本发明属于生物医药领域，具体涉及化合物sorbicillin在防治白色念珠菌中的应用。
背景技术：
白色念珠菌(candidaalbicans)是一种常见的条件性致病菌，当人体免疫力低下时致病，会引起浅部、深部感染，甚至威胁生命。目前市面上用于白色念珠菌治疗的药物主要为唑类和多烯类药物，然而这些药物在不同程度上存在抗菌谱窄、毒副性大等缺点；除此之外，随着抗真菌药物的长期大量使用，白色念珠菌的耐药现象越来越突出。因此，开发新型抵抗白色念珠菌的化合物已经成为抗真菌药物的研发的首要环节。
已有的研究表明，白色念珠菌的致病性与它的酵母-菌丝二相转变有关，白色念珠菌的耐药性与生物被膜的形成有关。首先，白色念珠菌的酵母态一般不引起病害，但是它们可以粘附在宿主细胞或者人体内植入的导管上；随后白色念珠菌逐渐变成菌丝态，侵染宿主细胞，大量繁殖，导致皮肤、粘膜以及全身性的真菌病。除此之外，在白色念珠菌的酵母态粘附后，还会形成生物膜。白色念珠菌的耐药机制非常复杂，生物被膜的形成是其中一个非常关键的原因，可能是细胞外机制阻碍药物的进入，也可能是生物被膜中耐药基因的表达等。
基于上述研究结果，利用新型抑菌策略设计抗白色念珠菌的化合物，从阻断白色念珠菌特有的酵母-菌丝二相性和生物被膜的形成入手，针对性地设计高效、低毒、不易产生耐药性的新型化合物，具有重要的科学意义和应用前景。
1948年cram首次从点青霉(penicilliumnotatum)中分离得到化合物sorbicillin，该类化合物结构独特多变，由于其具有多种生物活性，引起了许多科技工作者对其合成机理及合成方法和活性方面做了大量研究，但目前还未曾见化合物sorbicillin在防治白色念珠菌领域中的详细研究与报道。
技术实现要素：
为解决现有技术存在的不足，本发明提供一种防治白色念珠菌的新型化合物及其应用，并公开了其结构式与制备方法，新型化合物命名为sorbicillin。
化合物sorbicillin在防治白色念珠菌中的应用，所述化合物sorbicillin结构式如下所示：
其中，化合物sorbicillin制备方法，步骤如下：
放线菌streptomycesolivaceusscsiot05发酵罐发酵，收菌离心，菌丝体部分丙酮超声提取，上清液部分丁酮萃取，根据hplc分析结果合并浸膏，利用各种柱色谱层析方法分离，并利用各种波谱技术手段鉴定化合物的结构，即得到sorbicillin。
其中，化合物sorbicillin在制备预防和治疗白色念珠菌引起的感染性疾病药物中的应用也属于本发明的保护范围。
与现有技术相比，本发明有益效果在于，本发明所公开的技术成功制备并筛选出具有抑制白色念珠菌粘附性、菌丝形态转换和致病性的化合物sorbicillin，同时，化合物sorbicillin本身毒性较小，不影响白色念珠菌及人类细胞的生长，有望促进和推动新型抗真菌药物治疗的发展。
附图说明
图1是终浓度为25μg/ml到100μg/ml的化合物sorbicillin对白色念珠菌细胞粘附于聚苯乙烯上的影响结果图。
图2是化合物sorbicillin对白色念珠菌菌丝形成的影响结果图；
其中，图2a是终浓度为3.125μg/ml到50μg/ml的化合物对白色念珠菌菌丝形成抑制率的测定结果图；图2b是化合物在终浓度为50μg/ml和25μg/ml时对菌丝生成抑制的显微镜观察图片。
图3是化合物sorbicillin对白色念珠菌生长速率的影响结果图。
图4是化合物sorbicillin对白色念珠菌在a549细胞的致病性方面的影响；
其中，图4a为终浓度为50μg/ml和100μg/ml的化合物对a549细胞的细胞毒性的影响；图4b为终浓度为12.5μg/ml到100μg/ml的化合物对白色念珠菌细胞毒性的影响。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
实施例1放线菌菌株的发酵提取和化合物sorbicillin的制备
放线菌菌株scsiot05自印度洋4617m下海底沉积物(e94°3364′，s1°4256′)中分离得到，16srdna基因序列分析确定菌株为streptomycesolivaceusscsiot05。基因序列保存至genbank中(accessionnumbermf429815)。
生长于isp2固体培养基上的菌株streptomycesolivaceusscsiot05接种于含200mlisp2液体培养基的1l三角瓶中(10瓶)，培养基摇床发酵，28℃、200rpm条件下发酵两天得种子。种子接种于含有40lra培养基的65l发酵罐中发酵培养，培养条件为温度28℃，转速200rpm，无菌空气20l/min，压力0.1mpa。每隔12h取样50ml，丁酮萃取并hplc检测以观察发酵情况。
其中，isp2固体培养基组成成分为：4.0g/l葡萄糖，4.0g/l酵母提取粉，10g/l麦芽提取粉，30g/l海盐，20g/l琼脂粉，调节ph值至7.4。ra培养基组成成分为：10g/l葡萄糖，10g/l麦芽提取粉，5.0g/l玉米粉，20g/l可溶性淀粉，10g/l麦芽糖，2.0g/lcaco3，30g/l海盐，调节ph值至7.4。
发酵3天后收菌，离心，菌丝体部分丙酮超声萃取三次，并减压浓缩得浸膏(245mg)；上清液部分丁酮萃取三次，减压浓缩得浸膏(12.1g)根据hplc分析结果合并两部分浸膏，硅胶柱层析，氯仿-甲醇(100:0,95:5,90:10,85:15,80:20,70:30,50:50)洗脱，得fr.1-fr.7共7部分，fr.2部分中压rp-18反相柱层析(30:70→100:0，0→120min)，乙腈-水洗脱，得fr.2-1至fr.2-5五部分，fr.2-2部分半制备柱层析，乙腈-水洗脱(5:5→10:0，0→30min),得化合物sorbicillin(5.0mg，rf＝19.01min)。化合物的结构通过分析质谱和1h、13cnmr数据并与文献比较(zhaop.j.,etal.chem.biodivers.2006,3:337-342)确定。
实施例2效果检测试验
1、试验方法
1.1白色念珠菌菌株的活化
将白色念珠菌标准菌株sc5314于lb培养基活化(胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl10g/l，琼脂15g/l)，置于30℃培养箱培养过夜。
1.2化合物对白色念珠菌菌株sc5314粘附性的影响：
挑取lb固体平板上的sc5314菌株，接种于gmm培养液(6.7g/lynb，0.2％葡萄糖)中，30℃，200rpm振荡培养过夜，测定菌液od600。随后用gmm将菌液稀释至od600＝0.5，取1ml菌液于1.5mlep管中，依次加入终浓度为25μg/ml到100μg/ml的化合物，震荡混匀，各取200μl加入96孔板中，每个处理设置4个重复，同时设置只加dmso的处理。将96孔板静置于37℃中孵育，4h后弃掉菌液，加入50μl0.5％结晶紫，室温作用45min。将结晶紫弃掉，并用冰ddh2o洗10次，加入200μl75％乙醇，室温放置30分钟，测定od590，用graphpadprism6软件处理数据。
1.3化合物对白色念珠菌菌株sc5314菌丝的影响：
挑取lb固体平板上的sc5314菌株，接种于gmm培养液(6.7g/lynb+0.2％葡萄糖)中，30℃，200rpm振荡培养过夜，测定菌液od600，用gmm将菌液稀释至od600＝0.1。取500μl菌液于1.5mlep管中，分别加入终浓度为3.125μg/ml到50μg/ml化合物，同时设置dmso、bdsf(b.cenocepaciadiffusiblesignalfactor，对sc5314菌丝形成有很好的抑制作用)分别为对照。震荡混匀，置于37℃水浴锅中孵育，6h后，离心5000rpm，10min，弃上清，加入40μlgmm培养液重悬菌体，于leicadmi8显微镜下观察菌丝的形成，取不同视野拍摄照片。
1.4化合物对白色念珠菌菌株sc5314生长影响测定：
挑取菌株sc5314单菌落接种于gmm培养液，30℃，200rpm振荡培养过夜，测定菌液od600，用gmm将菌液稀释至od600＝0.5。取1ml菌液于1.5mlep管中，依次加入终浓度为50μg/ml的化合物，震荡混匀，各取300μl加入100孔板中，每个处理设置4个重复，同时设置只加dmso处理。置于生长曲线测定仪中，30℃，200rpm，每2h测定一次od600值，2d后观察实验结果，graphpadprism6处理数据。
1.5化合物对白色念珠菌菌株sc5314细胞毒力的影响：
1.5.1a549细胞的复苏及培养
将冻融的a549细胞转移至含10％fbs的dmem培养基中，37℃，5％co2条件下过夜培养。
1.5.2a549细胞准备
a549细胞在含10％胎牛血清的高糖培养基dmem中，以1.5×104个/孔的细胞浓度于96孔板中培养过夜。待细胞布满96孔板底部80％的时候，弃去培养液，用1×pbs清洗细胞3次。
1.5.3白色念珠菌准备
挑取新鲜sc5314接种于gmm培养液中，于30℃，200rpm条件下振荡培养过夜；用含1％fbs的dmem细胞维持液调节至od600＝1.0，再用dmem(1％fbs)稀释10倍(≈108cfu/ml)待用。
1.5.4细胞毒力测定
将终浓度为50μg/ml到100μg/ml化合物加入含菌的细胞维持液中，取100μl加入准备好的a549细胞中，置于37℃，5％co2细胞培养箱内培养8h，每个样品4个重复，同时设置只加dmso、bdsf作为对照，同时测定化合物对细胞本身的毒力作用，即将终浓度为12.5μg/ml到100μg/ml化合物加入不含菌的细胞维持液中，同上处理。参照promega公司cytotox
2、实验结果
2.1化合物能有效抑制白色念球菌sc5314的生物膜形成
以dmso和bdsf为对照，化合物的浓度梯度为25μg/ml到100μg/ml，检测化合物对白色念球菌sc5314的生物膜形成是否有影响。如图1所示，化合物浓度为100μg/ml时，对白色念珠菌sc5314的生物膜形成有良好的抑制作用，形成率只有25％；化合物浓度为50μg/ml时，形成率为45％。
2.2化合物能抑制白色念球菌sc5314的菌丝形成
以dmso和bdsf处理过的菌丝形成率为对照，化合物sorbicillin的浓度梯度为3.125μg/ml-50μg/ml，检测化合物对白色念球菌sc5314的菌丝形成是否有影响。如图2a所示，本化合物对白色念球菌有非常强的菌丝抑制作用，在化合物浓度为50μg/ml和25μg/ml时，菌丝形成率为0；在化合物浓度为12.5μg/ml时，菌丝形成率小于5％。另外，图2b显示的是本化合物终浓度为50μg/ml和25μg/ml时，在倒置显微镜下观察到的结果。从结果来看，本化合物的菌丝抑制效果很强，结果呈现出浓度依赖的特性。
2.3化合物对白色念球菌sc5314的生长有影响
以dmso和氟康唑(flc，广谱抗真菌药物)为对照，化合物的终浓度为50μg/ml，检测化合物对白色念球菌sc5314的生长是否有影响。结果如图3所示，化合物sorbicillin对白色念球菌sc5314的生长有抑制作用。
2.4化合物可以抑制白色念珠菌菌株sc5314对细胞a549的毒力作用
以dmso和bdsf为对照，化合物的终浓度为50μg/ml，申请人测试了在没有白色念球菌sc5314的情况下，化合物本身对细胞的毒力作用，如图4a所示，化合物sorbicillin对细胞毒力作用较小。
图4b所示为终浓度为12.5μg/ml到100μg/ml的化合物对白色念珠菌细胞毒性的影响。结果表明，化合物对细胞有较强的保护作用，当化合物终浓度为100μg/ml时，可以使白色念珠菌的毒力降低在10％以下；当化合物终浓度为50μg/ml时，可以使白色念珠菌的毒力降低在40％以下。
综上所述，本申请对菌株streptomycesolivaceusscsiot05发酵分离得到了化合物sorbicillin，并检测了化合物对抗真菌病原体的能力。化合物sorbicillin显示出了很强的抑制白色念珠菌细胞菌丝形成和致病性的特性，而且对白色念珠菌细胞本身的生长没有太大的影响，对人体细胞几乎没有毒性。因此，这个化合物有可能被开发为新型抗白色念珠菌感染的药物。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。