一种地鳖中生物碱的提取、纯化方法及应用与流程

本发明属于中药化学提取技术领域，尤其涉及一种地鳖中生物碱的提取、纯化方法及应用。

背景技术

地鳖(eupolyphagesinensis),又名土鳖、土元等,隶属昆虫纲(hexapeda)蜚蠊目(blattaria)鳖蠊科(corydiidae)昆虫。地鳖体内主要含有蛋白质、糖类、有机酸、甾体、生物碱、氨基酸、油脂、萜内脂、香豆素、酚类等有机物及多种微量元素，在中药的应用领域，具有悠久历史。

现代生化分子及药理试验证明：地鳖具有抗肿瘤的作用。国内已有大量文献报道指出地鳖具有抗突变、抗肿瘤的作用,并已经开始用于临床治疗。研究指出,地鳖纤溶活性蛋白组分具有抑制人微血管内皮细胞增殖的作用，地鳖水煎剂能明显抑制上皮生长因子激活的囊肿层里上皮细胞的增殖；地鳖能抑制肝癌、胃癌细胞的呼吸，能抑制白血病患者白细胞等，同时还具有抗移码突变的能力；说明：地鳖具有良好的抑制肿瘤的作用,其具有临床应用价值的前景。

目前，对于地鳖中，有效成分的研究并不明确，无法确认地鳖中真正起到实质作用的物质，严重限制了地鳖在临床中的应用。

因此，研发出一种地鳖中生物碱的提取、纯化方法及应用，用于解决现有技术中，地鳖中有效成分不明确，严重限制其应用的技术缺陷，成为了本领域技术人员亟待解决的问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种地鳖中生物碱的提取、纯化方法及应用，用于解决现有技术中，地鳖中有效成分不明确，严重限制其应用的技术缺陷。

本发明提供了一种从地鳖中提取生物碱的提取方法，所述提取方法为：

步骤一、地鳖醇提两次后，合并两次提取液，得第一产物；

步骤二、所述第一产物第一次干燥后用稀盐酸溶解，经氯仿抽提和第二次干燥，得生物碱总碱。

优选地，步骤一中，所述醇提的方法为：浓度为95％的乙醇在70℃提取8h后，过滤，滤渣再用浓度为70％的甲醇在70℃提取8h，合并两次提取液。

优选地，所述提取方法还包括：前处理，所述前处理在步骤一前进行；

所述前处理的方法为：地鳖干燥后，研磨成粉末。

优选地，步骤二中，第一次干燥的方法为减压干燥，第二次干燥的方法为减压干燥；

步骤二中，所述稀盐酸的浓度为0.5％。

本发明还提供了一种包括以上任意一项所述的提取方法所得的生物碱的纯化方法，所述纯化方法为：

s1、生物碱溶解后调节ph至8.0，抽提后减压干燥，得第一中间产物；

s2、所述第一中间产物用硅胶柱层析，洗脱液为氯仿和甲醇混合液，进行第一次洗脱，所得洗脱液减压干燥，得第二中间产物；

s3、所述第二中间产物用硅胶柱层析，洗脱液为氯仿、甲醇和乙酸乙酯混合液，进行第二次洗脱，所得洗脱液减压干燥，得第三中间产物；

s4、所述第三产物用sephadexlh-20柱层析，洗脱液为甲醇和水混合液，进行第三次洗脱，所得洗脱液减压干燥，得第四中间产物；

s5、所述第四中间产物色谱柱层析，洗脱液为甲醇和水混合液，收集峰值最高的洗脱液，减压干燥得纯化生物碱。

优选地，s2中，以体积份计，氯仿和甲醇的体积比为9:1；

s3中，以体积份计，氯仿、甲醇、乙酸乙酯的体积比为9:1:9；

s4中，以体积份计，甲醇和水的体积比为3:5；

s5中，以体积份计，氯仿和甲醇的体积比为9:1。

本发明还提供了一种包括以上任意一项所述的提取方法得到的生物碱或以上任意一项所述的纯化方法得到的纯化生物碱在抑菌中的应用。

优选地，所述抑菌的菌种包括：革兰氏阴性大肠杆菌、革兰式阳性金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌以及酿酒酵母。

本发明还提供了一种包括以上任意一项所述的提取方法得到的生物碱或以上任意一项所述的纯化方法得到的纯化生物碱在抑制胃癌细胞生长中的应用。

优选地，所述胃癌细胞包括mkn28、mgc803、sgc7901、ags、mkn45、katoiii以及bgc823。

综上所述，本发明提供了一种从地鳖中提取生物碱的提取方法，本发明还提供了一种上述提取方法所得的生物碱的纯化方法，本发明还提供了一种上述提取方法得到的生物碱或上述纯化方法得到的纯化生物碱在抑菌中的应用，本发明还提供了一种上述提取方法得到的生物碱或上述纯化方法得到的纯化生物碱在抑制胃癌细胞生长中的应用。本发明提供的提取纯化方法，可分离得到9-(2',2'-二甲基丙酰腙)-3,6-二氯-2,7-双-[2-(二乙胺)-乙氧基]芴；经实验测定可得，所得产物在抑制胃癌及抑菌方面具有良好的效果，同时，半数致死量及最小致死量均属于中国药典推荐的安全使用范围。本发明提供的一种地鳖中生物碱的提取、纯化方法及应用，解决了现有技术中，地鳖中有效成分不明确，严重限制其应用的技术缺陷。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为实施例2中，纯化所得的gba18的化学结构式；

图2为实施例3中，gba18的¹h-nmr谱图；

图3为实施例3中，gba18的¹³c-nmr谱图；

图4是实施例6中，gba18抑制胃癌细胞bgc823相关基因表达的结果示意图。

具体实施方式

本发明提供了一种地鳖中生物碱的提取、纯化方法及应用，用于解决现有技术中，地鳖中有效成分不明确，严重限制其应用的技术缺陷。

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为了更详细说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种地鳖中生物碱的提取、纯化方法及应用，进行具体地描述。

实施例1

本实施例为地鳖中总生物碱的提取方法。

新鲜地鳖虫用蒸馏水清洗干净，45℃烘干，研磨成粉末，4℃低温保存以备后用。

取20g地鳖粉末用95％乙醇200ml(物料比1:10)，在70℃条件下，索氏提取8小时，过滤；过滤后的滤渣再用70％甲醇200ml(物料比1:10)，在70℃条件下，索氏提取8小时，过滤，合并两次提取液。

提取液减压干燥后，用0.5％稀盐酸50ml溶解，再用150ml氯仿抽提，提取液减压干燥，得到具有抑菌和抗癌活性的地鳖总生物碱组分1.124g，提取得率为5.62％。

实施例2

本实施例为地鳖总生物碱经纯化，得到9-(2',2'-二甲基丙酰腙)-3,6-二氯-2,7-双-[2-(二乙胺)-乙氧基]芴(gba18)的具体实施例。

(1)、实施例1所得地鳖总生物碱5g溶解于50ml的0.5％稀盐酸，用稀氨水调ph值到8.0；然后，用150ml氯仿抽提，提取液减压干燥得到固体提取物89mg。

(2)、取200-300目的硅胶500g，活化后与氯仿混合湿法装入层析柱(3cm*50cm)。步骤(1)所得固体提取物89mg溶解于氯仿后湿法加样，氯仿/甲醇(9:1)洗脱，洗脱液减压干燥得到固体提取物50mg。

(3)、取200-300目的硅胶500g，活化后与氯仿混合湿法装入层析柱(3cm*50cm)。步骤(2)所得固体提取物50mg溶解于氯仿后湿法加样，氯仿/甲醇/乙酸乙酯(9:1:9)洗脱，洗脱液减压干燥得到固体提取物23mg。

(4)、多次重复步骤(1)、(2)、(3)，合并提取得到的地鳖生物碱，以备后用。

(5)、步骤(4)所得固体提取物50mg用sephadexlh-20柱层析，反向溶剂甲醇/水(3:5)洗脱，洗脱液减压干燥得到固体提取物41mg。

(6)、步骤(5)所得固体提取物41mg用制备色谱层析，甲醇/水(9:1)洗脱，分部收集各流份，峰值最高洗脱部分减压干燥得到地鳖主要的具有抑菌和抗癌活性的酰腙生物碱单体(gba18)34mg。

实施例3

本实施例为gba18碳谱和氢谱分析的具体实施例。3.1¹h-nmr分析

此处请进一步参阅表1和图2。

表1

3.2¹³c-nmr分析

此处请进一步参阅表2和图3。

表2

实施例4

本实施例为gba18体外抑制胃癌细胞的具体实施例。

gba18溶解于50mm的hepes(ph7.5)配制成1mg/ml的母液，抽滤灭菌备用。利用mtt法检测gba18抑制胃癌细胞生长的活性，其中，胃癌细胞系包括：mkn28、mgc803、sgc7901、ags、mkn45、katoiii、bgc823。

利用hepes缓冲液作为阴性对照，5-fu作为阳性对照。各组分用0.22μm无菌滤膜过滤除菌后，于-20℃保存备用。

mtt法检测gba18体外抑制胃癌细胞步骤如下：

(1)rpmi-1604培养液培养各细胞株至对数生长期。

(2)对数期细胞接种于96孔板，细胞密度约10⁵个/孔，培养24h。

(3)每孔加入不同浓度(1-50μg/ml)的gba18，每组设6个平行。

(4)hepes作阴性对照，5-fu作阳性对照，继续培养24h。

(5)去掉培养液，每孔加入150μlmtt的培养液，继续培养3h。

(6)去掉孔内培养液，每孔加入150μldmso。

(7)震荡10min，使孔内甲臜结晶溶解。

(8)酶标仪检测490nm吸光值。

(9)计算细胞存活率及抑制率。

其中，细胞存活率＝实验组吸光度值/对照组吸光度值x100％，抑制率＝(对照组吸光度值-实验组吸光度值)/对照组吸光度值x100％

gba18对各种胃癌细胞体外抑制实验中的ic50请参阅表3。

表3

实施例5

本实施例为gba18与grpr亲和能力检测的具体实施例。

克隆人hgrpr受体的基因，并将其连接到pcd2质粒载体上，利用lipofectamine3000转染胃癌细胞系bgc823；转染后72小时，用800μg/ml的g418筛选阳性克隆。

利用ez-nhs-peg4-biotin标记grp获得grp^biotin；转染过的bgc823细胞培养于96孔板，去掉培养液，各孔加入200μl含100000cpm的grp^biotin和不同浓度的gba18的pbs，25℃培养60min，离心去上清。

于各反应孔中，加入新鲜稀释的hrp标记的链霉亲和素50μl。37℃孵育60min，洗涤；于各反应孔中加入临时配制的tmb底物溶液100μl，37℃暗处孵育30min，加入2m硫酸50μl终止反应；以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(od值)。

利用bw2256u89和pd176252作为阳性对照，初步结果显示，gba18能够抑制grp^biotin结合于bgc823细胞，并具有浓度依赖性，此处请进一步参阅图4，此处可证明：gba18与grpr具有较高的亲和性。

实施例6

本实施例为gba18抑制胃癌细胞bgc823相关基因表达检测的具体实施例。

目前的研究资料显示，grpr和肿瘤的多个信号通路都具有一定的关系；其中，比较多的资料显示利用grpr拮抗物抑制grpr通路后，egfr、c-fos和c-jun等基因的表达会被下调。

利用20μg/ml的gba18处理胃癌细胞系bgc823后，利用westernblot检测以上三个基因，所得结果请参阅表4。从表4中可以得出，上述三个基因在蛋白水平都有不同程度的下调。

表4

实施例7

本实施例为gba18抑菌实验的具体实施例。

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌用lb液体培养基于37℃培养过夜，无菌蒸馏水稀释菌液至10⁴-10⁵cfu/ml。酿酒酵母用pdb培养基于30℃培养过夜，无菌蒸馏水稀释菌液至10⁴-10⁵cfu/ml。10mllb固体培养基(或者pda)中加入gba18，使其终浓度为10、20、40、60、80、100、150、200、300、400、500μg/ml，凝固前倒入玻璃培养皿中，同时用氨苄青霉素作为对照组。

在制备好的固体培养基上加入20μl细菌悬液并涂抹均匀，37℃(或者30℃)培养24小时，观察细菌和酵母生长情况，没有任何菌落生成的最低样品浓度即为最低抑菌浓度mic(μg/ml)。所得结果请参阅表5。

表5

综上所述，本发明提供了一种从地鳖中提取生物碱的提取方法，本发明还提供了一种上述提取方法所得的生物碱的纯化方法，本发明还提供了一种上述提取方法得到的生物碱或上述纯化方法得到的纯化生物碱在抑菌中的应用，本发明还提供了一种上述提取方法得到的生物碱或上述纯化方法得到的纯化生物碱在抑制胃癌细胞生长中的应用。本发明提供的提取纯化方法，可分离得到9-(2',2'-二甲基丙酰腙)-3,6-二氯-2,7-双-[2-(二乙胺)-乙氧基]芴；经实验测定可得，所得产物在抑制胃癌及抑菌方面具有良好的效果，同时，半数致死量及最小致死量均属于中国药典推荐的安全使用范围。本发明提供的一种地鳖中生物碱的提取、纯化方法及应用，解决了现有技术中，地鳖中有效成分不明确，严重限制其应用的技术缺陷。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。