P53转录抑制剂PFTαHBr在制备抗端粒酶阴性p53阳性肿瘤药物中的应用的制作方法

本发明属于医药领域，具体涉及p53转录抑制剂pifithrin-α(pftα)hbr在制备抗端粒酶阴性p53阳性肿瘤药物中的应用。

背景技术

端粒是真核细胞线性染色体末端的dna重复序列与端粒特异性结合蛋白组成的复合物，起到保护染色体末端、维持基因组稳定性的作用。在人类正常的体细胞中，端粒dna会随着细胞分裂而不断缩短。当端粒缩短到一定长度，端粒会失去保护染色体的功能，被细胞识别成dna损伤，从而激活dna损伤应答反应，细胞进而失去分裂的能力走向衰老或是凋亡；而对于不断增殖的肿瘤细胞而言，端粒长度的维持为其不断分裂以及生存提供了重要的保障。

对于所有的肿瘤而言，包括卵巢癌、乳腺癌和肺癌等，同一种肿瘤包括端粒酶阳性的，也包括端粒酶阴性的，其中大约80％的肿瘤属于端粒酶阳性的，即其细胞中具有端粒酶，通过表达端粒酶(telomerase)维持端粒长度；而另外的大约20％的肿瘤是端粒酶阴性的，即肿瘤细胞中检测不到端粒酶活性，通过被称为alt(alternativelengtheningoftelomeres)的旁路途径机制延伸端粒，从而维持端粒长度，被称为alt肿瘤，这些肿瘤细胞不表达端粒酶(即端粒酶阴性肿瘤细胞)。对于原发肿瘤，要么是端粒酶阳性的，要么是端粒酶阴性的(alt)。

现今，端粒酶抑制剂作为抗肿瘤药物已经进入临床阶段，而且显示出了很好的治疗效果。然而，alt肿瘤细胞由于恶性程度高、抗药性强，现今的许多抗肿瘤药物对其治疗效果并不理想；而且端粒酶抑制剂的使用会促进端粒酶阳性的肿瘤细胞通过激活alt机制进而对端粒酶抑制剂产生抗性，表现出更高的恶性程度。

因此，特异性针对端粒酶阴性肿瘤细胞药物的研发迫在眉睫，也具有着重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种能够有效抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡的途径。

为此，本发明提供了以下式(i)的p53转录抑制剂pifithrin-α(pftα)hbr在制备抗端粒酶阴性p53阳性肿瘤药物中的应用：

以上式(i)化合物p53转录抑制剂pifithrin-α(pftα)hbr为已知的p53抑制剂，化学式为c16h18n2os·hbr，能够抑制p53依赖性的应答基因转录。

根据本发明所述的应用，所述端粒酶阴性且p53阳性肿瘤为骨肉瘤。

根据本发明所述的应用，所述药物含有药学上可接受的载体或赋形剂。

实验证明，式(i)的p53转录抑制剂pifithrin-α(pftα)hbr对于多种端粒酶阴性p53阳性肿瘤细胞，包括但不限于例如人骨肉瘤等，均有显著促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖的效用。

附图说明

图1为cck8检测细胞活力实验的结果。

图2为流式细胞法检测细胞凋亡的结果。

图3为细胞增殖曲线。

图4为体外成瘤实验的结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的应用范围。

本实施例中，以人骨肉瘤为例说明式(i)化合物(p53转录抑制剂pifithrin-α(pftα)hbr)在抑制端粒酶阴性p53阳性肿瘤细胞增殖、促进端粒酶阴性p53阳性肿瘤细胞凋亡方面的效用，但应理解的是，虽然仅以人骨肉瘤为例说明其用于制备抗端粒酶阴性肿瘤的药物的用途，但本发明所称的“端粒酶阴性p53阳性肿瘤”细胞指缺乏(或检查不到)端粒酶活性、不表达端粒酶的肿瘤细胞，同时表达野生型p53蛋白，包括但不限于例如人骨肉瘤细胞、胶质瘤细胞等。实验证明，式(i)化合物(p53转录抑制剂pifithrin-α(pftα)hbr)对于多种端粒酶阴性p53阳性肿瘤细胞，包括但不限于例如人骨肉瘤等，均有显著促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖的效果。

实验材料

人皮肤成纤维(bj，正常细胞)细胞株、肺纤维母(mrc-5，正常细胞)细胞株、人非小细胞肺癌(a549、端粒酶阳性p53阳性)细胞株、人乳腺癌(mcf7、端粒酶阳性p53阳性)细胞株、sv-40z转化肺成纤维(va13、端粒酶阴性p53阳性)细胞株、人骨肉瘤(u2os、端粒酶阴性p53阳性)细胞株购自中国典型物种保藏中心(ctcc)。

cck8检测细胞活力实验：

将bj、mrc-5、a549、mcf7、va13和u2os以5×10³/孔分别接种于96孔板细胞培养板中，待细胞贴壁后，加入150μl含有相应浓度式(i)化合物(p53转录抑制剂pifithrin-α(pftα)hbr)(0、2.5μm、5μm、20μm、40μm)的培养基，每个药物浓度分别设置3个复孔；72h后，利用cellcountingkit-8(cck-8)试剂盒对细胞活性进行检测，具体的操作过程按照试剂盒上提供的方法进行操作。

cellcountingkit-8(cck-8)检测试剂盒主要成分为水溶性四唑盐wst-8(2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2h-四唑单钠盐)，wst-8是一种类似于mtt的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的水溶性的甲臜。wst-8被细胞内脱氢酶生物还原后生成的甲臜能够直接溶解在培养基中。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。

加药处理第三天，6个细胞株加药后细胞活力结果如图1所示。实验结果表明，端粒酶阴性p53阳性细胞(va13、u2os)对于式(i)化合物(p53转录抑制剂pifithrin-α(pftα)hbr)的敏感性明显强于正常细胞株(bj、mrc5)以及端粒酶阳性p53阳性细胞株(a549、mcf7)。在低浓度式(i)化合物(p53转录抑制剂pifithrin-α(pftα)hbr)的处理下，端粒酶阴性细胞株p53阳性(va13、u2os)生长明显受到抑制。

流式细胞法检测细胞凋亡：

bj、mrc-5、a549、mcf7、va13和u2os以0.1×10⁶/孔分别接种于6孔板细胞培养板中，待细胞贴壁后，加入2ml含有相应浓度式(i)化合物(p53转录抑制剂pifithrin-α(pftα)hbr)(0、20μm、40μm)的培养基，每个药物浓度分别设置3个复孔；72h后，利用0.25％胰蛋白酶(不含edta)进行消化收集，离心，并用1×pbs润洗2遍，弃去上清液，保留沉淀(细胞)；收集好的细胞用fluor488annexinvandpi进行双染，具体的染色操作过程按照alexa488annexinv/deadcellapoptosiskit试剂盒上提供的方法进行操作；染色好后的细胞悬浮液直接用流式细胞仪进行测试，实验数据由flowjo软件进行处理拟合。

在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(ps)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(ps)由脂膜内侧翻向外侧。annexinv为胞内蛋白膜联蛋白家族成员，以钙依赖的方式与磷脂酰丝氨酸(ps)结合，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合来确定细胞是否处于细胞凋亡早期。碘化丙啶(propidiumiodide,pi)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对于凋亡中晚期的细胞和死细胞，pi能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将细胞利用annexinv与pi双染色，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，右下象限为早期凋亡细胞，左上象限是坏死细胞，右上象限是中晚期凋亡细胞。统计凋亡细胞数量时指右下及右上象限的细胞数量。

加药处理第三天，6个细胞株细胞凋亡实验结果如图2所示。实验结果表明，式(i)化合物(p53转录抑制剂pifithrin-α(pftα)hbr)可以明显促进端粒酶阴性p53阳性细胞株(va13、u2os)细胞凋亡水平，而且呈现出浓度依赖的趋势，但并不能引起正常细胞株(bj、mrc5)以及端粒酶阳性p53阳性细胞株(a549、mcf7)的细胞凋亡。

细胞增殖曲线：

u2os细胞以0.1×10⁶/孔分别接种于6孔板细胞培养板中，待细胞贴壁后，加入2ml含有相应浓度式(i)化合物(p53转录抑制剂pifithrin-α(pftα)hbr)的培养基(0、20μm、40μm)；该操作每隔2天重复一次。增殖过程中，每次传代时均使用细胞计数仪对每孔细胞进行计数，然后再从中取部分细胞重新接种，接种密度仍为0.1×10⁶/孔，直到培养板中细胞总数<0.1×10⁶个无法接种为止。

不同浓度的式(i)化合物(p53转录抑制剂pifithrin-α(pftα)hbr)处理端粒酶阴性p53阳性株(u2os)的增殖曲线如图3所示。实验结果表明式i化合物(p53转录抑制剂pifithrin-α(pftα)hbr)可以明显抑制端粒酶阴性p53阳性株(u2os)的增殖。

体外成瘤实验：

利用pbs将u2os细胞制成细胞悬液，按3×10⁶/只的接种量单位点接种于8只4周龄的balb/c裸鼠腋窝中部外侧皮下，并随机分组(对照以及加药组)。待u2os成瘤后(40天后)，将式(i)化合物(p53转录抑制剂pifithrin-α(pftα)hbr)以2.2mg/kg的给药量以腹腔注射的方式注射进入加药组裸鼠体内，对照组为注射相同体积的pbs；该操作一周两次，并称量裸鼠体重以及量取肿瘤大小。四周后，麻醉后颈椎脱臼处死小鼠，剥取肿瘤。

式(i)化合物(p53转录抑制剂pifithrin-α(pftα)hbr)抑制u2os体外成瘤实验结果如图4所示。实验结果表明式(i)化合物(p53转录抑制剂pifithrin-α(pftα)hbr)可以显著抑制u2os的体外成瘤，但是对裸鼠体重没有影响。

以上实验结果综合表明，式(i)化合物(p53转录抑制剂pifithrin-α(pftα)hbr)能够有效促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖，可用于制备有效抗端粒酶阴性p53阳性肿瘤的药物。