰(rnai)”是由sirna起始的序列特异性、转录后基因沉默的过程。rnai在例如果蝇、线虫、真菌和植物的许多生物体中可见，并且被认为涉及于抗病毒防御、转座子活性的调节和基因表达的调控中。在rnai期间，rnai分子诱导靶mrna的降解，结果引起基因表达的序列特异性抑制。
“小干扰”或“短干扰rna”或sirna是靶向所关注的基因的核苷酸的rna双链体。“rna双链体”是指通过rna分子的两个区域之间的互补配对形成的结构。sirna“靶向”基因，因为sirna的双链体部分的核苷酸序列与所靶向的基因的核苷酸序列互补。在一些实施方案中，sirna的双链体的长度小于30个核苷酸。在一些实施方案中，双链体的长度可以是29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10个核苷酸。在一些实施方案中，双链体的长度是19-25个核苷酸长度。sirna的rna双链体部分可以是发夹结构的一部分。除了双链体部分之外，发夹结构可以含有定位于形成双链体的两个序列之间的环部分。环的长度可以变化。在一些实施方案中，环的长度是5、6、7、8、9、10、11、12或13个核苷酸。发夹结构还可以含有3'或5'悬突部分。在一些实施方案中，悬突是0、1、2、3、4或5个核苷酸长度的3'或5'悬突。“正义”和“反义”序列可以与或不与环区一起使用以形成sirna分子。如本文所用的术语sirna意味着等效于用于描述能够介导序列特异性rnai的核酸分子的其它术语，例如，双股rna(dsrna)、微小rna(mirna)、短发夹rna(shrna)、短干扰寡核苷酸、短干扰核酸、转录后基因沉默rna(ptgsrna)，等等。另外，如本文所用的术语rnai意味着等效于用于描述序列特异性rna干扰，例如转录后基因沉默、翻译抑制或表观遗传沉默的其它术语。举例来说，本发明的sirna分子可以用于使转录后水平或转录前水平下的基因表观遗传沉默。在一个非限制性实例中，由本发明的sirna分子对基因表达的表观遗传调节可以由sirna介导的染色质结构或甲基化模式的修饰引起以改变基因表达。在另一个非限制性实例中，由本发明的sirna分子对基因表达的调节可以由sirna介导的rna(编码或非编码rna)经由risc的裂解或替代地如本领域中已知的翻译抑制引起。
sirna可以由核酸序列编码，并且核酸序列还可以包括启动子。核酸序列还可以包括多腺苷酸化信号。在一些实施方案中，多腺苷酸化信号是合成最小多腺苷酸化信号。
如本文所用的“治疗”是指改善疾病或疾患的至少一种症状、治愈疾病或疾患和/或预防疾病或疾患的发展。
本发明的rnai分子可以通过本领域中已知的任何方法，例如通过试管内转录、重组或通过合成方式产生。在一个实例中，rnai分子可以在试管内通过使用例如t7rna聚合酶的重组酶和dna寡核苷酸模板产生。
本发明的核酸分子
术语“分离和/或纯化”是指在试管内例如dna或rna分子的核酸从其天然细胞环境以及从与细胞的其它组分(例如核酸或多肽)的关联中分离，以便可以对其进行测序、复制和/或表达。举例来说，“分离的核酸”可以是转录成rnai分子的含有小于31个连续核苷酸的dna分子。此种分离的rnai分子可以例如与21个碱基对长度的双链体形成发夹结构，所述双链体与所关注的基因中的序列互补或杂交，并且在严格条件(如通过本领域中众所周知的方法定义，例如在sambrook和russell,2001中)下保持稳定结合。因此，rna或dna是“分离”的，因为其不含至少一种在rna或dna的天然来源中通常与其相关联的污染核酸，并且优选地大体上不含任何其它哺乳动物rna或dna。短语“不含至少一种通常与其相关联的污染来源核酸”包括将核酸再引入来源或天然细胞中但处于不同染色体位置中或以其它方式由来源细胞中，例如载体或质粒中通常未发现的核酸序列侧接的情况。
除了编码sirna的dna序列之外，本发明的核酸分子包括双股干扰rna分子，其也适用于抑制靶基因的表达。
如本文所用的术语“重组核酸”，例如“重组dna序列或区段”是指已经源自任何适当细胞来源或从所述来源分离的核酸，例如dna，随后可以在试管内对其进行化学改变，以使得其序列不是天然产生的，或对应于不如在尚未用外源dna转化的基因组中将定位的一样定位的天然产生的序列。“源自”来源的预选dna的一个实例将是鉴别为给定的生物体中的有用片段并且然后以基本上纯的形式化学合成的dna序列。从来源“分离”的此种dna的一个实例将是有用的dna序列，其通过化学方式，例如通过使用限制性核酸内切酶从所述来源取出或移出，以便可以通过基因工程改造的方法对其进行进一步操作，例如扩增，以供用于本发明中。
因此，给定的dna片段从限制性消化物中的回收或分离可以采用在聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶上通过电泳分离消化物，通过比较所关注的片段的迁移率对比已知分子量的标志dna片段的迁移率来鉴别所述片段，移出含有所需片段的凝胶部分，以及使凝胶与dna分离。因此，“重组dna”包括完全合成dna序列、半合成dna序列、从生物来源分离的dna序列和来源于rna的dna序列，以及其混合物。
具有碱基取代的核酸分子(即，变体)是通过本领域中已知的多种方法制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然产生的序列变体的情况下)，或通过核酸分子的早期制备的变体或非变体型式的寡核苷酸介导的(或定点)诱变、pcr诱变和盒式诱变制备。
寡核苷酸介导的诱变是用于制备取代变体的方法。简单地说，编码sirna的核酸可以通过使编码所需突变的寡核苷酸杂交至dna模板而改变，其中所述模板是含有未改变的或原生基因序列的质粒或噬菌体的单股形式。在杂交之后，dna聚合酶用于合成模板的整个第二互补股，由此将并入寡核苷酸引物，并且将编码在编码sirna的核酸中的所选变化。一般来说，使用至少25个核苷酸长度的寡核苷酸。最佳的寡核苷酸将具有与编码突变的一个或多个核苷酸的任一侧上的模板完全互补的12至15个核苷酸。这确保了寡核苷酸将适当杂交至单股dna模板分子。寡核苷酸是使用本领域中已知的技术容易地合成。
dna模板可以由来源于噬菌体m13载体(可商购的m13mp18和m13mp19载体是适合的)的那些载体，或含有单股噬菌体复制起点的那些载体产生。因此，可以将有待突变的dna插入这些载体之一中以产生单股模板。单股模板的产生在sambrook和russell,2001的第3章中描述。或者，单股dna模板可以通过使用标准技术使双股质粒(或其它)dna变性来产生。
对于原生dna序列的改变(例如，以产生氨基酸序列变体)，在适合的杂交条件下使寡核苷酸杂交至单股模板。然后添加dna聚合酶，通常是dna聚合酶i的克列诺片段(klenowfragment)，以使用寡核苷酸作为用于合成的引物来合成模板的互补股。由此形成异源双链体分子以使得dna的一股编码dna的突变形式，并且另一股(原始模板)编码dna的原生、未改变的序列。然后使这种异源双链体分子转化至适合的宿主细胞中，通常是原核细胞，例如大肠杆菌jm101。在细胞生长之后，将其涂于琼脂糖板上并且使用32-磷酸放射性标记的寡核苷酸引物筛选以鉴别含有突变的dna的细菌菌落。然后移出突变区并且置于适当载体中，一般是通常用于适当宿主转化的类型的表达载体。
可以修改上文刚刚描述的方法以便建立同源双链体分子，其中质粒的两个股都含有一个或多个突变。修改如下：使单股寡核苷酸粘接至如上文所描述的单股模板。三种脱氧核糖核苷酸，脱氧核糖腺苷(datp)、脱氧核糖鸟苷(dgtp)和脱氧核糖胸苷(dttp)的混合物与称为dctp-(*s)的经过修饰的硫代脱氧核糖胞嘧啶(其可以获自amershamcorporation)组合。将这种混合物添加至模板-寡核苷酸复合物中。将dna聚合酶添加至这种混合物中之后，产生除了突变的碱基以外与模板相同的dna股。另外，这种新的dna股将含有dctp-(*s)而非dctp，其用以保护dna免于限制性核酸内切酶消化。
在用适当的限制酶将双股异源双链体的模板股切口之后，可以用exoiii核酸酶或另一种适当的核酸酶越过含有有待诱变的一个或多个位点的区域来消化模板股。然后终止反应以留下仅部分是单股的分子。然后在所有四种脱氧核糖核苷酸三磷酸、atp和dna接合酶存在下使用dna聚合酶形成完整双股dna同源双链体。然后可以使这种同源双链体分子转化至适合的宿主细胞，例如大肠杆菌jm101中。
存在完善确立的标准用于设计sirna。然而，因为用于抑制基因表达的sirna的机制并未完全了解并且选自相同基因的不同区域的sirna并不同等有效地起作用，所以常常必须同时产生许多sirna以比较其效力。
可经受本发明的方法的疾病和疾患
在本发明的某些实施方案中，本发明的表达盒的哺乳动物接受者患有可经受基因沉默疗法的疾患。如本文所用的“基因沉默疗法”是指向接受者施用编码治疗性sirna的外源核酸物质以及随后原位表达所施用的核酸物质。因此，短语“可经受sirna疗法的疾患”包涵以下疾患：例如基因疾病(即，可归因于一个或多个基因缺陷的疾病病状)、后天性病变(即，不可归因于先天性缺陷的病理性疾患)、癌症，和预防性过程(即，预防疾病或非所需的医疗状况)。“与疾患相关联”的基因是作为有待治疗的疾患的病因或病因的一部分的基因。此类基因的实例包括与itga-9相关联的基因。从病毒载体表达的sirna也可以使用所描述的载体系统用于体内抗病毒疗法。
因此，如本文所用的术语“治疗性sirna”是指对接受者具有有益作用的任何sirna。因此，“治疗性sirna”包涵治疗性与预防性sirna。
配方和施用方法
优选地施用本发明的药剂以使得与疾病相关联的至少一种症状减轻。所施用的量将取决于各种因素而变化，包括但不限于所选组合物、特定疾病、哺乳动物的体重、身体状况和年龄，以及有待达成预防还是治疗。
本发明设想通过施用药剂，例如抗体或抗体片段来治疗哺乳动物中的lg。根据本发明的治疗剂的施用可以是连续或间歇的，这取决于例如接受者的生理状况，施用的目的是治疗性还是预防性的，以及熟练的从业者所知的其它因素。本发明的药剂的施用可以在预选的时间段上是基本上连续的或可以按一系列间隔的剂量。预期局部与全身施用。
对于体内使用，如本文所描述的治疗剂一般在施用前并入药物组合物中。在此类组合物内，一种或多种如本文所描述的治疗性化合物作为一种或多种活性成分存在(即，如使用代表性测定所测量，以足以对囊性纤维化的症状提供统计上显著作用的水平存在)。药物组合物包含与任何一种或多种药学上可接受的载体组合的一种或多种此类化合物，所述载体为本领域技术人员所知适合于特定施用模式。另外，其它药学活性成分(包括其它治疗剂)可以但不必须存在于组合物内。
关于治疗疾病病况/病状的术语“治疗有效量”是指单独的或药物组合物中所含的化合物的量，当其作为单次剂量或以多次剂量施用时能够对疾病病况/病状的任何症状、方面或特征具有任何可检测的积极作用。此种作用并不必须是绝对有益的。
如本文所用的术语“治疗(treat/treatment)”包括在疾病病况/病状的临床症状发作之前施用化合物以预防任何症状，以及在疾病病况/病状的临床症状发作之后施用化合物以减轻或消除疾病病况/病状的任何症状、方面或特征。此种治疗并不必须是绝对有用的。
在某些实施方案中，本发明治疗剂与药学上可接受的媒剂，例如惰性稀释剂或可同化的可食用载体组合可以全身施用，例如经口。可以将其密封于硬壳或软壳明胶胶囊中，可以压成片剂，或可以直接与患者膳食的食物合并。对于经口治疗性施用，活性化合物可以与一种或多种赋形剂组合并且以可摄取的片剂、颊含片剂、糖锭、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、糯米纸等形式使用。此类组合物和制剂应含有至少0.1％的活性化合物。组合物和制剂的百分比当然可以变化并且可以适宜地介于给定的单位剂型重量的约2％至约60％之间。此类治疗上有用的组合物中的活性化合物的量使得将获得有效剂量水平。
片剂、糖锭、丸剂、胶囊等等还可以含有以下物质：粘合剂，例如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，例如磷酸二钙；崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等等；润滑剂，例如硬脂酸镁；以及甜味剂，例如蔗糖、果糖、乳糖或阿斯巴甜；或可以添加调味剂，例如薄荷、冬青油或樱桃调味剂。当单位剂型是胶囊时，除了上述类型的物质之外，其可以含有液体载体，例如植物油或聚乙二醇。各种其它物质可以作为包衣存在或以其它方式改变固体单位剂型的实体形式。举例来说，片剂、丸剂或胶囊可以用明胶、蜡、虫胶或糖等等包覆。糖浆或酏剂可以含有活性化合物、蔗糖或果糖作为甜味剂、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯作为防腐剂、染料和调味剂，例如樱桃或橙香精。当然，用于制备任何单位剂型的任何物质应该是药学上可接受的并且以所采用的量是大体上无毒的。另外，活性化合物可以并入持续释放制剂和装置中。
活性化合物还可以通过注射或输注(例如静脉内、皮下或腹膜内)施用。活性化合物或其盐的溶液可以在水中制备，任选地与无毒表面活性剂混合。还可以在甘油、液体聚乙二醇、三醋精和其混合物中以及在油中制备分散体。在储存和使用的一般条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。
适合于注射或输注的药物剂型可以包括无菌水溶液或分散体或包含活性成分的无菌粉末，所述粉末适于临时制备无菌可注射或可输注溶液或分散体，任选地封装于脂质体中。在所有情况下，最终剂型在制造和储存的条件下应该是无菌、流体和稳定的。液体载体或媒剂可以是溶剂或液体分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等等)、植物油、无毒甘油酯和其适合的混合物。适当流动性可以例如通过形成脂质体、在分散体的情况下通过维持所需粒度、或通过使用表面活性剂来维持。防止微生物的作用可以由各种抗细菌剂和抗真菌剂达成，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等等。在许多情况下，将优选地包括等张剂，例如糖、缓冲剂或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中使用延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶来达成。
通过将活性化合物以所需量在适当溶剂中与上文所列举的各种其它成分合并，根据需要继之以过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其得到存在于先前无菌过滤的溶液中的活性成分加上任何额外所需成分的粉末。
对于表面施用，本发明化合物可以按纯的形式施加，即，当其为液体时。然而，一般需要将其与皮肤学上可接受的载体组合作为组合物或配方施用于皮肤，所述载体可以是固体或液体。
适用的固体载体包括细碎的固体，例如滑石、粘土、微晶纤维素、二氧化硅、氧化铝等等。适用的液体载体包括水、醇或二元醇或水-醇/二元醇掺合物，本发明化合物可以在有效的水平下溶解或分散于其中，任选地借助于无毒表面活性剂。可以添加例如香料和额外抗微生物剂的佐剂以优化用于给定用途的特性。所得液体组合物可以从吸收垫施加，用于浸渍绷带和其它敷料，或使用泵型或气雾剂喷雾器喷射至受影响区域上。
例如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐和酯、脂肪醇、改性纤维素或改性矿物材料的增稠剂也可以与液体载体一起采用以形成可涂抹的糊剂、凝胶、软膏、皂剂等等，用于直接施加至使用者的皮肤。
可以用于将本发明的化合物递送至皮肤的适用的皮肤学组合物的实例为本领域所知；例如，参见jacquet等(美国专利号4,608,392)、geria(美国专利号4,992,478)、smith等(美国专利号4,559,157)和wortzman(美国专利号4,820,508)。
本发明化合物的适用剂量可以通过比较其试管内活性与动物模型中的体内活性来确定。用于将小鼠和其它动物中的有效剂量外推至人类的方法为本领域所知；例如，参见美国专利号4,938,949。
一般来说，例如洗剂的液体组合物中本发明的一种或多种化合物的浓度将为约0.1-25wt％、优选约0.5-10wt％。例如凝胶或粉末的半固体或固体组合物中的浓度将为约0.1-5wt％、优选约0.5-2.5wt％。
用于治疗所需的化合物或其活性盐或衍生物的量将不仅随着所选的特定盐，而且随着施用途径、所治疗的疾患的性质以及患者的年龄和状况而变化，并且将最终由巡诊医师或临床医师决定。
一般来说，然而，适合的剂量将在约0.5至约100毫克/公斤，例如约10至约75毫克/公斤体重/天，例如3至约50毫克/公斤接受者体重/天的范围内，优选地在6至90毫克/公斤/天的范围内，最优选地在15至60毫克/公斤/天的范围内。
化合物适宜以单位剂型施用；例如，每单位剂型含有5至1000mg、适宜10至750mg、最适宜50至500mg的活性成分。
理想地，应施用活性成分以达到约0.5至约75μm、优选约1至50μm、最优选约2至约30μm的活性化合物的峰值血浆浓度。这可以例如通过静脉内注射活性成分、任选地于盐水中的0.05％至5％溶液来达成，或作为含有约1-100mg活性成分的大丸剂经口施用。合乎需要的血液水平可以通过连续输注以提供约0.01-5.0mg/kg/h或通过含有约0.4-15mg/kg的一种或多种活性成分的间歇输注来维持。
所需剂量可以适宜地以单次剂量或作为以适当时间间隔施用的分次剂量呈现，例如作为每天两个、三个、四个或更多个子剂量。子剂量本身可以进一步分成例如许多不连续的松散间隔的施用；例如从吹入器多次吸入或通过将多个液滴施加至眼中。
本发明现在将由以下非限制性实施例说明。
实施例1
概要
目的.淋巴管路径介导移植排斥反应。我们最近报道了淋巴管在淋巴管生成期间使角膜中的管腔瓣发育，并且这些瓣表达整合素α9(itga-9)并且在引导淋巴流动中起关键作用。在此项研究中，我们使用同种异体角膜移植模型以研究在移植之后itga-9的阻断是否可以抑制瓣生成，并且这种作用将如何影响移植物的结果。
方法.在完全错配的c57bl/6(供体)与balb/c(接受者)小鼠之间进行同位角膜移植。随机安排接受者以接受itga-9阻断抗体或同型对照的结膜下注射，每周两次持续8周。通过眼科裂隙灯生物显微镜检查体内评估角膜移植物并且使用卡普兰-梅尔存活曲线分析。另外，通过对淋巴管与瓣的免疫荧光显微镜检查体外评价整片全厚度角膜。
结果.在移植之后抗itga-9处理抑制淋巴管瓣生成。我们的处理并不影响角膜中的淋巴管形成或其鼻极化分布。更重要地，itga-9的阻断显著促进移植物存活。
结论.淋巴管瓣生成关键性地涉及于移植排斥反应中。itga-9靶向可以提供新的和有效的策略以干扰免疫反应并促进移植物存活。
引言
淋巴管脉管系统具有维持体液平衡、膳食脂肪吸收和免疫监视的基本功能。淋巴管系统的功能障碍已经在从癌症转移至发炎的一大批疾病和病症以及移植排斥反应中发现。在移植中，移植失败主要归因于排斥反应，但现有治疗具有有限的功效。研究已经显示，移植免疫可以通过淋巴管路径的分子阻断来调节，并且淋巴管已经成为用于开发新治疗策略的关键调节因素之一。
虽然大多数研究已经集中于调控淋巴管形成或淋巴管生成(lg)，但我们最近已经揭示，淋巴管随着lg进展使管腔瓣发育，并且这些瓣在导引管内部的淋巴流动中起至关重要的作用，所述淋巴含有用于免疫反应的免疫细胞和抗原。(truongt,altioke,yuend,ecoiffiert,chenl.novelcharacterizationoflymphaticvalveformationduringcornealinflammation.plosone2011；6:e21918；kanggj,ecoiffiert,truongt等intravitalimagingrevealsdynamicsoflymphangiogenesisandvalvulogenesis.scientificreports2016；6:19459；truongt,huange,yuend,chenl.corneallymphaticvalveformationinrelationto320lymphangiogenesis.investigativeophthalmology&visualscience2014；55:1876-1883)。有待确定这些淋巴管瓣形成或瓣生成(vg)的干预是否可以调节移植物存活，这是此项研究的焦点。
itga-9属于介导细胞-细胞和细胞-基质相互作用的整合素家族。先前报道了这种分子在角膜中新形成的淋巴管瓣中高度表达，并且其基因敲落可以试管内抑制人类皮肤淋巴管内皮细胞的功能，例如增殖、粘附、迁移和管形成。用缝合线放置模型展示，在简短的两周研究中itga-9的阻断可以抑制炎性vg。(altioke,ecoiffiert,sessar等integrinalpha-9mediateslymphaticvalveformationincorneallymphangiogenesis.investigativeophthalmology&visualscience2015；56:6313-6319)。这些初步结果指示完美的机会来阐明(1)itga-9的阻断是否可以用作干扰由移植诱导的vg和/或lg的新策略，所述移植是比发炎复杂得多的程序。移植触发针对外来抗原的免疫反应和更大程度的vg和lg；(2)vg是否在移植排斥反应中起关键作用。迄今，尚不存在关于这个方面的报道；以及(3)itga-9的阻断是否可以用于改善移植物的结果。当前的皮质类固醇方案具有有限的功效并且还与许多副作用，例如机会性感染、青光眼和白内障相关联。淋巴管特异性靶向可以提供更精确的方法以促进移植物存活。因此，来自此项研究的结果不仅可以提供对移植免疫的新见解，而且提供用以治疗移植排斥反应以及可能存在的其它淋巴管相关和免疫相关疾病的新颖策略。
方法
动物
在实验中使用六至八周龄的雄性balb/c和c57bl/6小鼠(taconicfarms,germantown,ny)，并且对于每个手术程序使用氯胺酮(ketamine)、甲苯噻嗪(xylazine)和乙酰丙嗪(acepromazine)(分别是50毫克、10毫克和1毫克/公斤体重)的混合物使小鼠麻醉。根据动物在眼科和视觉研究中使用的arvo声明(arvostatementfortheuseofanimalsinophthalmicandvisionresearch)处理所有小鼠，并且所有方案都经动物护理和使用委员会(animalcareandusecommittee；universityofcalifornia,berkeley)批准。
角膜移植
如先前所报道，在完全错配的c57bl/6(供体)与balb/c(接受者)之间进行同位角膜移植。(zhangh,grimaldos,yuend,chenl.combinedblockadeofvegfr-3andvla-1markedlypromoteshigh-riskcornealtransplantsurvival.investigativeophthalmology&visualscience2011；52:6529-6535；kanggj,ecoiffiert,truongt等intravitalimagingrevealsdynamicsoflymphangiogenesisandvalvulogenesis.scientificreports2016；6:19459)。基本上，将供体中央角膜用2mm直径的显微刮匙(katenaproductsinc.,denville,nj)作标记并且用vannas剪刀(storzinstrumentsco,sandimas,ca)剪取。类似地用1.5mm直径的显微刮匙制备接受者移植床并且用八个间断的11-0尼龙缝合线(sharpoint；vanguard)将供体扣形物紧固于接受者床中。在手术结束时施加抗生素软膏。
药学干预
如先前所报道，随机安排接受者小鼠以接受仓鼠或小鼠itga-9抗体(6.4μg；由北海道大学(hokkaidouniversity)的toshimitsuuede博士慷慨提供)或其同型对照仓鼠igg(jacksonimmunoresearch,westgrove,pa,usa)的结膜下注射。11在移植当天并且此后每周两次进行结膜下注射直至手术后8周。
移植的角膜的体内评估
在移植手术之后，首先在第3天检查所有眼睛并且在第7天去除角膜缝合线。根据标准方案通过眼科裂隙灯生物显微镜检查评价移植物，每周两次持续8周。基本上，移植物浑浊化的程度在0(透明和致密的移植物)至5+(前房全部遮蔽的最大不透明度)之间分级。在3周后具有2+或更高的不透明度分数或在2周后具有3+或更高的不透明度分数的移植物被视为排斥。
角膜免疫荧光显微镜检查
如先前所描述进行实验。(truongt,altioke,yuend,ecoiffiert,chenl.novelcharacterizationoflymphaticvalveformationduringcornealinflammation.plosone2011；6:e21918；kanggj,ecoiffiert,truongt等intravitalimagingrevealsdynamicsof318lymphangiogenesisandvalvulogenesis.scientificreports2016；6:19459；truongt,huange,yuend,chenl.corneallymphaticvalveformationinrelationtolymphangiogenesis.investigativeophthalmology&visualscience2014；55:1876-1883)。简单地说，在移植后8周收集整片全厚度角膜并且固定于丙酮中用于免疫荧光染色。将样品依序与纯化的兔-小鼠lyve-1(abcam,cambridge,ma)抗体和山羊抗小鼠itga-9抗体(r&dsystems,minneapolis,mn)一起孵育，分别由fitc缀合的驴抗兔和cy3缀合的驴抗山羊二级抗体(jacksonimmunoresearchlaboratories,westgrove,pa)显现。将样品用vectorshield封固介质(vectorlaboratories,burlingame,ca)覆盖并且由axioimagerm1落射荧光反卷积显微镜用axiovision4.8软件(carlzeissag,
淋巴管和瓣定量
如先前所报道进行分析。(truongt,huange,yuend,chenl.corneallymphaticvalveformationinrelationtolymphangiogenesis.investigativeophthalmology&visualscience2014；55:1876-1883；altioke,ecoiffiert,sessar等integrinalpha-9mediateslymphaticvalveformationincorneallymphangiogenesis.investigativeophthalmology&visualscience2015；56:6313-6319；cursiefenc,chenl,borgeslp等vegf-astimulateslymphangiogenesisandhemangiogenesisininflammatoryneovascularizationviamacrophagerecruitment.thejournalofclinicalinvestigation2004；113:1040-1050；schneiderca,rasbandws,eliceirikw.nihimagetoimagej:25yearsofimageanalysis.naturemethods2012；9:671-675；yuend,grimaldos,sessar等roleofangiopoietin-2incorneallymphangiogenesis.investigativeophthalmology&visualscience2014；55:3320-3327)。简单地说，对于lg评价，由nihimagej软件分析lyve-1+脉管结构。(truongt,huange,yuend,chenl.corneallymphaticvalveformationinrelationtolymphangiogenesis.investigativeophthalmology&visualscience2014；55:1876-1883；cursiefenc,chenl,borgeslp等vegf-astimulateslymphangiogenesisandhemangiogenesisininflammatoryneovascularizationviamacrophagerecruitment.thejournalofclinicalinvestigation2004；113:1040-1050；schneiderca,rasbandws,eliceirikw.nihimagetoimagej:25yearsofimageanalysis.naturemethods2012；9:671-675)。将淋巴管侵入面积针对总角膜面积标准化以获得每个样品的百分比覆盖分数。
通过描画缘部拱形体的最内淋巴管的轮廓来测量总角膜面积，并且通过描出角膜内部的lyve-1+淋巴管网的周线来确定淋巴管侵入面积。另外，关于穿过6时和12时位置的竖直中线将角膜分成四个同等的象限，并且鼻和颞象限用于分析每个样品的极化淋巴管分布。还评价管腔瓣，并且将沿着lyve-1+管的长度蔓延的焦点itga-9+/lyve-1区域鉴别为瓣并且对于每个样品进行定量。通过针对定义为100％的对照条件的平均值标准化来获得百分比分数。
统计分析
数据表示为平均值+sem。曼-惠特尼u检验(mann-whitneyutest)用于评价组之间的差异的统计显著性。由卡普兰-梅尔存活曲线评估角膜移植物存活。由以rstudio平台(rstudioinc.,boston,ma)使用nlmer包创建的线性混合模型执行关联分析。用prism软件(graphpad,lajolla,ca)执行所有其它统计分析。p<0.05被视为显著的。
结果
在角膜移植之后itga-9的阻断对淋巴管瓣生成的影响
首先研究itga-9的阻断对由移植诱导的角膜lg和vg的影响。从手术日开始每周两次结膜下注射itga-9中和体或同型对照。如图1a中所展示，在用itga-9阻断抗体处理之后，与对照条件相比角膜淋巴管含有显著更少的瓣。来自重复性研究的汇总数据在图1b中呈现(左图；p<0.05)。然而，如图1b(右图)中所示，这种处理对lg无影响。对瓣数量与淋巴管侵入面积的比率的进一步分析揭示经过处理中的这个参数相比对照条件显著降低(图1c；p<0.05)。
itga-9的阻断对淋巴管的鼻优势分布的影响
先前报道了角膜淋巴管在炎性lg中观测到独特的鼻优势分布模式。(truongt,huange,yuend,chenl.corneallymphaticvalveformationinrelationtolymphangiogenesis.investigativeophthalmology&visualscience2014；55:1876-1883；ecoiffiert,yuend,chenl.differentialdistributionofbloodandlymphaticvesselsinthemurinecornea.investigativeophthalmology&visualscience2010；51:2436-2440)。为了研究这种现象是否也在移植相关联的lg中表现并且其是否受itga-9处理所影响，如图2a中图解，接下来通过比较鼻与颞象限来研究itga-9的阻断对lg极性的影响。结果显示在处理组与对照组中，淋巴管更多地分布在鼻侧，并且itga-9的阻断对角膜lg的这种极性无影响(图2b和图4)。使用以rstudio平台(rstudioinc.,boston,ma)创建的线性混合模型的进一步关联分析还确认了lg的极化分布仅与角膜区而不与抗itga-9阻断相关联。
itga-9的阻断对角膜移植物存活的影响
为了进一步评价itga-9的阻断对角膜移植物存活的影响，在处理组与对照组中检查移植物，并且每周两次评价其存活率直至手术后8周。如图3中所示，结果显示通过这种处理显著促进移植物存活。虽然对照组与处理组中的移植排斥反应在移植后大约2.5周开始，但如由卡普兰-梅尔存活曲线(p<0.05)分析，到8周研究结束时处理组中显著更高百分比的移植物存活。
论述
在此项研究中，首次展示了itga-9关键性地涉及于角膜移植诱导的vg中，并且这种分子阻断可以有效地抑制这个过程。还已经显示了这种治疗策略并不影响角膜lg或其鼻分布极性。更重要地，提供了首个证据显示通过减少淋巴管瓣而非管本身，有可能达成更高的移植物存活率。
itga-9的阻断抑制淋巴管瓣形成而不扰乱移植中的淋巴管的发现与关于缝合线诱导的发炎模型的先前报道一致。(altioke,ecoiffiert,sessar等323integrinalpha-9mediateslymphaticvalveformationincorneallymphangiogenesis.investigativeophthalmology&visualscience2015；56:6313-6319)。似乎淋巴管瓣相比淋巴管更加响应itga-9干预。这可以由以下事实解释：itga-9在瓣上相比在管壁上更高地表达(图5)。在发育期间也观测到淋巴管瓣与管之间的差异，其中在itga-9敲除小鼠中检测到淋巴管瓣而非管的数目减少。(bazigoue,xies,chenc等integrin-alpha9isrequiredforfibronectinmatrixassemblyduringlymphaticvalvemorphogenesis.developmentalcell2009；17:175-186)。在此项研究中所用的治疗方案下，未观测到明显的副作用。
值得注意的是，防止淋巴管瓣形成可以显著增加移植物存活。这一发现指示淋巴管路径充当传入臂的免疫反射臂的受损。这也与itga-9敲除小鼠在出生后不久因淋巴管存在但展现受损的完整性的两侧乳糜胸而死亡的先前发育报道完全相符。(huangxz,wujf,ferrandor等fatalbilateralchylothoraxinmicelackingtheintegrinalpha9beta1.molecularandcellularbiology2000；20:5208-5215)。此外，淋巴管当其变得成熟并且有功能时配备有瓣。因此，通过靶向淋巴管瓣，可能已经干扰淋巴管的成熟过程，促使其功能障碍。
总之，此项研究揭示淋巴管vg在介导移植排斥反应中的重要作用。其还提供了用以有效地干扰这个病理性过程并且改善移植物存活的新颖治疗策略。来自角膜的结果可以启示开发基于itga-9的新疗法以治疗身体中更广泛的淋巴管和免疫疾病。
实施例2
进一步研究显示，ltga-9与vegfr-3的组合阻断在高风险角膜移植之后抑制淋巴管瓣和管形成(图6，管和瓣以绿色示出)并且促进移植物存活(图6b，卡普兰-梅尔存活曲线)。
实施例3
目的.我们最近报道了角膜淋巴管在炎性淋巴管生成期间使整合素α-9(itga-9)阳性瓣发育。此项研究的目的在于进一步研究itga-9在体内角膜淋巴管瓣形成和试管内淋巴管内皮细胞(lec)功能中的作用。
方法.标准鼠类缝合线放置模型用于使用itga-9中和抗体研究itga-9的阻断对体内淋巴管瓣形成的影响。收集整片角膜用于免疫荧光显微镜分析。另外，人类皮肤lec培养系统用于使用小干扰rna(sirna)检查itga-9基因敲落对细胞功能的影响。
结果.itga-9的阻断体内显著减少发炎角膜中形成的淋巴管瓣的数目。此外，人类lec中的itga-9基因敲落抑制增殖、粘附、迁移和管形成的细胞功能。
结论.itga-9关键性地涉及于角膜淋巴管瓣形成中。itga-9路径的进一步研究可以提供用以治疗在眼内部与外部出现的淋巴管相关疾病的新颖策略。
引言
淋巴管网渗透大多数组织并且在组织液平衡和免疫监视中发挥重要功能。广泛的疾病和疾患与淋巴管功能障碍相关联，包括发炎、癌症转移和移植排斥反应。1-5尽管与淋巴管系统相关联的疾病普遍存在，但仍然存在极少的可用于淋巴管病症的治疗。因此，这个领域迫切需要新的治疗策略。
在若干淋巴管特异性标志，例如淋巴管内皮透明质酸受体-1(lyve-1)和转录因子普洛斯彼罗同源框蛋白-1(prosperohomeoboxprotein-1，prox-1)的发现下，淋巴管研究领域在过去十年里已经迅速扩大。6、7越来越多的证据指向整合素在淋巴管系统中的作用，不过这种作用仍有待全面研究。8整合素是细胞-细胞和细胞-基质相互作用中所涉及的异源二聚细胞表面跨膜糖蛋白的家族。9-11来自我们和其它研究者的若干研究已经显示，整合素a5b1、a1b1和a4b1介导发炎相关或肿瘤相关的淋巴管生成(lg，新淋巴管形成)。12-15最近，我们已经报道了角膜淋巴管随着炎性lg继续发展而使管腔瓣发育，并且由内皮细胞层组成的这些瓣表达整合素a9b1(itga-9)，并且用来引导发炎角膜中的淋巴流动。16、17然而，itga-9在角膜淋巴管瓣形成和淋巴管内皮细胞(lec)功能中的直接作用仍然有待阐明，这是此项研究的焦点。关于这些问题的答案对于开发用于淋巴管疾病的新治疗策略是必需的。
在本篇论文中，使用具有瓣形成的角膜炎性lg的体内鼠类模型和试管内人类lec培养系统，我们提供了首个证据显示itga-9关键性地涉及于体内角膜淋巴管瓣形成和试管内lec功能中。体内经由中和抗体对itga-9的阻断显著抑制发炎角膜中的淋巴管瓣形成。另外，经由小干扰rna(sirna)使lec中的itga-9耗竭将停止试管内关键的细胞过程，例如增殖、粘附、迁移和管形成。总之，此项工作揭示itga-9在角膜淋巴管瓣形成中的关键作用。组合的体内动物工作与试管内人类细胞研究应提供高度翻译的信息用于未来开发用以治疗在眼内部与外部出现的淋巴管病症的新治疗策略。
方法
动物
六至八周龄的正常成年雄性balb/c小鼠购自taconicfarms(germantown,ny,usa)。根据动物在眼科和视觉研究中使用的arvo声明处理所有小鼠并且方案经研究院的动物护理和使用委员会批准。对于每个手术程序使用氯胺酮、甲苯噻嗪和乙酰丙嗪(分别是50、10和1毫克/公斤体重)使小鼠麻醉。
诱导角膜淋巴管生成和施用阻断抗体
如先前所描述，缝合线放置模型用于诱导具有瓣形成的角膜炎性lg。16简单地说，将三个11-0尼龙缝合线(arosurgical,newportbeach,ca,usa)放置于角膜基质中而不穿透至前房中。随后，随机安排小鼠以在缝合后第0天开始接受6.4lg仓鼠抗小鼠itga-9阻断抗体18或同型对照仓鼠igg(jacksonimmunoresearch,westgrove,pa,usa)的结膜下注射，每周两次持续2周。在每个组中使用总共10只小鼠重复实验两次。
免疫荧光显微镜测定和淋巴管瓣定量
如先前所报道进行实验。16、19简单地说，将整片角膜固定于丙酮中用于免疫荧光染色。将样品依序与纯化的兔抗小鼠lyve-1(abcam,cambridge,ma,usa)和山羊抗小鼠itga-9抗体(r&dsystems,minneapolis,mn,usa)一起孵育，分别由fitc缀合的驴抗兔和cy3缀合的驴抗山羊二级抗体(jacksonimmunoresearch)显现。将样品用vectorshield封固介质(vectorlaboratories；burlingame,ca,usa)封固并且使用zeisslsm710axioobserver倒置共焦显微镜以zen数字成像软件(carlzeiss,inc.,germany)检查。沿着
淋巴管内皮细胞培养和免疫细胞荧光显微镜测定
如先前所描述进行实验。13、19简单地说，人类新生微皮lec购自lonza(walkersville,md,usa)并且根据制造商的说明书维持在egm-2mv细胞培养基(lonza)中。对于lec染色，将细胞与兔抗人itga-9抗体(novusbiologicals,littleton,co,usa)一起孵育并且由cy3缀合的驴抗兔二级抗体(jacksonimmunoresearch)显现。将样品用dapi封固介质(vectashield；vectorlaboratories)封固。用zeissaxioplan2落射荧光显微镜(carlzeiss,inc.)获取数字图像。
sirna转染
如先前所报道进行实验。13、19由qiagen(valencia,ca,usa)针对人类itga-9mrna(50-aagaagaaagtcgtactatag-30)合成定制设计的sirna双链体。杂乱sirna对照购自ambion(austin,tx,usa)。在378c下于5％co2加湿空气孵育箱中，根据制造商的说明书用转染试剂(rnaimax；invitrogen,carlsbad,ca,usa)和opti-mem减血清培养基进行转染。
逆转录和实时pcr
如先前所描述并且基于定量实时pcr实验(miqe)指南的最少公布信息进行实验。13、19、20提取总rna并且在sirna转染后48小时用来自qiagen的rnaeasy微型试剂盒从lec纯化。使用来自invitrogen的superscriptvilocdna合成试剂盒进行逆转录。引物序列如下：人类itga-9，正向50-cggaatcatgtctccaacct-30和50-tctctgcaccaccagatgag-30；人类b-肌动蛋白，正向50-gatctggcaccacaccttct-30，反向50-ggggtgttgaaggtctcaaa-3.0。使用ssofastevagreen以cfx96序列检测系统(bio-radlaboratories,inc.,hercules,ca,usa)进行实时pcr。从针对肌动蛋白的d-ct标准化的靶向基因的d-ct(阈值循环数)计算itga-9基因的相对表达。
流式细胞术
在lec转染后48小时，通过guavaviacount测定(millipore,billerica,ma,usa)评价lec活力。使用guavaeasycyteht细胞计数器(millipore)和incyte2.6软件(millipore)撷取数据。通过guavaviacount试剂中两种dna结合染料的差异渗透性来评估活细胞和非活细胞。一种染料将所有有核细胞染色(红色荧光通道)，而另一种染料将非活细胞染色(黄色荧光通道)。活细胞被门控(r1)并且计算占总群体的百分比。重复实验三次并且将百分比分数针对分数定义为100％的对照条件标准化。
增殖测定
如先前所描述，13、19将lec接种至96孔板中。在用itga-9或杂乱sirna进行sirna转染后48小时，根据制造商的方案使细胞经受来自promega(madison,wi,usa)的mts增殖测定。一式三份进行测定并且重复三次。
粘附测定
如先前所描述，13在用itga-9或杂乱sirna进行sirna转染后48小时，将lec接种至涂有纤连蛋白的96孔板中。将板在378c下孵育1小时，洗涤两次，并且在室温下于hbss中与钙黄绿素(1lg/ml)一起孵育30分钟。将板用pbs洗涤，并且用微板读取器(spectramaxm5e；moleculardevices,sunnyvale,ca,usa)测量荧光强度。一式三份进行测定并且重复三次。
迁移测定
在用itga-9或杂乱sirna进行sirna转染后48小时，10-ll吸液管尖端用于在lec单层内制造线性创口。在划痕后0、24和72小时获取微分干涉差(dic)相位图像以显现细胞单层中的创口闭合。使用tscratch程序(tobiasgeb¨ackandmartinschulz,ethz¨urich)分析划痕的创口愈合。使用tritc缀合的鬼笔环肽(millipore,temecula,ca,usa)将细胞染色用于显现创口闭合期间的细胞迁移。
管形成测定
如先前所描述，13、19在用itga-9或杂乱sirna进行sirna转染后48小时，将lec接种(23104个细胞/孔)至含有固化基质胶(bdbiosciences,sanjose,ca,usa)的96孔板上。在接种后24小时使用zeissaxioobservera1倒置显微镜(carlzeiss,inc.)使管形成成像。获取管的相位图像(qcapture；qimaging,surrey,bc,canada)，并且使用imagej软件(http://imagej.nih.gov/ij/；在公共领域中由国家卫生研究院(bethesda,md,usa)提供)计算每孔的总管长度。一式三份进行测定并且重复至少三次。
统计分析
结果以平均值6sem报告并且司徒顿t检验(studentt-test)用于使用prism软件(graphpad,lajolla,ca,usa)确定不同组之间的显著性水平。当p<0.05时差异被视为统计上显著的。
结果
itga-9的阻断对体内角膜淋巴管瓣形成的影响
我们首先开始研究itag-9的阻断对炎性lg中的角膜淋巴管瓣形成的影响。标准缝合线放置模型用于评价itga-9中和抗体的结膜下递送对具有lg的发炎角膜中形成的瓣数目的影响。如图7a中所呈现，在用itga-9阻断抗体处理之后，与对照条件相比角膜淋巴管含有显著更少的瓣。来自重复性研究的汇总数据示于图7b中(*p<0.05)。
lec中的itga-9表达和耗竭
淋巴管瓣由夹在两层内皮细胞之间的细胞外基质构成。为了进一步研究试管内itga-9在淋巴管内皮细胞中的特定作用，我们接下来采用人类lec培养系统。如图8a中所示，我们通过免疫细胞荧光显微镜分析首先确认了这些细胞上itga-9的表达。我们然后评估这些lec中的itga-9表达是否可以通过sirna介导的基因沉默方法下调(图8b)。我们来自实时pcr分析的数据显示，在用itga-9sirna转染之后，lec中的itga-9表达显著减少大约50％。如图9中所示，我们通过流式细胞术分析以guavaviacount测定还确认了转染对lec活力无直接影响。总之，这些数据指示用sirna转染可以用于试管内研究itga-9在lec中的功能作用。
itga-9耗竭对lec增殖的影响
我们接下来使用sirna方法更深入地探讨并评估itga-9在lec增殖功能中的作用。如先前所报道，在用itga-9或杂乱sirna进行sirna转染后48小时，使lec经受mts增殖测定。19如图10a中所呈现，我们的数据显示itga-9sirna处理使得与对照条件相比lec增殖显著减少(*p<0.05)。这个结果表明itga-9啮合调控lec增殖。itga-9耗竭对lec整合素粘附的影响对于细胞粘附至细胞外蛋白是必需的。为了研究itga-9对于lec粘附是否重要，将细胞用itga-9或杂乱sirna转染并且在涂有itga-9配体纤连蛋白的孔上经受粘附测定。如图10b中所呈现，lec中的itga-9耗竭使得细胞粘附至纤连蛋白显著减少(*p<0.05)，指示itga-9对于lec与细胞外基质的相互作用也是至关重要的。itga-9耗竭对lec细胞迁移的迁移的影响是主要依赖于整合素与细胞外基质蛋白之间的相互作用的过程，我们接下来使用创口愈合的划痕测定来研究itga-9对lec迁移的重要性。在用itga-9或杂乱sirna进行sirna转染之后，经过72小时监测lec。如图11a中所示，在所研究的两个时间点，创伤后24和72小时，用itga-9sirna转染的lec相比用杂乱sirna转染的对照细胞显示更大的开放性创口面积(*p<0.05)。此外，itga-9对创口愈合的抑制作用在更晚的时间点会更大，此时对照组中的细胞在大部分视场上已经生长(图11b)。这些结果明确指示itga-9对于lec迁移是必需的。
itga-9耗竭对lec的管形成的影响
我们还使用三维培养系统研究itga-9耗竭对lec组织成毛细型管的能力的影响。在用itga-9或杂乱sirna转染后48小时，将lec接种于固化基底膜基质，即基质胶上，以允许管形成。如图12a中所展示，来自这个测定的结果显示lec中的itga-9耗竭使得总管长度大幅减小。来自重复性研究的汇总数据在图12b中呈现(*p<0.05)。这些结果暗示itga-9在lec组织成大尺度结构中的关键作用。
论述
在本研究中，我们已经使用体内动物与试管内人类细胞模型展示itga-9在角膜淋巴管瓣形成和lec中必不可少的作用。我们能够从此项研究引出两个独立的结论。首先，如通过使用itga-9阻断抗体的实验所示，体内淋巴管瓣形成由itga-9严格调控。其次，如通过sirna敲落方法揭示，itga-9关键性地涉及于试管内lec过程中，例如增殖、迁移和粘附。虽然体内数据提出了干扰发炎角膜中的淋巴管瓣形成的新策略，但试管内结果提供了关于itga-9在lec的各种功能中的作用的潜在可能机制的更多细节，这将瓣形成的过程编排在一起。细胞锚定于细胞外基质主要通过基于整合素的连接介导，在细胞内与细胞外环境之间建立强连接。11整合素在细胞外基质蛋白中依赖于a和b亚单位而具有特异性。如人类癌细胞模型中所报道，itga-9的主要配体之一是纤连蛋白。21在使用人类lec的此项研究中，使用靶向itga-9的sirna，我们能够显示在itga-9耗竭后，lec粘附至纤连蛋白显著受抑制。此外，在细胞迁移的核心处是细胞-基质粘附复合物，其主要由将细胞外基质连接至细胞内肌动蛋白的整合素组成。22为了鉴别itga-9在lec迁移中的作用，我们通过创口愈合划痕测定研究itga-9损失对细胞迁移的影响。我们能够显示，与随着时间推移在划痕表面上完全生长的对照lec相比，缺乏itga-9的lec从未完全迁移到划痕创口上。与增殖数据汇集，itga-9在与lec连接至细胞外基质相关联的过程中的显著性变得无可置疑。对这些基本过程的进一步研究可以揭露用于治疗性干预的新标靶。此外，我们的试管内数据展示itga-9耗竭的lec损失其在培养中形成毛细型管的能力。然而，我们使用itga-9阻断抗体的体内治疗方案显示淋巴管而非瓣并无显著减少。尽管如此，在对发育期间的非眼组织中的淋巴管瓣形成的先前研究中也观测到这种差异现象。特别地，bazigou等23检查itga-9敲除小鼠中的淋巴管瓣形成并且报道了itga-9纯合子中瓣而非淋巴管的数目减少。对于我们使用中和抗体的体内数据的一种可能解释是itga-9在角膜淋巴管瓣上相比在管上更高地表达，16、17这可以促使瓣对抗itga-9治疗更敏感。这值得进一步研究。总之，这些结果将itga-9指定为理想的标靶以操作淋巴管瓣形成而不扰乱管。还表明了当在疾病管控中需要瓣与管的干预时组合的瓣/管靶向方法是必要的，这同样要求进一步研究。因为淋巴管构成免疫反射弧的传入臂，1并且其管腔瓣用来引导管内部的淋巴(含有免疫细胞)流动，所以推测通过操作角膜内部形成的管和/或瓣的数目，我们有可能干扰免疫反应的程度以及各个阶段的疾病的进展和解析。总之，此项研究不仅提供对角膜瓣形成的新见解，而且还可以启示未来开发基于itga-9的新疗法用于在眼内部或外部出现的广泛淋巴管疾病。
实施例3参考文献
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