本发明属于诊断试剂技术领域，具体涉及一种放射性碘标记的蛋白结合配体及其应用。
背景技术：
分子影像学被誉为21世纪的医学影像学，因其能够为疾病的早期发现、早期诊断、早期治疗提供强有力的保证。一方面，显像设备的发展推动了疾病早期诊断与治疗的实现；另一方面，发展靶向性好、特异性强、灵敏度高的非侵入性探针已成为分子影像学的关键要素。只有获得性能良好的探针，才能更好地诊断和治疗疾病及评价预后效果。
近年来，心血管系统疾病及恶性肿瘤严重影响着人类健康，已经位居世界人口发病率和死亡率的前两位。早期诊断和治疗对于降低这两类疾病的危害，减小社会负担来说是重要而紧迫的。对于心血管疾病来说，采用相应的显像手段有效显示血管并结合免疫组织化学研究探索疾病发病机制是十分必要的。该类疾病的早期诊断、早期治疗和个体化综合治疗是降低死亡率最有效的措施。而早期及个体化治疗的指征和方案的根本依据之一是医学影像学的诊断结果，因此敏感准确的影像学诊断技术，是实现心血管疾病及肿瘤的早诊早治和个体化治疗的关键技术。目前常用的血管显影方法有墨汁灌注法，免疫组织化学方法，单宁酸媒染法，酶组织化学法等等。但这些方法各有弊端，如不能与免疫组织化学研究相结合，过程繁琐或荧光易淬灭等。利用放射性核素标记的显像剂对心血管系统显像是当今放射性药物研究的热点之一。放射性核素标记的血池显像剂能无创伤地活体测定局部或整体的心脏功能，提供某些心脏功能参数，对冠心病、心肌病和瓣膜病等心脏病的早期诊断、愈后及疗效观察都有一定的价值。大多数的心血管疾病的诊断治疗药物都存在以下问题：如血液半衰期短，肾脏清除率快，易于从体内被排泄，使得其应用时必须要高剂量或者频繁给药等等，这样会不可避免的产生一系列毒副作用，因而限制了其使用。目前临床上使用最多的放射性标记的血池显像剂为99mtc-rbc(血红细胞)(stedrovav，etal.eurjnuclmedmoli2010，37：s495-s495.)；11c或15o标记的rbc(kearfottkj.jnuclmed1982，23(11)：1031-1037.)；68ga标记的伊文氏蓝衍生物(zhangjj，etal.jnuclmed2015，56(10)：1609-1614.)等。
而在肿瘤的诊断及治疗方面，快速的血液清除率在肿瘤的受体靶向显像中通常被认为是一项优势。快速的血液清除可降低正常组织的放射毒性，提高探针在体内的靶/本底比值，然而，血液半衰期短也导致分子探针在肿瘤组织中摄取和滞留时间相对较少。而长的血液半衰期对于肿瘤的放射性核素靶向治疗是非常重要的。幸运的是目前有一些方法可以用来延长血液半衰期，比如增大药物分子的大小，聚乙二醇化，聚糖化，微囊化，与白蛋白结合等，以此降低肾脏清除率，使得药物在血液中循环时间较长，有利于恶性肿瘤的诊断和治疗。另外，减缓药物随时间的释放速率也可以允许靶向器官或组织的持续摄取，达到治疗效果。
人血清白蛋白(hsa)是人体血液中的天然组份，由576个氨基酸组成的单肽链大分子蛋白质，其中包括56个赖氨酸残基、17个酪氨酸酚羟基和一个自由巯基，分子量为68400，有很长的生物半衰期。99mtc-hsa可用作血池显像剂，一般直接标记法的标记率不高，标记物稳定性差，使其在血液中的清除速率快，显像效果差。近年来使用双功能螯合剂偶联人血清白蛋白进行99mtc标记的报道较多，包括：dtpa(二乙三胺五醋酸)、dmp(2，3-二巯基丙酸)等双功能螯合剂。但99mtc-dtpa-hsa从血液中清除较快，需在注射后5～10min显像，且肝内有一定浓集，不利于一些疾病的诊断。较为成功的有99mtc-dmp-hsa(cambierjp，eta1.nuclmedcommun1997，18：31-37.)，该配合物的制备方法已经药盒化。除了上述99mtc标记显像剂外，还有62cu、67cu和68ga等放射性核素标记的hsa及其衍生物。虽然对白蛋白直接进行体外放射性核素标记已经是比较成熟的方法，但是其为人体提取物，价格昂贵，注射到体内可能会产生免疫排斥反应，而且蛋白质易于污染且容易变性，这些都在一定程度上限制其应用。由此可以看出，现有较为成功的血清白蛋白标记方法尚存在制备方法复杂、价格昂贵、容易感染病毒以及显像效果易受其它因素影响等缺点，若能提供一种具有制备方法简单、成本低、效果好的能与白蛋白有效结合的放射性标记物，将具有广阔的应用前景。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种放射性碘标记的蛋白结合配体。
本发明的另一目的在于提供上述放射性碘标记的蛋白结合配体的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述放射性碘标记的蛋白结合配体的应用。
本发明的技术方案如下：
一种放射性碘标记的蛋白结合配体，其结构式如下：
在本发明的一个优选实施方案中，所述放射性碘核素为131i、125i、124i或123i。
上述蛋白结合配体的制备方法，当r为oh时，其合成路线如下：
在本发明的一个优选实施方案中，包括如下步骤：
(1)将4-[(4-硼酸基苯基)丁酸4-bba溶解于反应溶剂中，分别加入相同摩尔量的二环己基碳二亚胺dcc和n-羟基琥珀酰亚胺nhs，室温搅拌反应10～12h，然后过滤除去副产物，将所得滤液滤液浓缩得到白色固体粉末，即4-[(4-硼酸基苯基)丁酸的活化酯4-bba-nhs；
(2)往4-[(4-硼酸基苯基)丁酸的活化酯4-bba-nhs中加入混合均匀的氧化亚铜和1，10-菲啰啉组成的催化剂；
(3)将步骤(2)所得的物料加入到放射性碘核素的乙腈溶液中，震荡反应，即可得到标记产物4-[i]iba-nhs；
(4)加入na2co3或naoh将其水解，并加入盐酸溶液中和，即可得到所述蛋白结合配体。
进一步优选的，所述反应溶剂包括二甲基甲酰胺、四氢呋喃和二甲基亚砜。
上述蛋白结合配体的另一制备方法，当r为衍生自peg、叶酸、多肽、表皮生长因子、蛋白质、核酸或多糖的基团时，其合成路线如下：
在本发明的一个优选实施方案中，包括如下步骤：
(1)将4-[(4-硼酸基苯基)丁酸4-bba溶解于反应溶剂中，分别加入相同摩尔量的二环己基碳二亚胺dcc和n-羟基琥珀酰亚胺nhs，搅拌反应过夜。过滤除去副产物，将滤液浓缩得到白色固体粉末，即4-[(4-硼酸基苯基)丁酸的活化酯4-bba-nhs；
(2)往4-[(4-硼酸基苯基)丁酸的活化酯4-bba-nhs中加入混合均匀的氧化亚铜和1，10-菲啰啉组成的催化剂；
(3)将步骤(2)所得的物料加入到放射性碘核素的乙腈溶液中，震荡反应，即可得到标记产物4-[i]iba-nhs；
(4)将4-[i]iba-nhs和带胺基结构分子r于二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或水中20-70℃反应30-60min，同时加入少量三乙胺、吡啶或n，n-二异丙基乙胺以促进反应发生，反应完成后将溶剂吹干除去，纯化后得到所述蛋白结合配体。
进一步优选的，所述反应溶剂包括二甲基甲酰胺、四氢呋喃和二甲基亚砜。
上述蛋白结合配体在制备诊疗试剂中的应用。
本发明的有益效果是：本发明提供的放射性标记的蛋白结合配体标记方法简单、成本低、稳定性好。动物活体试验结果表明该白蛋白结合配体在血液中有较高的摄取和较长时间的滞留，具有较高的靶/非靶比值。将其修饰到靶向基团或是其他功能性基团上，可以明显改善化合物的药代动力学性质，延长其血液半衰期以适合用作血池、淋巴和肿瘤诊疗试剂。
附图说明
图1为本发明实施例2中4-[131i]iba-nhs分别在生理盐水和乙腈中24h内的tlc分析图。
图2为本发明实施例2中4-[131i]iba和4-131iba-nhs的hplc分析图。
图3为本发明实施例2中4-[131i]iba分别在有无人血清白蛋白存在的情况下的透析实验结果图。
图4为本发明实施例2中4-[131i]iba和4-[131i]iba-peg分别在有无牛血清白蛋白存在的情况下的透析实验结果对比图；
图5为本发明实施例2中4-[131i]iba，4-[131i]iba-peg和4-[131i]iba-fa分别在小鼠体内的生物分布结果图；
图6为本发明实施例2中不同浓度前体与lo2正常干细胞共孵育10及48h后细胞毒性mtt实验；
图7为本发明实施例2中不同量的标记前体对4-iba与白蛋白结合的影响；
图8为本发明实施例2中的蛋白结合配体的microspect/ct显像图；
图9(a)为采用不同治疗方案治疗后小鼠肿瘤体积的变化趋势；(b)为治疗过程中小鼠体重的变化趋势：
图10(a)为4-[131i]iba的ic50曲线图：(b)为放射性碘标记的伊文氏蓝的ic50曲线图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1
1.4-[131i]iba-nhs的合成
将1g4-[(4-硼酸基苯基)丁酸(4-bba)溶解于15mldmf中，分别加入981mg二环己基碳二亚胺和548mgn-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌反应过夜。过滤除去副产物，将滤液浓缩得到白色固体粉末，即4-[(4-硼酸基苯基)丁酸的活化酯；
取1mg4-[(4-硼酸基苯基)丁酸的活化酯(4-bba-nhs)，向其中加入50μl混合均匀的氧化亚铜、1，10-菲啰啉的催化剂；将上述溶液加入到已吹干的放射性碘中，在室温下震荡反应30min，即可得到标记产物4-[131i]iba-nhs；加入适量na2co3将其水解即可得到目标产物4-[131i]iba。标记终产物通过hplc进行鉴定，其放射性出峰时间可与稳定的白蛋白配体4-[127i]iba的紫外出峰时间匹配(稳定配体4-[127i]iba的紫外出峰时间为3.92min，4-[131i]iba的放射性出峰时间为4.16min)。
2.4-[131i]iba-peg的合成
将4-[131i]iba-nhs和nh2-peg5000-n3于dmf中在室温下反应1h，加入10μln，n-二异丙基乙胺促进反应发生，最终得到目标化合物4-[131i]iba-peg：。
3.4-[131i]iba-fa的合成
将4-[131i]iba-nhs和fa-peg-nh2于二甲基甲酰胺(dmf)中在室温下反应1h，可加入10μln，n-二异丙基乙胺促进反应发生。反应完成后通过hplc进行纯化，最终得到目标化合物4-[131i]iba-fa。
以上合成所用稳定参考化合物4-[127i]iba以及氧化亚铜、1，10-菲啰啉、二甲基甲酰胺、n，n-二异丙基乙胺、na2co3等常用试剂均为市售获得。
实施例2
以下是对上述实施例1的方法所合成的标记物4-[131i]iba、4-[131i]iba-peg或4-[131i]iba-fa的性能测定描述：
1.tlc和hplc的分析鉴定
4-[131i]iba的tlc分析体系如下：石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1的体系，在不同的时间点分别用硅胶铝板测tlc进行分析；生理盐水的体系在不同时间点分别用聚酰胺薄膜测tlc进行分析。4-[131i]iba的标记速率较快，在10min内已经超过99％；放化纯度高，大于95％；性质稳定不易分解，直至24h它在生理盐水和乙腈溶剂中依然是稳定存在的，tlc显示只有一个单峰出现，结果如图1所示。
4-[131i]iba的hplc分析体系如下：perkin-elmerseries200lc配备waters2784双吸收波长紫外检测器和bioscan放射性检测器，waterssymmetryc18分析柱(5μm，150x3.9mm)。流速1ml/min，淋洗梯度：0～30min：80％甲醇和20％水，保持不变。hplc结果见图2，结果表明4-[131i]iba-nhs和4-[131i]iba的保留时间分别为5.23min和4.16min，并以此计算放射化学纯度大于95％。
2.脂水分布系数测定
131i标记的白蛋白配合物4-[131i]iba及其衍生物的脂水分布系数(logp)测定通过以下步骤完成：
将100μl稀释后的放射性注射液加入到含有2.9ml超纯水和3ml正辛醇混合液的离心管中(pbs和正辛醇在实验前一天混合并静置，以供第二天进行实验时使用)，涡旋震荡2min之后，6000rpm离心5min，从水相及正辛醇相中各取100μl液体并通过γ-counter放射性计数。实验重复三次取平均值。脂水分布系数(logp)的计算公式为：
p＝(ia-i)/(ib-i)
其中ia代表有机相中测定的放射性计数、ib代表水相中测定的放射性计数、i代表背景计数。
通过计算，最终测定各放射性标记的靶向探针的脂水分布系数。
结果表明，4-[131i]iba的脂水分布系数logp＝1.01±0.03，呈脂溶性性质；4-[131i]iba-peg的logp＝-1.438±0.03，呈现出水溶性，这说明有peg修饰的标记探针的水溶性明显改善；4-[131i]iba-fa的logp＝0.52±0.03。
3.白蛋白结合性能的测定
用透析实验分别测定4-[131i]iba和4-[131i]iba-peg的白蛋白结合能力。所用透析袋的截留分子量是8000-14000da，透析液为1000ml的pbs7.4溶液。准确称取30mg的人血清白蛋白(hsa)或牛血清白蛋白(bsa)溶于3ml的pbs7.4中，加入标记好的4-[131i]iba18mbq，混匀加入透析袋中，之后置于透析液中进行透析。在不同的时间点分别取1ml的透析液到离心管中，并立刻补充1mlpbs，用γ-counter测量取出的透析液的放射性计数。同时用放射性活度计测量不同时间点透析袋内的放射性。作为对照，取另一管不加hsa或bsa的pbs7.4，加入同等剂量的4-[131i]iba，置于透析袋中进行透析，用同样的方式测量其放射性量。将上述实验重复三次求平均值，最终做出浓度/放射性活度百分比曲线，如图3所示，结果表明，在血清白蛋白存在的条件下，放射性标记物不易从透析袋中透析出来，直至24h大部分放射性依然被截留在透析袋内，而没有加白蛋白的透析袋中放射性标记物很快被清除出去，说明4-[131i]iba能与血清白蛋白结合，且比较稳定，在24h内没有发生分解。
为了比较经peg修饰后4-[131i]iba与白蛋白结合能力的变化，用上述同样的方法在牛血清白蛋白(bsa)中进行测试，结果如图4所示，与4-[131i]iba比较，经过peg修饰后，在牛血清白蛋白存在的情况下更多的放射性被截留在透析袋内，而不加牛血清白蛋白的透析袋内放射性被清除的很快，说明peg修饰后的4-[131i]iba-peg与白蛋白同样可以有效结合。
4.生物分布实验
实验选用18-20g的雌性balb/c小白鼠。每组小鼠3只，每只小鼠通过尾静脉注射放射性示踪剂370kbq，在不同的时间点将其处死，解剖，收集血液及其脏器，测量血液和脏器的重量，经γ-counter测量其放射性计数，计算不同时间点单位质量脏器中所含的放射性量，用％id/g来表示。结果如图5所示。结果表明，在注射放射性标记物4-[131i]iba后30min，血液中的放射性量为10.51±2.58％id/g。而主要器官如肝、肺、肾中的放射性含量则分别为2.93±0.11％id/g，4.47±0.13％id/g，5.68±0.40％id/g，相比之下血液中的放射性含量最高。而且甲状腺作为对碘离子最敏感的腺体，它的摄取在各个时间段均非常低，说明该示踪剂在体内非常稳定，没有发生脱碘。而放射性量在血液/脏器中的比率在各个观察时间段内也均是最高的，达到了较高的靶/非靶比值。实验结果说明示踪剂4-[131i]iba有效延长了血液半衰期，降低了肾脏清除率，是一种较为理想的血池显像剂。
为了更好的改善4-[131i]iba的药代动力学性质，引入peg对其进行修饰，目的是增强其水溶性，进一步延长血液半衰期。4-[131i]iba-peg通过尾静脉注射到小鼠体内进行生物分布实验，在30min后，血液中的放射性含量为24.79±0.89％id/g，远高于其他组织脏器。在更长的时间点如24h之后，血液中依然含有较高的放射性滞留。
在引入叶酸靶向基团后，探针在血液中的循环时间依然得到保持。由于肾脏组织高表达叶酸受体，故探针在肾脏中的摄取较高，进一步说明叶酸基团的靶向性。在肝肺等其他器官中，放射性滞留较低，更有利于肿瘤成像。
5.细胞毒性mtt实验
实验选用正常肝细胞lo2，孵育后收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，用96孔板进行铺板，细胞密度为10000个/孔。至细胞贴壁后依次加入不同浓度梯度4-iba的前体药物，并设5个复孔，在37℃分别孵育10h，24h后加5mg/ml的mtt溶液10μl，继续培养4h后终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入150μl二甲基亚砜，将细胞中的甲瓒溶解后用酶联免疫检测仪在490am波长处检测吸光度值，可间接反映活细胞数量。结果如图6所示，加入不同浓度的前体药物并没有对细胞活性产生显著的影响。
6.不同浓度前体对4-iba与蛋白结合的影响
取放射性标记的示踪剂4-[131i]iba约5μci，与2mg/ml的人血清白蛋白混合，同时加入不同浓度梯度的4-iba前体并孵育30～60min，后将其置于10kda的超滤离心管中进行离心，设置离心机转速10000r/min，离心10min，分别收集离心管上、下层的液体在γ-counter检测器中测其放射性计数。由图7可知，不同浓度的前体分别加入到4-[131i]iba与白蛋白结合的反应体系中，4-[131i]iba与白蛋白结合的量没有受到影响。
7.小鼠microspect显像
按实施例制备好放射化学纯度大于95％的化合物4-[131i]iba-peg，取0.1ml(约3.7mbq)通过尾静脉注射于健康的雌性balb/c小鼠(体重约18-20克)，并立即进行静态spect/ct图像采集。在注射放射性示踪剂后的不同时间点分别对其进行扫描，显像结果参见图8。4-[131i]iba-peg可在小白鼠血管和心脏中滞留，且随着时间延长至4h仍然可以看到血池中较为清晰的显像，说明该结构在生物体内具有较长的血液半衰期，为心血管系统疾病的诊断、疗效以及预后评价提供可能。
8.放射性核素治疗实验
对4-[131i]iba的肿瘤治疗效果进行考察。在雌性balb/c小鼠(体重约18-20克)右后腿皮下接种4t1肿瘤细胞，待一周后肿瘤直径长到约0.5cm后开始进行治疗。将15mbq4-[131i]iba通过尾静脉注射到小鼠体内，每隔一天通过游标卡尺测量小鼠肿瘤大小，同时测量小鼠的体重变化。肿瘤体积v＝a×b2/2。在双疗程治疗组中，第一次注射15mbq4-[131i]iba后第5天，再次注射15mbq4-[131i]iba。作为对照，设置生理盐水及na131i对照组，分别注射200μl生理盐水及15mbqna131i溶液。治疗结果参见图9。4-131iba治疗组肿瘤的生长趋势明显趋缓。双疗程组的肿瘤生长抑制效果更为明显。生理盐水组及na131i组的肿瘤生长速度明显高于治疗组。在注射放射性核素之后，小鼠的体重轻微下降并很快恢复正常，治疗过程中没有小鼠死亡现象。
4-[131i]iba是一种新的放射性标记的白蛋白配合物，与现有常用血池显像剂相比，其放射性射线穿透性强，可以进行活体无创血池显像。与现有放射性血池显像剂99mtc-rbc和99mtc-hsa的明显不同之处在于后二者均为生物提取物，标记过程复杂，标记产物不稳定，合成之后需要进行多步纯化，这也不可避免的造成了产物和放射性的损失；且蛋白质容易变性，还可能产生免疫排斥反应，价格昂贵，而且也容易感染病毒。放射性核素标记的伊文氏蓝作为一种较好的血池显像剂被广泛研究(cn201310157168.9)。通过竞争结合的方法测得4-[131i]iba和放射性碘标记的伊文氏蓝的ic50值分别为：46.5μm及25.1μm(图10)，伊文氏蓝对蛋白表现出更高的亲和力。但是在肿瘤和血池显像中，非常高的亲和力并非是最优选择，我们希望找到一种动态平衡，在显像剂与蛋白结合之后能够使得病灶部位达到较高的摄取，又希望滞留在正常组织和血液中的放射性被较快清除，这样既增加了靶与非靶的对比度，又减少了放射性药物对正常组织的损伤。因而亲和力的高低并不是评价显像剂好坏的最重要指标，需结合其他因素综合考虑其利弊。而经一系列实验证明4-[131i]iba与蛋白的结合能力足够使得其用于血池，淋巴和肿瘤的显像剂。再者伊文氏蓝标记物的制备过程需要较为严酷的条件和繁琐的步骤：1)需要连接双功能螯合剂(nota或dota)对其进行化学修饰才能标记核素；2)所运用的正电子核素大多需要加速器进行制备，操作繁琐且运行成本较高；3)核素的半衰期较短，无法长途转运；4)标记后需用高效液相色谱进行纯化以达到应用要求。而相比之下，放射性碘标记的4-iba具有放射性标记的伊文氏蓝探针不具备的优点：1)反应简单快速，短时间内即可完成标记并达到很高产率；2)标记率高，无需进行纯化，可满足医院大量制备需求，且多余的标记前体生物毒性低，对4-iba与白蛋白的结合不会造成影响；3)在分子结构中可以通过化学反应对其进一步修饰，得到性能更加优良的放射性示踪剂或治疗药物，不需额外引入双功能螯合剂；4)放射性碘具有多种同位素，131i、124i可分别作为spect及pet的成像核素，131i及125i可作为放射性治疗核素，可满足不同的使用需求。总的来说，4-[131i]iba具有一般血池显像剂所不具备的优点：该化合物为有机小分子，分子结构简单，标记条件温和，室温下即可反应，标记方法简便易行，标记率高且容易得到高放射化学纯度的配合物，存放时间长，稳定性好，有效地延长了血液半衰期，降低了肾脏清除率。
本发明所用放射性核素还可以包括其他放射性碘的同位素，如125i、124i等，制备方法类似。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。