依瓦菊内酯在制备抗乳腺癌侵袭转移药物中的应用的制作方法

本发明涉及抗乳腺癌药物制备领域，具体涉及依瓦菊内酯(ivalin)在制备抗乳腺癌侵袭和转移的药物中的应用。

背景技术：

乳腺癌远端转移是患者死亡的主要原因。其中，乳腺癌细胞的上皮间质转化(epithelialmesenchymaltransition，emt)是乳腺癌转移的关键起始步骤。癌细胞通过emt获得更强的移动和侵袭能力，穿过细胞外基质及血管基底膜进入循环系统，形成远处继发性转移灶，有emt特征的癌细胞恶性程度更强。因此，抑制乳腺癌细胞emt，可能有效抑制乳腺癌的侵袭和转移。

间质细胞的特征，具体表现为：①上皮细胞标志物如e-cadherin和角蛋白表达降低或缺失；②间质细胞标志物如n-cadherin和vimentin表达增高。当ecadherin、cytokeratin的表达下降，n-cadherin和vimentin表达增高时，肿瘤细胞骨架系统排列发生变化，细胞生物学性状改变，黏附功能下降，易于脱离原发灶，向周围组织侵袭或转移。因此，emt是促进肿瘤侵袭、转移的主要机制之一，而e-cadherin、n-cadherin和vimentin等是emt的重要标志物上皮型钙黏蛋白(e-cadherin)、神经型钙黏蛋白(n-cadherin)和波形蛋白(vimentin)是重要的emt标志物。

天然产物一直是抗肿瘤药物的重要来源之一，本领域研究认为天然小分子化合物ivalin具有很强的抑制乳腺癌细胞生长的活性。但关于其对肿瘤细胞转移和侵袭的作用还未见报道。

技术实现要素：

根据多年的天然产物分子靶点追踪研究经验，发明人在研究过程中发现，天然小分子化合物ivalin具有很强的抑制乳腺癌细胞emt和侵袭转移的活性。基于这一原因，发明人利用分子生物学手段发现依瓦菊内酯有效抑制emt的转录因子的mrna水平和蛋白表达，抑制癌细胞的上皮间质化，从而抑制乳腺癌侵袭转移的新用途。基于该发现，本发明提供以下技术方案：

本发明目的之一在于提供依瓦菊内酯在抑制乳腺癌细胞上皮间质转化药物中的应用。

其中，依瓦菊内酯结构式如下：

优选的，上述应用中乳腺癌细胞为mda-mb-231、mda-mb-435和mcf-7细胞。

优选的，上述应用中依瓦菊内酯的使用浓度为1～4μmol/l。

本发明目的之二在于提供依瓦菊内酯在制备上调e-cadherin药物中的应用。

本发明目的之三在于提供依瓦菊内酯在制备下调n-cadherin药物中的应用。

本发明目的之四在于提供依瓦菊内酯在制备下调vimentin药物中的应用。本发明的有益效果

1.本发明研究发现ivalin具有抑制乳腺癌细胞侵袭和转移的作用，可作为抗乳腺癌细胞转移药物的活性成分，为抗乳腺癌药物的研发及抗肿瘤细胞转移药物的研发提供了新的研究思路。

2.ivalin作为抗乳腺癌转移药物使用，治疗窗较宽，在抑制癌变细胞的同时，对正常细胞的影响较小，使用安全。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1为实施例1中ivalin体外抑制乳腺癌细胞增殖结果图；

其中，图a为ivalin对mda-mb-435细胞抑制结果图；

图b为ivalin对mcf-7细胞抑制结果图；

图c为ivalin对mda-mb-231细胞抑制结果图；

图d为ivalin对hmle细胞抑制结果图。

图2为实施例2westernblot实验中ivalin对乳腺癌细胞中emt相关蛋白表达量的影响。

其中，图a为ivalin对mda-mb-231细胞蛋白表达量的影响及电泳图；

图b为ivalin对mda-mb-435细胞蛋白表达量的影响及电泳图；

图c为ivalin对mcf-7细胞蛋白表达量的影响及电泳图；

图3为实施例3划痕实验中ivalin对乳腺癌细胞迁移的抑制作用

其中，图a为ivalin对mda-mb-231细胞迁移的抑制结果图；

图b为ivalin对mda-mb-435细胞迁移的抑制结果图；

图c为ivalin对mcf-7细胞迁移的抑制结果图；

图4为实施例3transwell实验中ivalin对乳腺癌细胞迁移及侵袭的抑制作用其中，图a为ivalin对mda-mb-231细胞迁移及侵袭的抑制结果图；

图b为ivalin对mda-mb-435细胞迁移及侵袭的抑制结果图；

图c为ivalin对mcf-7细胞迁移及侵袭的抑制结果图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，现有技术中存在还未报道过关于ivalin对肿瘤细胞emt的作用，本申请提出了一种ivalin在制备抗乳腺癌细胞上皮间质转化药物中的应用。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本申请的技术方案。

本发明中所使用的依瓦菊内酯是从菊科植物金挖儿c.divaricatum中提取分离得到天然产物，其分离方法详细记载于发明人已发表的论文中(xie,w.d.,etal."sesquiterpenoidsfromcarpesiumdivaricatumandtheircytotoxicactivity."fitoterapia83.8(2012):1351-1355.)本领域技术人员可依照论文记载得到本发明所使用的依瓦菊内酯。

实施例1依瓦菊内酯体外抑制乳腺癌细胞的增殖

将对数生长期的mda-mb-231,mda-mb-435和mcf7细胞接种于96孔板中，每孔接种数量5×10³，待细胞完全贴壁后，加入一系列浓度的依瓦菊内酯药物，作用48小时后细胞计数，计算细胞生长抑制率。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

结果如附图1所示，依瓦菊内酯体外抑制乳腺癌mda-mb-231,mda-mb-435和mcf7细胞的增殖，48小时的ic50分别为3.15,3.73,3.56μmol/l，对正常乳腺细胞hmle48小时的ic50为9.44μmol/l，治疗窗较宽。

实施例2依瓦菊内酯抑制乳腺癌emt

(1)收集加入ivalin培养后的mda-mb-231,mda-mb-435和mcf7细胞蛋白样品并进行定量变性；

(2)制胶：先把玻璃板、梳子、制胶器进行清洗，清洗完毕后放到30℃烘干，用制胶器把玻璃板固定，按下列配表配制12％分离胶，灌胶，然后加入异丙醇进行密封，室温放置30min至分离胶凝固；回收异丙醇，用ddw清洗分离胶，按配表配制5％浓缩胶，灌完胶体后立即插入梳子，在室温下放置30min至胶体凝固。

(3)电泳：胶体凝固后，把梳子拔掉，然后重新固定玻璃板，放在电泳槽内，然后加入1xtris-gly电泳缓冲液，吸掉样品内的气泡以及碎胶，按照100μg的蛋白量进行上样，在邻侧的样品孔中加入marker5μl；连接电泳仪装置，在冰浴条件下进行电泳，上层胶：85v电泳40min至样品电泳至分离胶位置，然后下层胶：120v电泳2h左右至溴酚蓝移动到分离胶的底部，根据溴酚蓝的位置对电泳时间进行调整。

(4)转膜：把电泳完毕的胶取出，根据marker的位置裁剪出相应蛋白的位置以及区域，根据裁剪得到的相应胶的大小，裁剪相应大小的pvdf膜，对膜进行标记，用之前把膜放到甲醇中进行激活，激活完毕后再放入蒸馏水中。安装转膜夹：“负极-转膜黑色板-海绵-八层的滤纸-电泳胶-pvdf膜-八层滤纸-海绵-转膜夹白色板-正极”。安装完毕后，排空转膜夹中气泡，放入电转槽中，加入电转液至没过转膜夹。然后在恒流180ma的条件下进行转膜，时间设置为2.5h.

(5)封闭：封闭非特异性抗体：将转膜完毕后的pvdf膜取出，用tbs清洗膜上残留的电转液，然后放到5％的脱脂奶粉封闭液中封闭非特异性抗体，在室温下，水平慢摇床慢摇封闭1h.

(6)封闭一抗：非特异性抗体封完后，将膜放在一抗封闭盒中，封闭液需没过硝酸纤维素膜，在4℃水平摇床上慢速孵育并过夜。隔天回收一抗，用快速水平摇床清洗pvdf膜，用tbst清洗，洗三次，每次6min,然后再用tbs清洗残留的tbst一次，可根据情况适当延长时间或者增加清洗次数。

(7)封闭二抗：根据相应的说明书指示，将封闭完毕的一抗的膜放入对应的二抗封闭盒中，然后加入二抗，在室温下用慢速水平摇床慢摇1h，对二抗进行回收，孵育完毕后，再用快速水平摇床对pvdf膜进行清洗，用tbst清洗，洗三次，每次6min,然后再用tbs清洗残留的tbst一次。

(8)显色：用ecl发光试剂盒进行显色，通过x光片成像。将试剂盒中的a、b工作液按照1：1的比列混匀，配成发光液，根据蛋白的位置用发光液对相应区域进行覆盖，然后用保鲜膜固定到压片夹上。将压片夹放到暗室中，在室内根据压片夹上pvdf膜的大小裁剪相应大小的x光片并覆盖到相应区域，压片一段时间后，先把x光片放入显影液中进行显影成像，然后在蒸馏水中进行清洗，最后放在定影液中定影，再用蒸馏水进行清洗，最后悬挂晾干。

(9)数据分析：扫描所得成像的x光片，用image-j软件计算条带的灰度，并进行定量分析。

利用相差和荧光显微镜观察到依瓦菊内酯处理后的细胞形态间充质样变化发生了逆转。免疫荧光及westernblot结果显示，ivalin作用后e-cadherin表达上调，n-cadherin、vimentin表达下调(图2)，实时定量pcr检测到依瓦菊内酯引起e-cadherin的mrna水平上升，从而抑制乳腺癌的emt进程。

实施例3依瓦菊内酯抑制乳腺癌细胞迁移侵袭

划痕实验中取对数生长期的mda-mb-231,mda-mb-435和mcf7细胞铺于六孔板中，贴壁后，用浓度梯度的ivalin处理24h。用10μl移液枪头在单层细胞上呈“一”字划痕，用pbs清洗3次，加入浓度梯度的ivalin，孵育24小时后换成无血清培基孵育24小时后于倒置显微镜下观察并拍照。

transwell实验取对数生长期的mda-mb-231,mda-mb-435和mcf7细胞铺于六孔板中，贴壁后，用浓度梯度的ivalin处理24h。随后在8μm孔径的transwell小室底部铺30μgfibronectin,并置于超净台风干，将细胞培养基8：1稀释matrigel，室温晾干后，上室铺1×10⁵个乳腺癌细胞，下室加入500μl含20％血清的1640培养基，于37℃孵箱中培养，适宜时间后，将小室用pbs清洗3次，每次5min；将小室用4％的多聚甲醛固定15min，pbs清洗3次，每次5min；用结晶紫染色2h，在倒置显微镜下观察细胞从上室穿过下室的数量，并拍照统计分析比较。

图3及图4显示划痕和transwell实验表明依瓦菊内酯明显乳腺癌细胞迁移侵袭。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。