一种3-芳基香豆素类化合物的应用的制作方法

本发明涉及药物活性技术领域，具体提供一种3-芳基香豆素类化合物的应用。

背景技术：

3-芳基香豆素是天然活性化合物的基本结构，其在化学结构上与黄酮、异黄酮以及反式二苯乙烯骨架有相似之处。3-芳基香豆素类化合物具有多种药理活性，如抗癌、抗氧化、抗白血病、抗肿瘤、抗凝血、抗过敏、抗炎以及腺苷受体亲和性和单胺氧化酶b抑制等，具有重要的研究价值和应用潜力。

糖尿病是世界上最常见的代谢紊乱疾病之一，糖尿病在成人中的发病率在过去几十年一直在增加。随着人民生活水平的提高、人口的老龄化和生活方式的改变，糖尿病目前已是继心脑血管疾病和恶性肿瘤之后的第三大威胁人类健康的非传染性疾病，给社会和经济带来了沉重的负担，严重威胁人类的健康。糖尿病本身并不可怕，可怕的是它的并发症。糖尿病并发症涉及全身各个器官，是导致血脑血管疾病、肾病、失明、足坏死等严重疾病的主要原因。

葡萄糖苷酶是生物体内糖代谢途径中的重要成员之一。α-葡萄糖苷酶抑制剂是一类以延缓肠道碳水化合物吸收而达到治疗糖尿病的口服降糖药物。α-葡萄糖苷酶抑制剂是比较成熟的治疗糖尿病药物，已广泛应用于临床，目前已经成为单纯饮食控制不住的2型糖尿病的首选药物及1型糖尿病患者使用胰岛素治疗的首选辅助药物。其作用机制为：竞争性抑制位于小肠的各种α-葡萄糖苷酶，使淀粉类分解为葡萄糖的速度减慢，从而减缓肠道内葡萄糖的吸收，降低餐后高血糖。α-葡萄糖苷酶抑制剂不刺激β细胞分泌胰岛素，但可降低餐后胰岛素水平，说明可增加胰岛素的敏感性。目前多种α-葡萄糖苷酶抑制剂已经被批准在临床用于糖尿病的治疗，如拜唐苹(阿卡波糖)，倍欣(伏格列波糖)和米格列醇等。

糖基化终产物(ages)通过不同的机制损伤细胞和组织，在未患糖尿病受试者组织中缓慢增加，但在糖尿病患者体内，由于循环中持续高糖水平加速了ages的产生，使其大量蓄积。产生的过量ages不仅可以与蛋白质交联，影响蛋白质性能，也可以通过与特异受体结合，发生反应来改变细胞功能，从而导致机体的病理变化。ages是糖尿病发病机制的重要因素，已经涉及糖尿病及其并发症。ages与糖尿病肾病、视网膜病变、神经病变、动脉粥样硬化等糖尿病并发症的发生发展密切相关。美国糖尿病控制与并发症实验(dcct)和英国糖尿病前瞻性研究(ukpds)等结果证明，皮肤中ages浓度的异常升高是提示糖尿病和未来可能发生并发症的生物标志。

21世纪以来，人口老化使世界许多国家面临着艰巨的养老任务。医学研究表明，人的衰老与体内的自由基有关。在正常情况下，人体的抗氧化防御系统能清除体内产生的自由基，而失去平衡时，由于自由基能对脂质、蛋白质、糖等生物大分子产生损害，进而对机体产生破坏，导致各种疾病的发生。研究表明，自由基与衰老、心血管疾病、糖尿病心血管并发症等疾病相关。抗氧化剂可以有效地防治一些与自由基相关的疾病的发生。

综上所述，国内外现有药物对于治疗糖尿病和糖尿病引起的并发症表现出了较好疗效。但具有较好协同生物活性的药物还亟待开发，这就需要我们对此类化合物进行深入活性研究，开发出具有预防和治疗糖尿病及其并发症的新药物。

技术实现要素：

本发明的技术任务是针对上述存在的问题，提供一种3-芳基香豆素类化合物的应用。

本发明还提供了一种预防和/或治疗糖尿病及其并发症的组合物。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

结构式为(ⅰ)的3-芳基香豆素类化合物的应用，

其中，r1、r2、r3、r4为h、oh、卤素或och3；

r5、r6、r7、r8、r9为h、oh、卤素或och3。

作为优选，所述化合物用于制备α-葡萄糖苷酶抑制剂。

作为优选，所述化合物用于制备ages形成抑制剂。

作为优选，所述化合物用于制备抗氧化剂。

所述抗氧化剂用于清除羟基自由基和dpph自由基活性。

作为优选，结构式为(ⅰ)的3-芳基香豆素类化合物的r7为卤素。

作为优选，结构式为(ⅰ)的3-芳基香豆素类化合物为

一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，其有效成分为式(ⅰ)所述3-芳基香豆素类化合物。

一种ages形成抑制剂，其有效成分为式(ⅰ)所述3-芳基香豆素类化合物。

一种抗氧化剂，其有效成为式(ⅰ)所述3-芳基香豆素类化合物。

申请人发现，以结构式为(ⅰ)的3-芳基香豆素类化合物作为有效成分的抗氧化剂、葡萄糖苷酶抑制剂、ages形成抑制剂在预防和/或治疗糖尿病及其并发症方面均具有显著效果。

本发明的预防和/或治疗糖尿病及其并发症的组合物，其有效成分为式(ⅰ)所述3-芳基香豆素类化合物。

所述预防和/或治疗糖尿病及其并发症的组合物为药品或保健品。

在需要的时候，可以在所述组合物中加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。

所述预防和/或治疗糖尿病及其并发症的组合物可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

本发明所述预防和/或治疗糖尿病及其并发症的组合物可以通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。

附图说明

图1是化合物4、化合物10和化合物19长期降低糖尿病小鼠血糖值的折线图；

图2是各组小鼠灌胃相应药物16天后的体重变化图示；

图3是化合物4、化合物10和化合物19对糖尿病小鼠耐糖量的影响示意图。

具体实施方式

下面将结合实施例，对本发明的3-芳基香豆素类化合物的应用作进一步详细说明。

下述实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

本发明的实施例中结构式为(ⅰ)的3-芳基香豆素类化合物选自下列24种化合物，该24种化合物的结构式及编号如下：

以编号为17的化合物的制备方法为例来说明该24种化合物的制备方法。

化合物17(3-(4’-羟基苯基)-7,8-二羟基香豆素)的制备

在三口瓶中依次加入4-羟基苯乙酸1.52g(10mmol)，2,4-二羟基苯甲醛1.38g(10mmol)，三乙胺5.56g(55mmol)和乙酸酐6.12g(60mmol)，搅拌下于110℃～115℃反应6h(tlc监测)。倒入水中，搅拌(析出大量固体)，静置，抽滤，滤饼用水洗涤至洗液呈近中性，晾干后用乙酸乙酯/石油醚重结晶得类白色结晶粉末7,8-二乙酰氧基-3-(4'-乙酰氧基苯基)香豆素，收率约85％。

在三口瓶中加入7,8-二乙酰氧基-3-(4'-乙酰氧基苯基)香豆素1.35g(5mmol)，10％盐酸20ml和乙醇5ml，搅拌下于80℃反应5h～6h(tlc监测)。倒入50ml冰水中，搅拌(析出大量淡黄色固体)，静置，抽滤，滤饼用水洗涤至滤液近中性，滤饼晾干用etoh/h2o重结晶得淡黄色结晶粉末3-(4’-羟基苯基)-7,8-二羟基香豆素，收率约85％。

用类似方法合成其余化合物。

【实施例1】24种化合物体外α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定

1.反应溶液的配制

(1)配制底物α-葡萄糖苷(pnpg)溶液：精确称取0.3766gpnpg，加适量0.1mol/l磷酸缓冲液(ph为6.8)溶解，再用容量瓶准确定容到50ml，配制成25mmol/l的母液。将母液分别稀释成0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mmol/l7个不同梯度的标准品溶液，备用。

(2)配制α-葡萄糖苷酶的酶溶液：将冻干酶粉用0.01mol/l磷酸缓冲液(ph为6.8)溶解，配制成2u/ml的母液。再将酶液分别稀释，配制成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0u/ml的酶溶液，备用。

(3)配制阿卡波糖标准溶液(抑制剂)：精确称取10mg阿卡波糖水合物标准品，用容量瓶准确定容到10ml，配制成1000μg/ml的阿卡波糖标准母液。将母液分别稀释成0.1、0.5、1、5、10、20、40、60μg/ml不同梯度的标准品溶液，备用。

(4)0.2mol/l的na2co3：称取2.16gna2co3于烧杯中，加入适量蒸馏水溶解，并定容到100ml，4℃下保存，备用。

2.体外α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定原理

由于pnpg在α-葡萄糖苷酶的作用下能水解产生葡萄糖和pnp，pnp在405nm处有最大吸收，所以测定其吸光度，根据公式便可计算出各样品α-葡萄糖苷酶的抑制率及ic50值。

3.α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定

测定方法参照masaohattori等试验条件，并做调整。实验分为空白组、对照组、样品空白组和样品组，各反应物按表中剂量在96孔板中进行加样，每组3个平行。按表1依次加入pbs缓冲液、抑制剂溶液和底物，混合均匀，于37℃水浴保温10min，结束后，取出，加入37℃水浴的酶溶液，充分混匀，于37℃水浴反应20min，结束后加入70μl0.2mol/l的na2co3溶液中止反应。由于pnpg在α-葡萄糖苷酶的作用下能水解产生葡萄糖和pnp，pnp在405nm处有最大吸收，测定其吸光度。

表1各反应物添加计量和顺序(单位：μl)

4.计算24种化合物对α-葡萄糖苷酶抑制活性的ic50值

根据公式便可计算出各样品α-葡萄糖苷酶的抑制率及ic50值。

其中，ac为对照组吸光值；ab为空白组吸光值；as为样品组吸光值；asb为样品空白组吸光值。

ic50(halfmaximalinhibitoryconcentration)是指被测量的拮抗剂的半抑制浓度。它能指示某一药物或者物质(抑制剂)在抑制某些生物程序(或者是包含在此程序中的某些物质，比如酶，细胞受体或是微生物)的半量。在酶活力抑制方面，一定浓度的药物可以抑制α-葡萄糖苷酶活力，使之下降50％，该浓度称为50％抑制浓度，即该酶此时的活性是其原有活性的一半。ic50值可以用来衡量药物抑制该酶作用的强弱，即抑制作用越强，该数值越低。

结果见表2。

表224种化合物及阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的ic50值

5.试验结论

体外α-葡萄糖苷酶抑制试验结果表明，上述3-芳基香豆素化合物对α-葡萄糖苷酶具有较好的抑制效果，其中15号化合物的抑制作用最强，其ic50值为0.37ug/ml。4-芳基香豆素类化合物对α-葡萄糖苷酶抑制作用的ic50值为0.25ug/ml-2.574ug/ml，3-芳基香豆素类化合物与其抑制作用相当。

【实施例2】24种化合物体外ages形成抑制活性的测定

1.ages形成抑制活性测定原理

age具有自发荧光的特性，在近紫外光的照射下，能够在可见光波段发射荧光。在ages的无创荧光快速检测技术研究中，graaff等使用峰值波长为370nm的激发光照射人体皮肤，发现在420～600nm波段产生自体荧光。

2.体外ages形成抑制活性的测定

向含有10mg/ml牛血清白蛋白的50mmpbs(ph7.4)缓冲液中加入0.2m的葡萄糖，并加入0.02％叠氮化钠，以防止细菌增长。此反应混合物(3ml)与各种浓度的目标化合物(1ml)混合。在37℃温育14天后，测定age的荧光强度。用一个荧光分光光度计用激发波长和发射波长分别为350nm和420nm的波长测定。一式三份实验。氨基胍盐酸盐被用作阳性对照化合物。

3.计算24种化合物对ages形成的ic50值

ic50(halfmaximalinhibitoryconcentration)是指被测量的拮抗剂的半抑制浓度。它能指示某一药物或者物质(抑制剂)在抑制某些生物程序(或者是包含在此程序中的某些物质，比如酶，细胞受体或是微生物)的半量。在ages形成抑制方面，一定浓度的药物可以抑制ages的形成，ic50值可以用来衡量药物抑制ages形成作用的强弱，即抑制作用越强，该数值越低。

结果见表3。

表324种化合物及氨基胍盐酸盐对ages形成的ic50值

4.试验结论

体外ages抑制试验结果表明，上述3-芳基香豆素化合物对ages形成具有较好的抑制效果，其中5号化合物的抑制作用最强，其ic50值为0.36ug/ml。4-芳基香豆素类化合物对ages形成抑制作用的ic50值为0.468ug/ml-33.418ug/ml，3-芳基香豆素类化合物对ages形成的抑制效果优于4-芳基香豆素类化合物。

【实施例3】24种化合物体外抗氧化活性的测定

1.清除自由基能力的测定原理

(1)清除羟基自由基(·oh)能力的测定原理

利用fenton反应产生羟自由基：h2o2+fe²⁺＝·oh+h2o+fe³⁺在反应体系中加入水杨酸，fenton反应生成的羟自由基与水杨酸反应，生成于510nm处有特殊吸收的2,3-二羟基苯甲酸，反应式如下：如果向反应体系中加入具有清除羟自由基功能的被测物，就会减少生成的羟自由基，从而使有色化合物的生成量相应减少。采用固定反应时间法，在510nm处测量含被测物反应液的吸光度，并与空白液比较，以测定被测物对羟自由基的清除作用。

(2)清除dpph自由基能力的测定原理

dpph法于1958年被提出，广泛用于定量测定生物试样和食品的抗氧化能力。此法是根据dpph自由基有单电子，在517nm处有一强吸收，其醇溶液呈紫色的特性。当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系，因而可用分光光度计进行快速的定量分析。

2.体外抗氧化活性的测定

(1)体外清除羟基自由基活性的测定

h2o2与fe²⁺反应产生·oh，在体系中加入水杨酸捕捉并产生有色物质，该物质在510nm下有最大吸收。分别取0.3％h2o2,1.0mmo1/lfes04(用10mmol/lh2so4溶液配置)，1.0mmo1/l水杨酸(用无水乙醇配置)1.0ml于10.0ml试管中，再加入不同浓度的样品溶液各1.0ml。最后以1ml0.3％h2o2启动反应，在37℃水浴中反应30min，以蒸馏水作空白对照，vc做阳性对照，在510nm下测定反应液的吸光值，重复三次试验。

(2)体外清除dpph活性的测定

准确称取10mgdpph(2,2-联苯基-1-苦基肼基)于50ml容量瓶中，用无水乙醇溶解定容，避光保存，使用前稀释成0.04mg/ml使用。取2.0ml不同浓度的样品溶液于10.0ml试管中，加入2.0ml上述的dpph溶液，摇匀，避光室温保存30min，用紫外-可见分光光度计于517nm测吸光值，以无水乙醇作空白，vc做阳性对照，重复三次试验。

2.计算24种化合物对抗氧化的ic50值

ic50(halfmaximalinhibitoryconcentration)是指被测量的拮抗剂的半抑制浓度。它能指示某一药物或者物质(抑制剂)在抑制某些生物程序(或者是包含在此程序中的某些物质，比如酶，细胞受体或是微生物)的半量。在自由基清除方面，一定浓度的药物可以清除自由基，使之下降50％，该浓度称为50％抑制浓度。ic50值可以用来衡量药物抗氧化作用的强弱，即抗氧化作用越强，该数值越低。

结果见表4。

表424种化合物及维生素c对自由基清除的ic50值

3.试验结论

体外抗氧化试验结果表明，上述3-芳基香豆素化合物对羟基自由基、dpph自由基具有较好的清除效果，其中20号化合物的清除作用最强，其清除羟基自由基的ic50值为348.93ug/ml，其清除dpph自由基的ic50值为1.90ug/ml。4-芳基香豆素类化合物对羟基自由基清除作用的ic50值为289ug/ml-938ug/ml，3-芳基香豆素类化合物对羟基自由基的清除效果与之相当。4-芳基香豆素类化合物对dpph自由基清除作用的ic50值为3.39ug/ml-543.121ug/ml，3-芳基香豆素类化合物对dpph自由基的清除效果优于4-芳基香豆素类化合物。

【实施例4】化合物4、10、13、15和19对糖尿病小鼠急性抗高血糖试验

1.stz诱导糖尿病

选用雄性昆明小鼠(18-23g)，在昼夜交替恒温(20-25℃)控制的环境适应性饲养3天。配置ph为4.5的0.1m柠檬酸缓冲溶液，现配现用，并用该溶液溶解链脉佐菌素(stz)。小鼠禁食不禁水12小时后，以110mg/kgstz的剂量腹腔注射。7天后测量空腹血糖值，将空腹血糖值>11.1mmol/l定为糖尿病小鼠。

2.分组及给药

取66只糖尿病小鼠，按空腹血糖水平随机分成11组，每组6只。

(1)模型组：灌胃给药相应体积的生理盐水；

(2)阳性对照组：灌胃给药10mg/kg的格列本脲；

(3)化合物4分为低、中、高剂量组(10mg/kg、30mg/kg、100mg/kg)灌胃给药；

(4)化合物10分为低、中、高剂量组(10mg/kg、30mg/kg、100mg/kg)灌胃给药；

(5)化合物13分为低、中、高剂量组(10mg/kg、30mg/kg、100mg/kg)灌胃给药；

(6)化合物15分为低、中、高剂量组(10mg/kg、30mg/kg、100mg/kg)灌胃给药；

(7)化合物19分为低、中、高剂量组(10mg/kg、30mg/kg、100mg/kg)灌胃给药。

3.血糖测量及结果分析

用拜耳血糖仪测量糖尿病小鼠灌胃药物后0，1.5，3，5，7，9小时的空腹血糖值。

血糖相对于0时的变化百分比采用以下公式计算：血糖变化百分比(％)＝[(gi–gt)/gi]·100％

其中，gi为初始(0h)血糖值；gt为小鼠灌胃药物后各个时间点的血糖值。结果见表5

表55种药物快速降低糖尿病小鼠血糖的变化百分比

每个值都是六只小鼠血糖变化百分比的平均值±标准差

*在同一时间p<0.05与模型组比较(n＝6)。

通过对糖尿病小鼠急性抗高血糖试验结果表明，化合物4、化合物10、化合物13、化合物15和化合物19五种化合物的三个剂量组(10mg/kg，30mg/kg和100mg/kg)及阳性对照药品格列本脲对stz诱导的糖尿病小鼠均具有良好至显著的急性降糖活性。其中，化合物19导致血糖水平的降低最显著，其在剂量30mg/kg、时间9小时时观察到最强的降糖效应(74.54％)。4-芳基香豆素类化合物在剂量30mg/kg、时间7小时时观察到最强的降糖效应(77.14％)，3-芳基香豆素类化合物与其作用效果相当。

【实施例5】化合物4，10和19对正常小鼠急性降血糖试验

1.分组及给药

取36只健康雄性昆明小鼠，按空腹血糖水平随机分成6组，每组6只。

(1)正常组：灌胃给药相应体积的生理盐水；

(2)阳性对照组：灌胃给药10mg/kg的格列本脲；

(3)化合物4分为低、中、高剂量组(10mg/kg、30mg/kg、100mg/kg)灌胃给药；

(4)化合物10分为低、中、高剂量组(10mg/kg、30mg/kg、100mg/kg)灌胃给药；

(5)化合物19分为低、中、高剂量组(10mg/kg、30mg/kg、100mg/kg)灌胃给药；

2.血糖测量及结果分析

用拜耳血糖仪测量健康小鼠灌胃药物后0，1.5，3，5，7，9小时的空腹血糖值。

血糖相对于0时的变化百分比采用以下公式计算：

血糖变化百分比(％)＝[(gi–gt)/gi]·100％。其中，gi为初始(0h)血糖值；gt为小鼠灌胃药物后各个时间点的血糖值。

结果见表6

表63种化合物快速降低正常小鼠血糖值变化百分比

每个值都是六只小鼠血糖变化百分比的平均值±标准差

*在同一时间p<0.05与正常组比较(n＝6)。

综合实施例四和实施例五发现化合物19对糖尿病小鼠及正常小鼠均有较强的降糖效果，其中效果最好的浓度为30mg/kg；另外浓度为30mg/kg的化合物4、化合物10(化合物i的苷元)对糖尿病小鼠降糖活性也较强。所以选择化合物4、10和19进行糖尿病小鼠长期抗糖尿病活性的测定，灌胃浓度选为30mg/kg。

【实施例6】化合物4、10和19对糖尿病小鼠长期降血糖效果的试验

1.stz诱导糖尿病

同实施例四

2.分组及给药

取24只糖尿病小鼠，按空腹血糖水平随机分成4组，每组6只。

(1)正常组：灌胃给药相应体积的生理盐水；

(2)模型组：灌胃给药相应体积的生理盐水；

(3)阳性对照组：灌胃给药10mg/kg的格列本脲；

(4)化合物4(30mg/kg)灌胃给药；

(5)化合物10(30mg/kg)灌胃给药；

(5)化合物19(30mg/kg)灌胃给药；

每天给药1次，早上9:00～10:00，连续给药16天。

3.血糖测量及结果分析

糖尿病小鼠长期降糖试验的评价指标为1，4，7，10，13，16天灌胃药物后的空腹血糖值，以及小鼠16天的体重变化。结果分别见图1及图2。

图1中每个值都是六只小鼠血糖值的平均值±标准差，

*在同一时间p<0.05与模型组比较(n＝6)。

图2中每个值都是六只小鼠体重增长的平均值±标准差，

*p<0.05与模型组比较(n＝6)。

由以上结果可以看出化合物4、10和19对糖尿病小鼠具有良好的治疗作用，且这两组小鼠与模型组小鼠相比没有明显的消瘦现象。

【实施例7】化合物4、化合物10和化合物19的口服葡萄糖耐量(ogtt)试验

小鼠灌胃药物15天后，禁食不禁水12小时后灌胃相应药物，半小时后，灌胃葡萄糖(2g/kg)，测定其0，0.5，1，2，3小时空腹血糖值变化。血糖相对于0时的变化百分比采用以下公式计算：

血糖变化百分比(％)＝[(gi–gt)/gi]·100％

其中，gi为初始(0h)血糖值；gt为小鼠灌胃药物后各个时间点的血糖值。

结果见图3。

图3中每个值都是六只小鼠血糖变化百分比的平均值±标准差，

*在同一时间p<0.05与模型组比较(n＝6)。

结果表明化合物19可以改善糖尿病小鼠糖耐量能力，降低其血糖值。

综上以上实施例可以看出，化合物19具有良好的治疗糖尿病活性，通过抑制α-葡萄糖苷酶活性、抑制糖基化终产物(ages)的生成、清除自由基活性等多种途径发挥降低糖尿病病人餐后血糖以及治疗糖尿病并发症的作用。有希望发展为多靶点治疗糖尿病的药物，具有重要的研究价值和应用潜力。

【制剂实施例1】片剂

按照本领域已知的方法制备片剂，制备每片含有10mg活性成分的100片片剂的配方：

3-芳基香豆素………………………………………………1.0g

羟丙基纤维素………………………………………………0.2g

小麦淀粉……………………………………………………1.0g

乳糖…………………………………………………………10.0g

硬脂酸镁……………………………………………………0.3g

滑石粉………………………………………………………0.3g

【制剂实施例2】散剂

将3-芳基香豆素100g和乳糖100g经研磨、100目过筛、混合均匀后分装成1000包(每包200毫克，含活性物质100毫克)。

以上所述的实施例，只是本发明较优选的具体实施方式，本领域的技术人员在本发明技术方案范围内进行的通常变化和替换都应包含在本发明的保护范围内。