一种壳聚糖包裹玉米醇溶蛋白纳米粒的制备及负载金合欢素钠盐的应用的制作方法

本发明涉及生物医药纳米缓释技术领域，具体涉及一种壳聚糖包裹玉米醇溶蛋白纳米粒的制备方法及负载金合欢素钠盐的应用。

背景技术：

玉米醇溶蛋白是玉米中主要的储藏蛋白质，占胚乳总蛋白质的35～60％，平均分子量约40kd。由于玉米醇溶蛋白中含有大量的疏水性氨基酸，如谷氨酰胺和脯氨酸；缺乏能带电的酸性、碱性氨基酸，尤其缺乏色氨酸和赖氨酸；含有较多的含硫氨基酸，由于其氨基酸组成不均衡，营养价值并不高。近年来研究发现，玉米醇溶蛋白分子结构中亲水部分和疏水部分分区明显，具有独特的自组装特性、成膜性、凝胶性，具有抗水、抗油性以及良好的生物相容性、生物粘附性。基于玉米蛋白的双亲性，可以通过经典相分离法方便得到玉米蛋白包封疏水性药物的纳米粒，但是由于分子尺度精细操控的难度较大，导致方法的重现性较差、过程不易控制，纳米粒粒径分布较宽、单纯的玉米醇溶蛋白纳米粒子稳定性较差，易于发生聚集而沉淀。

壳聚糖是天然来源的、可再生的天然聚合物之一，由甲壳素经过脱乙酰作用得到，具有优异的物理、化学性能，生物相容性好，生物可降解，在细胞培养、药物可控释放、蛋白质分离等诸多领域应用广泛。壳聚糖的分子量对其溶解度及理化性质具有显著的影响。作为天然来源的唯一的碱性多糖，可以溶解在酸性的溶液中而带有正电，从而与带负电的粒子通过静电相互作用而发生相互结合起到增加纳米粒稳定性、减少药物突释，改善靶细胞对纳米粒的内吞、摄取等作用。

金合欢素是一种首先在天山雪莲中发现的黄酮类化合物，据报道具有广泛的药理活性，如抗炎、抗肿瘤、抗氧化等。最近一系列研究发现金合欢素可以通过多离子通道阻断作用用于房颤的治疗，是一种极具潜力的抗心律失常候选化合物，但是由于其水溶性很差，限制了其的临床应用。通过磷酸酯连接制备的钠盐水溶性可以提高数千倍，并且可以在体内磷酸酯酶的作用下发生水解生成金合欢素，发挥金合欢素本身的治疗效果，可作为前药使用。但是金合欢素钠盐的化学稳定性欠佳，对高湿、高温均比较敏感，将其包裹在纳米粒中，可提高其稳定性。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一种壳聚糖包裹玉米醇溶蛋白纳米粒的制备方法，该方法首先利用相对可控的相分离法制备玉米醇溶蛋白纳米粒，其次利用壳聚糖在酸性溶液中所带正电荷，与玉米醇溶蛋白纳米粒通过静电相互作用结合，制备壳聚糖包覆玉米醇溶蛋白纳米粒，从而增加玉米蛋白纳米粒的稳定性，提高制备的重现性。

本发明的第二个目的是提供该药物递送系统的应用。

为实现本发明的第一个目的，其技术方案是包括以下步骤：

(1)将玉米醇溶蛋白溶解到乙醇溶液中，加入到喷瓶中；

(2)另将去离子水或加入适量稳定剂的水相加入到另一喷瓶中；将步骤(1)和步骤(2)中所述的两个喷瓶在封闭式装置中对喷即得含玉米醇溶蛋白纳米粒的混合溶液。将所得溶液旋转蒸发30min，去除乙醇。

(3)将步骤(3)中所述的玉米醇溶蛋白纳米粒溶液加入壳聚糖溶液中，经搅拌孵育后，通过2000rpm离心10min取上清液，再通过12000rpm离心30min，收集沉淀物，即得到壳聚糖包裹玉米醇溶蛋白纳米粒。

(4)应用于负载金合欢素钠盐时，将金合欢素钠盐溶解于步骤(4)的去离子水或加入适量稳定剂的水相中。

步骤(1)中所述玉米醇溶蛋白的浓度为5～20mg/ml。

步骤(1)中所述的乙醇浓度是70～80％。

步骤(1)中所述的溶液与水相以1:1～1:3的速率比进入封闭式装置中。

步骤(2)中所述稳定剂与水的质量体积比是1～10％。

步骤(3)中两个喷瓶在封闭式装置中对喷，得到乳白色玉米醇溶蛋白纳米粒溶液。

步骤(4)中所述的壳聚糖和玉米醇溶蛋白的质量比是1～2:1。

步骤(4)中所述的壳聚糖溶液的溶剂是1～10％的醋酸溶液。

步骤(4)中所述的搅拌速度是200～600rpm。

步骤(4)中所述的孵育时间是10～30min。

步骤(5)中所述的金合欢素钠盐的浓度是1～4mg/ml。

上述方法得到的壳聚糖包裹玉米醇溶蛋白纳米粒粒径为190～250nm(pdi＝0.10～0.20)，zeta电位约为50mv；用于装载金合欢素钠盐时的载药量为20～30％，粒径约190～260nm、zeta电位约35～45mv。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：

(1)可以连续制备壳聚糖包覆玉米蛋白纳米粒，稳定性优于玉米蛋白纳米粒。

(2)玉米蛋白纳米粒产率高于普通相分离法和搅拌蒸发等方法，制备条件温和，纳米粒产率较高，粒径分布均匀，在水中分散性高，对药物包封率高。

(3)通过控制玉米蛋白溶液浓度、水相浓度、两相的喷射速度、壳聚糖浓度、壳聚糖分子量等参数，有效控制最终产物的粒度大小。

附图说明

图1玉米醇溶蛋白纳米粒的粒径分布和电位图；

图25％的peg400稳定的玉米醇溶蛋白纳米粒的粒径分布图；

图35％的f68稳定的玉米醇溶蛋白纳米粒的粒径分布图；

图4壳聚糖(mw5,000)包覆玉米醇溶蛋白纳米粒的粒径分布和电位图；

图5壳聚糖(mw200,000)包覆玉米醇溶蛋白纳米粒的粒径分布和电位图；

图6负载金合欢素的壳聚糖包覆玉米醇溶蛋白纳米粒的粒径分布和电位图；

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的较佳实施例进行详细阐述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。以下实施例的各原料均为常规市售产品。

实施例1

(1)精密称取100.1mg玉米醇溶蛋白溶于10ml的80％乙醇中，超声5min使其完全溶解，置于50ml的喷瓶中；

(2)量取10ml去离子水，置于另一50ml的喷瓶中；

(3)在室温下，将两个喷瓶在封闭式装置中对喷，得到乳白色的溶液。将所得溶液在50℃下旋转蒸发30min，除去乙醇；

(4)通过2000rpm离心10min取上清液作为样品，用nano-zs90马尔文粒径和电位仪测定产物的粒径和电位，平均粒径约为180.5nm(多分散指数＝0.209)，电位为-11.9mv，纳米粒的粒径及电位分布图见附图1。

实施例2

(1)精密称取100.3mg玉米醇溶蛋白溶于10ml的80％乙醇中，超声5min使其完全溶解，置于50ml的喷瓶中；

(2)精密称取5.2mgpeg400溶于10ml去离子水中，超声5min使其完全溶解，置于另一50ml的喷瓶中；

(3)在室温下，将两个喷瓶在封闭式装置中对喷，得到乳白色的溶液。将所得溶液在50℃下旋转蒸发30min，除去乙醇；

(4)通过2000rpm离心10min取上清液作为样品，用nano-zs90马尔文粒径和电位仪测定产物的粒径。5％的peg400稳定的玉米醇溶蛋白纳米粒的平均粒径约为159.3nm(多分散指数＝0.186)，粒径分布图见图2。

实施例3

(1)精密称取100.3mg玉米醇溶蛋白溶于10ml的80％乙醇中，超声5min使其完全溶解，置于50ml的喷瓶中；

(2)精密称取5.3mgf68溶于10ml去离子水中，超声5min使其完全溶解，置于另一50ml的喷瓶中；

(3)在室温下，将两个喷瓶在封闭式装置中对喷，得到乳白色的溶液。将所得溶液在50℃下旋转蒸发30min，除去乙醇；

(4)通过2000rpm离心10min取上清液作为样品，用nano-zs90马尔文粒径和电位仪测定产物的粒径，5％的f68稳定的玉米醇溶蛋白纳米粒的粒径约为246.7nm(多分散指数＝0.224)，粒径分布图见图3。

实施例4

(1)精密称取100.2mg玉米醇溶蛋白溶于10ml的80％乙醇中，超声5min使其完全溶解，置于50ml的喷瓶中；

(2)量取10ml去离子水，置于另一50ml的喷瓶中；

(3)在室温下，将两个喷瓶在封闭式装置中对喷，得到乳白色的溶液。将所得溶液在50℃下旋转蒸发30min，除去乙醇；

(4)精密称取6.8mg的壳寡糖(mw5,000)，加入10ml1％的醋酸溶液中。以600rpm的速度搅拌，取步骤3中的溶液1ml缓慢滴入，搅拌30min；

(5)通过2000rpm离心10min取上清液作为样品，用nano-zs90马尔文粒径和电位仪测定产物的粒径和电位，平均粒径约为166nm(多分散指数＝0.187)，电位为52.5mv，粒径及电位分布图见图4。

实施例5

(1)精密称取100.4mg玉米醇溶蛋白溶于10ml的80％乙醇中，超声5min使其完全溶解，置于50ml的喷瓶中；

(2)量取10ml去离子水，置于另一50ml的喷瓶中；

(3)在室温下，将两个喷瓶在封闭式装置中对喷，得到乳白色的溶液。将所得溶液在50℃下旋转蒸发30min，除去乙醇；

(4)精密称取6.9mg的壳聚糖(mw20,000)加入10ml的1％的醋酸溶液中。以600rpm的速度搅拌，取1ml步骤3中的溶液缓慢滴入，搅拌30min；

(5)通过2000rpm离心10min弃去下层沉淀，用nano-zs90马尔文粒径和电位仪测定产物的粒径和电位，平均粒径约为221.5nm(多分散指数＝0.317),电位为54.7mv，粒径及电位分布图见图5。

实施例6

(1)精密称取100mg玉米醇溶蛋白溶于10ml的80％乙醇中，超声5min使其完全溶解，置于50ml的喷瓶中；

(2)精密称取20mg金合欢素钠盐溶于10ml去离子水中，超声5min使其完全溶解，置于另一50ml的喷瓶中；

(3)在室温下，将两个喷瓶在封闭式装置中对喷，得到乳白色的溶液。将所得溶液在50℃下旋转蒸发30min，除去乙醇；

(4)通过2000rpm离心10min取上清液作为样品，取样用nano-zs90马尔文粒径和电位仪测定纳米粒的粒径和电位，平均粒径约为200.6nm,电位为-19.6mv；

(5)将13.8mg的壳寡糖(mw5,000)，加入20ml的1％的醋酸溶液中。以600rpm的速度搅拌，取2ml步骤4中的样品溶液缓慢滴入，搅拌30min；

(6)通过2000rpm离心10min取上清液作为样品，用nano-zs90马尔文粒径和电位仪测定纳米粒的粒径和电位，平均粒径约为245.7nm(多分散指数＝0.374)，电位为38.9mv，通过计算公式：载药量＝(总的药量-游离的药量)/载药纳米粒的总重，得载药量为29.2％，粒径及电位分布图见图6。