一种化合物及其水合物或盐的用途的制作方法

本发明涉及制药领域，特别是一种化合物及其水合物或盐的用途。

背景技术：

当前，在急性治疗里面，神经保护是目前谈的很多但是用的不太多的一类治疗。神经保护主要的用途是抑制早期的缺血。在早期的时候如何恢复血流，之后恢复供氧，包括能量的衰竭、聚集化的过程，以及在延迟之后的炎症反应和凋亡过程，抑制这个过程之后可以把神经细胞挽救回来。从理论上讲，如果无神经保护，则神经的永久缺血性损害可能会很大，如果有神经保护，则缺血损害可能会减轻。

对于脑梗塞、脑出血等脑卒中、特别是急性期脑梗塞中脑梗塞区的扩大、脑水肿、神经症状的预防或/和治疗，医疗领域强烈需要有效且安全性高的治疗方法。目前，特别是从内科疗法及外科手术疗法的安全性方面出发，强烈需要出现可以长期服用的安全性高的药物疗法。

技术实现要素：

现如今并没有如式(I)结构式的化合物及其在药学上可接受的水合物或盐在预防或/和治疗缺血或缺血性损伤的相关报道，其中具有式(I)化合物的结构式如下：

其中，缺血再灌注损伤包括缺血损伤和再灌注损伤，再灌注损伤是缺血的继发性损伤。

本发明考虑到这样的背景，课题在于提供以与现有治疗药不同的机制显示出有效性、且可以长期服用的脑卒中中的脑缺血损伤或脑缺血再灌注损伤的预防或/和治疗剂。

因此，本发明人研究了式(I)结构式的化合物对脑缺血再灌注损伤的效果，利用广泛使用的小鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型进行评价。其结果证实，该化合物对由小鼠大脑中动脉缺血再灌注引起的神经症状、脑梗塞范围扩大有效。通过研究发现，所述化合物在药学上可接受的水合物或盐，在预防或/和治疗脑缺血损伤或脑缺血性再灌注损伤上同该结构式的化合物具有同等功效。所述脑缺血再灌注损伤包括脑缺血损伤和再灌注损伤。

本发明还可以将上述化合物及其药学上可接受的水合物或盐用于制备预防或/和治疗缺血或缺血性损伤的保健品。

本发明所述药物或保健品为预防或/和治疗脑缺血或脑缺血性损伤的药物或保健品。

本发明实验中，所述脑缺血再灌注损伤由脑缺血、脑血栓、脑水肿、脑梗死、炎症、血脑屏障破坏中一种或多种所引起。

本发明所述药物制成临床可接受的片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、颗粒剂、口服液剂或注射剂。

本发明还提供了将如式(I)的化合物或其在药学上可接受的盐在制备治疗脑神经的药物中的用途。

本发明试验中，所述药物用于脑神经元细胞保护或脑组织修复。

本发明所述治疗脑神经的药物制成临床可接受的片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、颗粒剂、口服液剂或注射剂。

本发明还提供了如式(I)的化合物或其在药学上可接受的盐在制备预防或/和治疗脑血栓、脑水肿、脑梗死中的一种或多种疾病的药物中的用途。

本发明有益效果：

本发明所述化合物及其在药学上可接受的盐或水合物不仅对神经保护具有显著的作用，同时对脑失血类病症具有明显的治疗的效果。

附图说明

图1是脑梗死体积图；

图2是脑含水量图；

图3是TTC染色图；

图4是血清中SOD和MAD测定图；

图5是TNF-α的表达量测定图；

图6是IL-1β的表达量测定图；

图7是TIL-6的表达量测定图；

图8是pMCAO模型脑部组织Nissl染色图；

图9是pMCAO模型脑部组织Nissl染色数量图；

图10是MMP-9，AQP-4及ZO-1蛋白含量测定图。

具体实施方式

下面通过具体的实施例子对本发明做进一步的详细描述。

一、药品选择

式(I)的化合物或其在药学上可接受的水合物或盐的制备采用现有技术制备得到的符合实验要求的产品。其中式(I)的化合物单体用R表示。

二、实验

(一)试验方法

pMCAO模型建立：

1.选择体重在300g左右的SD大鼠，于手术前12h禁食不禁水；

2.麻醉：在实验前预先配置好浓度的水合氯醛溶液大鼠进行腹腔注射麻醉；

3.准备：待大鼠完全麻醉以后，先用剃须刀刮去颈部的毛，后局部碘伏消毒，好四肢并用细线挂住门牙；

4.进线：小心剪开包裹颈总动脉(CCA)及迷走神经的鞘膜，随后顺着CCA的方向向远端分离出一个Y形分支，即颈内动脉(ICA)和颈外动脉(ECA)。首先要将CCA结扎，其次用动脉夹夹闭Y型分支处的ICA和ECA。用显微剪在离CCA近心结扎端的远侧剪一小口，插入线栓，随后松开CCA远端的动脉夹，进线，当出现阻力时便立即停止进线；

5.缝合：根据分离的先后顺序将肌肉层层缝合；

6.拔线：术后两小时拔线，拔线时应顺着其皮肤的方向缓慢进行，待看见事先在线栓上标记的黑点时，说明线栓已拔出，用剪刀剪掉线头即可。

上述模型包括脑血栓等病况的模拟。

(二)pMCAO模型神经功能评分

采用Zea Longa五分法进行神经功能评分

(三)分组与给药方案

分组：随机将评分为1分和2分的pMCAO模型鼠随机分为5组，分别为模型组(I/R)，阳性组(尼莫地平组)(positive)，R低剂量组(10mg/kg)，R中剂量组(30mg/kg)，R高剂量组(50mg/kg)。再添加假手术组，假手术组仅分离各动脉但不用线栓阻断大脑中动脉血流，其余操作同模型组。

给药：通过灌胃方式给药，每日给药一次，5日后，处死小鼠，取血液样品及脑组织进行检测。

(四)单体R的药效学评价

1.脑梗死面积及含水率测定：

通过TTC染色进行考察，黑色(灰色或深灰色)区域代表正常区域，白色区域代表病灶区域，进行计算得出；染色后的脑组织继而采用干湿重法计算脑组织含水率。详细见表1、2，图1、2、3。

表1药物对大鼠脑梗死体积的影响

注：模型与假手术组相比^△△P<0.01；药物组与模型组相比*P<0.05，**P<0.01。

表2药物对大鼠脑含水量的影响

注：模型与假手术组相比^△△P<0.01；药物组与模型组相比*P<0.05，**P<0.01。

pMCAO模型的脑梗死面积测定结果如图1所示，与假手术组相比，模型组的大鼠脑梗死面积和脑组织含水率显著升高，表明建模成功。经过阳性药物及不同剂量的单体R治疗后，脑梗死面积呈现下降趋势，与模型组相比具有显著性差异，说明单体R具有减轻大脑I/R引起的损伤及水肿的作用，并呈现剂量依存关系。

2.抗氧化应激评价：

MDA作为脂质过氧化终产物，其含量可反应细胞的损伤程度，而SOD的活力高低则反映出药物对大脑I/R引起的氧化损伤的作用。因此，通过对MDA和SOD的测定，可以反应单体R的抗由大脑I/R引起的氧化应激的能力。

血清SOD，MDA含量取预先采集的股动脉血，于4℃静置30min后，冷冻离心，取上层血清，置于超低温冰箱待测，检测时严格按照试剂盒说明，采用黄嘌呤氧化酶法检测血清SOD活力，硫代巴比妥酸法检测血清MDA含量。详细见图4。

由图4可以看出，模型组的血清的SOD活力降低，MDA含量明显升高，说明I/R能够产生氧化应激反应。在给予不同剂量的单体R治疗后，SOD的活力显著上升，同时MDA的含量也明显降低，说明R脑I/R疾病的治疗过程中具有抑制机体氧化应激反应的作用，保护神经元细胞。

3.抗炎症因子评价：

取全血及右侧脑组织缺血半暗带样本，血清样同本节第2部分所述方法(仅对测定用的试剂盒选择不同)处理；取100mg脑组织样品，加入1ml PBS在-20℃条件下过夜，重复两次冻融循环，破坏组织细胞膜后，低温离心，取上清液，通过ELISA试剂盒对相关炎症因子TNF-α、IL-1β及IL-6的表达量进行测定。测定结果如图5-7。

如图5-7所示，从实验结果可以看出，三种炎症因子的表达量在脑I/R损伤后明显上升，且由于病灶部位的位于脑部，因此炎症因子在脑部的含量相对高于血清。给予不同治疗剂量的单体R后，三种炎症因子的表达量均呈现下降趋势，作用强度与单体R的给药剂量相关。

4.R对神经元的保护评价：

取脑，固定，石蜡包埋，Nissl染色观察神经元尼氏小体变化，测定结果如图8-9。

如图8-9所示，通过Nissl染色观察各组神经元细胞中尼氏小体的数量发现，给予单体R治疗后的各组组织中尼氏小体的数量明显多于模型组，并呈现剂量依赖性。组织病理学的研究结果表明，单体R能够在脑I/R损伤发生后，对大脑神经元细胞保护，促进脑组织修复。脑缺血再灌注损伤修复

5.血脑屏障(BBB)保护作用评价：

血脑屏障(Blood-brain barrier，BBB)的破坏与脑缺血再灌注损伤及继发脑水肿、脑缺血、炎症改变有重要的联系。其可能的损伤机制包括自由基损伤、蛋白酶激活、炎性细胞浸润、钙超载等。基质金属蛋白酶(MMP)的激活在脑缺血再灌注损伤过程中发挥重要的作用。MMP-9作为MMP家族的主要组成部分，由内皮细胞及周细胞表达，其在正常状态下表达量较低，在大脑病理状态下明显升高。当MMP-9的含量升高时，促进紧密连接(TJs)相关蛋白的降解，如ZO-1，而紧密连接是BBB的重要结构，能够限制血液和脑组织间大分子的运动，维持脑内环境稳态。此外，水通道蛋白(AQP)的表达量同样关系着BBB结构功能的完整性，当损伤发生后，AQP的表达量上升，导致BBB对水分子的通透性增加，易导致水肿的发生。在AQP家族中，AQP4在脑组织中分布最广，参与血浆渗透压的调节、血脑屏障的发育和功能维系,并兼有细胞外渗透压感受器的功能。因此，我们通过对MMP-9，ZO-1及AQP-4三种蛋白含量测定，对单体R对在大脑I/R损伤后的BBB功能的保护作用进行评价(图6)。

通过Western-blot方法测定ZO-1、MMP-9和AQP-4蛋白表达量，对BBB的功能进行评价。取右侧脑组织缺血半暗带样本加入裂解液，在超声粉碎仪上破碎离心提取上清液(细胞膜裂解产物)，用考马斯蓝G-250结合法进行蛋白定量；等量蛋白经SDS-PAGE分离后，将蛋白转至硝酸纤维素膜上；5％脱脂奶粉中4℃封闭过夜，分别加入小鼠抗大鼠ZO-1抗体、MMP-9抗体、AQP-4抗体和小鼠抗β-actin单克隆抗体与硝酸纤维素膜室温孵育过夜；加入相应二抗，室温孵育1h，用增强的化学发光法检测免疫复合物表达，采用计算机软件对蛋白条带进行扫描，计算各条带整合光密度值(IDV)，结果以相关蛋白/β-actin的IDV比值表示。

如图10所示，MCAO成模后，MMP-9，AQP-4的含量增加，而ZO-1的含量明显降低，同时脑含水率的测定结果与此蛋白检测结果相一致，说明大脑I/R能够破坏BBB的结构和功能。相对于模型组，单体R治疗组的MMP-9，AQP-4含量明显降低，而ZO-1的含量增高，说明单体R对BBB的修复具有明显的促进作用。

本发明首先建立pMCAO模型，并对脑梗死面积及脑含水率进行测定，其结果证明单体R能够明显降低脑损伤；其次通过对pMCAO模型的组织病理学研究，发现单体R能够抑制神经元细胞及组织结构的损伤；炎症因子及氧化应激介导因子的检测结果表明，单体R能够降低炎症因子及氧化应激反应对机体的损伤；此外，通过降低MMP-9及AQP-4，增加ZO-1的表达，单体R能够对促进BBB的修复，维持BBB的结构与功能。综上，单体R可保护大脑神经元细胞的同时改善大脑的缺血性损伤。

尽管这里参照本发明的解释性实施例对本发明进行了描述，但上述实施例仅为本发明较佳的实施方式之一，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。