牛樟芝萃取物、牛樟芝组合物的制备方法及医药组合物与流程

本发明涉及食药用菌应用技术领域，特别涉及一种用于治疗癌症及减轻化疗副作用的牛樟芝萃取物、牛樟芝组合物的制备方法及医药组合物。

背景技术：

牛樟芝(antrodiacinnamomea)属于非折菌目、多孔菌料、薄孔菌属、樟芝种，乃多年生蕈菌类，为台湾特有种菇菌类，目前研究结果显示牛樟芝具有抗肿瘤、增强免疫力、抗病毒、抗发炎、抗氧化效果和保肝效果等多种功能。其中抗肿瘤相关研究与专利多集中于直接使用椴木栽培的牛樟芝子实体或菌丝体粉体或不同溶剂之抽取物或单一化合物于癌细胞上。

由于野生牛樟芝数量稀少取得不易，并且有遭受生长环境污染的问题，因此近年来多以人工栽培方法来培养牛樟芝，目前主要生产牛樟芝培育方法系有液态培养法、固态培养法及椴木培养法。牛樟芝的型态和成分会因培育方法不同而有很大的差异，依据文献报导以液态酦酵与固态酦酵所培养而得的为牛樟芝菌丝体，以椴木培养法培养而得的为牛樟芝子实体。牛樟芝菌丝体的成分以多醣体为主，而牛樟芝子实体的成分以三萜类为主，由于牛樟椴木取得不易而造成以椴木培养的牛樟芝子实体售价非常昂贵。

癌症是全世界盛行率与致死率很高的疾病，癌症治疗的方法包括手术、化学治疗、放射治疗、标靶治疗以及这些治疗方法的结合。化学治疗虽然可以成功杀死癌细胞，但却会没有选择性地一并杀死正常细胞，通常会对病人有严重的副作用；化疗药物造成病人的白血球数目低下是常见的副作用之一，癌症病人在接受化学治疗期间常因白血球数目太低以致影响治疗。因此，从传统中草药中寻找具有抗癌活性的中草药萃取物，来取代西药或与西药合并治疗癌症为值得研究的新方向。

技术实现要素：

为了解决癌症治疗及其治疗过程中化学治疗对病人引起的副作用的问题，本发明提供了一种牛樟芝萃取物的制备方法，包括如下步骤：使用乙醇溶液萃取皿培式牛樟芝子实体粉末，过滤液减压浓缩后得到粗萃取物；将所述粗萃取物用大孔树脂吸附后置于长方形容器中，依次先用混合溶液洗脱，将洗脱液减压浓缩、干燥，得到牛樟芝萃取物的第一分萃物后，再用乙醇溶液洗脱，将洗脱液减压浓缩、干燥，得到牛樟芝萃取物的第二分萃物后，再用乙酸乙酯溶液洗脱，将洗脱液减压浓缩、干燥，得到牛樟芝萃取物的第三分萃物。

所述混合溶液由二次水和乙醇溶液组成；其中所述二次水和乙醇溶液的体积比为(40～60):(40～60)。

所述乙醇溶液的体积分数为95％。

本发明提供了一种牛樟芝组合物的制备方法，包括如下步骤：使用二次水萃取牛樟芝菌丝体粉末，过滤液经减压浓缩后得到浓缩液；将所述浓缩液加入乙醇溶液，过滤后取沉淀物；烘干所述沉淀物，得到牛樟芝菌丝体萃取物；将所述牛樟芝菌丝体萃取物与如上述方法制得的牛樟芝萃取物的第二分萃物组合，得到牛樟芝组合物。

所述牛樟芝菌丝体萃取物和所述牛樟芝萃取物的第二分萃物的重量比为(35～65):(35～65)。

所述浓缩液与乙醇溶液的体积比为1：3；所述乙醇溶液的体积分数为60％～80％。

本发明提供了一种医药组合物，所述组合物包括治疗有效剂量的如上述方法制得的粗萃取物及视情况医药学上可接受的载剂，用于制备预防或治疗大肠癌、肝癌及皮肤癌的医药品；所述医药品对大肠癌、肝癌及皮肤癌细胞具有毒杀效果。

本发明提供了一种医药组合物，所述组合物包括治疗有效剂量的如上述方法制得的牛樟芝萃取物的第二分萃物或第三分萃物及视情况医药学上可接受的载剂，用于制备预防或治疗大肠癌、肝癌、胃癌、肺癌、乳癌及皮肤癌的医药品；所述医药品对大肠癌、肝癌、胃癌、肺癌、乳癌及皮肤癌细胞具有毒杀效果。

本发明还提供了一种医药组合物，所述组合物包括治疗有效剂量的如上述方法制得的牛樟芝组合物及视情况医药学上可接受的载剂，用于制备改善化疗药物顺铂及含铂系列药物造成副作用的药品；所述药品可改善化疗药物顺铂系列药物造成的白血球数目低下和骨髓抑制现象。

利用本发明提供的方法制得的牛樟芝萃取物的分萃物或牛樟芝组合物，可用于治疗癌症及减轻化疗副作用，包括治疗肝癌、肺癌、大肠癌、胃癌、乳癌和皮肤癌等，以及对改善化疗药物造成的白血球数目低下和骨髓抑制具有显著的疗效。

附图说明

图1是本发明实施例提供的牛樟芝萃取物制备方法流程图；

图2是本发明实施例提供的牛樟芝菌丝体萃取物制备方法流程图；

图3是本发明实施例牛樟芝萃取物的分萃物(f2)对人类肠癌细胞hct116动物模式抑制肿瘤功效测试；

图4是本发明实施例牛樟芝萃取物的分萃物(f2)对人类肠癌细胞hct116动物模式体重的影响；

图5是本发明实施例牛樟芝组合物对化疗药物cisplatin于c57bl/6免疫正常小鼠造成的白血球数目低下影响；

图6是本发明实施例牛樟芝组合物对化疗药物cisplatin于c57bl/6免疫正常小鼠白血球前驱细胞的影响；

图7是本发明实施例牛樟芝组合物对化疗药物cisplatin于c57bl/6免疫正常小鼠红血球前驱细胞的影响。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明技术方案作进一步描述。

参见图1，本发明实施例提供的牛樟芝萃取物是以皿培式牛樟芝子实体经由乙醇溶液萃取物后，以大孔树酯吸附后置于长方形容器中进行部分纯化后得到分萃物，其制备方法包括如下步骤：

步骤s101：取1公斤皿培式牛樟芝子实体粉末，以10倍体积的体积分数为95％的乙醇溶液浸泡搅拌72小时后，过滤；

步骤s102：将经过步骤s101萃取后得到的滤渣，再以10倍体积的体积分数为95％的乙醇溶液浸泡搅拌72小时后，过滤；

步骤s103：将步骤s101所得的滤液和步骤s102所得的滤液混合，并使用减压旋转浓缩机浓缩至原体积的5％，得到粗萃取物(crude)；

步骤s104：将步骤s103得到的粗萃取物用混合溶液稀释10倍后，倒入装有约粗萃取物重量5倍的大孔树酯(例如，hp20)的长方形容器中并充分搅拌，使大孔树脂吸附粗萃取物(吸附时间为10～12小时)；将长方形容器中的液体倒出，再将约3～6倍于1公斤皿培式牛樟芝子实体粉末体积的混合溶液加入长方形容器中，浸泡1～5小时后，再次将长方形容器中的溶液倒出；收集两次长方形容器倒出的液体，并使用减压旋转浓缩机浓缩干燥后秤重量，得到牛樟芝萃取物的分萃物f1；

其中，混合溶液由二次水和体积分数为95％的乙醇溶液组成，其中二次水与体积分数为95％的乙醇溶液的体积比为(40～60):(40～60)；

步骤s105：将长方形容器中的大孔树脂再用约3～6倍于1公斤皿培式牛樟芝子实体粉末体积的体积分数为95％的乙醇溶液，浸泡1～5小时，共两次收集此液体后，并使用减压旋转浓缩机浓缩干燥后秤重量，得到牛樟芝萃取物的分萃物f2；

步骤s106：将长方形容器中的大孔树脂再用约3～6倍于约1公斤皿培式牛樟芝子实体粉末体积的乙酸乙酯溶液，浸泡1～5小时，共两次收集此液体后，并使用减压旋转浓缩机浓缩干燥后秤重量，得到牛樟芝萃取物的分萃物f3。

参见图2，本发明实施例提供的牛樟芝菌丝体萃取物是使用二次水萃取牛樟芝菌丝体粉末，将过滤浓缩后的浓缩液加入乙醇溶液，并对过滤后的沉淀物进行烘干，得到牛樟芝菌丝体萃取物，其制备方法包括如下步骤：

步骤s201：取1公斤牛樟芝菌丝体粉末，以10倍体积的二次水煮沸8小时后，过滤；

步骤s202：将经过步骤s201萃取后得到的滤渣，再以10倍体积的二次水煮沸4小时后，过滤；

步骤s203:将步骤s201所得的滤液和步骤s202所得的滤液混合，并使用减压旋转浓缩机浓缩至原体积的5％；

步骤s204：将步骤s203所得的浓缩液，加入3倍体积的体积分数为60％～80％的乙醇溶液，过滤后取沉淀物，烘干沉淀物后得到牛樟芝菌丝体萃取物。

本发明实施例将牛樟芝菌丝体萃取物和牛樟芝萃取物的分萃物f2按照体积比(35～65):(35～65)组合后，得到本发明实施例提供的牛樟芝组合物。

为了进一步阐述本发明实施例提供的牛樟芝组合物的制备过程，下面给出具体的应用实例。

实施例1：牛樟芝萃取物制备

取1公斤皿培式牛樟芝子实体粉末，用10倍体积的体积分数为95％的乙醇溶液浸泡搅拌72小时后，抽气过滤，收集第1次滤液。过滤后的滤渣再次用10倍体积的体积分数为95％的乙醇溶液浸泡搅拌72小时，抽气过滤，收集第2次滤液。二次滤液合并经减压浓缩后得到牛樟芝乙醇粗萃取物。将粗萃取物用二次水与体积分数为95％的乙醇溶液(二次水与体积分数为95％的乙醇溶液的体积比为40:60)稀释10倍后，倒入装有约粗萃取物重量5倍的大孔树酯(例如，hp20)的长方形容器中，充分搅拌并使其吸附(吸附时间为10～12小时)。将长方形容器中的液体倒出，再用约3～6倍1公斤皿培式牛樟芝子实体粉末体积的混合溶液(混合溶液由二次水与体积分数为95％的乙醇溶液组成，二次水与体积分数为95％的乙醇溶液的体积比为40:60)加入长方形容器中，浸泡1～5小时后，再将长方形容器中的溶液倒出，收集二次滤液，浓缩干燥后秤重量，获得牛樟芝萃取物的分萃物fl。将长方形容器中的大孔树脂再用约3～6倍于1公斤皿培式牛樟芝子实体粉末体积的体积分数为95％的乙醇溶液，浸泡1～5小时，共两次收集此液体后，浓缩干燥后秤重量，获得牛樟芝萃取物的分萃物f2。将长方形容器中的大孔树脂再用约3～6倍于1公斤皿培式牛樟芝子实体粉末体积的乙酸乙酯溶液，浸泡1～5小时，共两次收集此液体后，浓缩干燥后秤重量，获得牛樟芝萃取物的分萃物f3。

需要说明的是：在实际应用中，混合溶液中二次水与体积分数为95％的乙醇溶液的体积比还可为45:55、50:50、55:45或60:40等。对于混合溶液中不同体积比的二次水与体积分数为95％的乙醇溶液，本实施例不再分别赘述。

实施例2：牛樟芝菌丝体萃取物制备

取1公斤牛樟芝菌丝体粉末，用10倍体积的二次水煮沸8小时后，过滤。将过滤后的滤渣，再以10倍体积的二次水煮沸4小时后，过滤。将二次所得的滤液混合，以减压旋转浓缩机浓缩至原体积的5％。将所得的浓缩液加入3倍体积的体积分数为70％的乙醇溶液，过滤后取沉淀物，烘干沉淀物后得到牛樟芝菌丝体萃取物。

需要说明的是：在实际应用中，浓缩液加入3倍体积的乙醇溶液的体积分数还可为60％、65％、75％或80％等。对于浓缩液加入不同体积分数的乙醇溶液，本实施例不再分别赘述。

实施例3：牛樟芝组合物制备

将实施例2所得的牛樟芝菌丝体萃取物和实施例1所得的牛樟芝萃取物的分萃物f2按照体积比35:65组合后，得到牛樟芝组合物(ac)。

需要说明的是：在实际应用中，牛樟芝组合物中牛樟芝菌丝体萃取物和牛樟芝萃取物的分萃物f2的体积比还可为40:60、45:55、50:50、55:45、60：40或65:35等。对于不同体积比的牛樟芝菌丝体萃取物和牛樟芝萃取物的分萃物f2，本实施例不再分别赘述。

利用本发明实施例提供的方法制得的牛樟芝萃取物的分萃物或牛樟芝组合物，对治疗癌症及减轻化疗副作用，包括治疗肝癌、肺癌、大肠癌、胃癌、乳癌和皮肤癌等，以及对改善化疗药物造成的白血球数目低下和骨髓抑制具有显著的疗效。下面通过一些试验结果来加以说明。

1、牛樟芝萃取物对不同癌细胞的细胞毒性试验

1)细胞培养

选用hct116人类大肠癌细胞、huh7人类肝癌细胞、mkn45人类胃癌细胞、a549人类肺癌细胞、mda-mb-231人类乳癌细胞及a375人类皮肤癌细胞，hct116、huh7、a549、mda-mb-231及a375细胞使用含10％fbs的dmem培养液，mkn45细胞使用含10％fbs的rpmi培养液，在37℃含5％co2的湿润培养箱中培养。在t75flask接种1.2×10⁶个细胞，视细胞生长速度，约三至七天可长满培养盘，继代时移除培养液，用pbs清洗细胞，加入trypsin-edta使细胞剥离，以新培养液中和后进行细胞计数，依实验所需种入适当细胞数于培养盘，并留下1.2×10⁶个细胞种入新的t75flask继续培养。

2)测试药物配置

以100％dmso将测试物质包括牛樟芝萃取物标示为crude、f1、f2和f3等样品，配置成浓度50mg/ml。以dmem或rpmi培养液将测试药物稀释成下列八个浓度：2000、1500、1000、500、250、50、25及12.5μg/ml，以上浓度为最终浓度的十倍。

3)细胞存活率分析(mtsassay)

在96孔盘中每孔植入6×10³个细胞，37℃培养4小时后加入测试药物，每个浓度重复实验三次。在37℃下培养48小时后，移除旧培养液，加入含mts的培养液，在37℃下反应1小时，以elisareader读取波长490nm吸光值，并用graphpadprism5软件计算ic50数值，结果如下表1所示。

表1

表1结果显示牛樟芝萃取物的粗萃取物(crude)对a549(肺癌)、mkn-45(胃癌)和mda-mb231(乳癌)不具毒杀药效，对huh7(肝癌)、hct116(肠癌)和a375(皮肤癌)具有微弱毒杀药效。牛樟芝萃取物的分萃物(f1)对试验的6种癌细胞不具毒杀药效。牛樟芝萃取物的分萃物(f2)对试验的6种癌细胞皆具强毒杀药效，尤其对a375(皮肤癌)、huh7(肝癌)和mkn-45(胃癌)毒杀药效更强。牛樟芝萃取物的分萃物(f3)对试验的6种癌细胞中的mda-mb231(乳癌)不具毒杀药效，对huh7(肝癌)具强毒杀药效，对其他四种癌细胞皆具弱毒杀药效。

2、牛樟芝萃取物对人类肠癌细胞hct116的动物模式功效试验

1)实验动物的饲养

本次研究使用动物为balb/cnu/nu裸鼠，购自台湾实验动物中心，六周龄。控制饲养温度为25±2℃，光照时间为08:00～20:00，每日提供充足饲料及饮水，每周更换垫料两次。

2)肿瘤诱发的动物模式

将人类肠癌细胞株(hct116)以3×10⁶的细胞量悬浮于80lpbs，采用注射方式植入裸鼠背部右侧的皮下部位，诱发肿瘤生成，至肿瘤尺寸达100-200mm³为基准，开始投药。

3)试验物质及投予途径

第1至15天以管喂方式投予分萃物f2。动物组别分别为控制组、100、200及400mg/kgf2，每组6只小鼠，4组共24只。

4)抑制肿瘤生长的评估

以co2方式牺牲小鼠，肿瘤部位经手术取下后秤重，比较投予药物后肿瘤型态及重量变化。如未至牺牲日已有实验动物死亡，则记录死亡时间，以作为投予药物后寿命延长的比较依据。

5)统计分析方法

以单因子变异数分析(one-wayanova)进行数据分析，当分析结果达到显著时，以fisherlsd进行后续比较。动物实验结果如图3和图4所示。

图3结果显示牛樟芝萃取物的分萃物(f2)在口服投予植入人类肠癌细胞hct116的免疫缺陷小鼠不同剂量时，f2对肿瘤的抑制具有剂量效应，在投予剂量400mg/kg组有明显的统计差异，此结果说明400mg/kg是对植入人类肠癌细胞hct116的免疫缺陷小鼠为治疗有效剂量。图4结果显示牛樟芝萃取物的分萃物(f2)三个投予剂量皆不会造成植入人类肠癌细胞hct116的免疫缺陷小鼠体重减轻，此结果说明牛樟芝萃取物的分萃物(f2)在抑制肿瘤时不会造成体重减轻的副作用。

3、牛樟芝组合物对化疗药物cisplatin在c57bl/6免疫正常小鼠的改善骨髓抑制功效试验

1)实验动物的饲养

本次研究使用动物为c57bl/6小鼠，购自台湾实验动物中心，六周龄。饲养控制温度为25±2℃，光照时间为08:00～20:00，每日提供充足饲料及饮水，每周更换垫料两次。

2)试验物质及投予途径

在第1天施打cisplatin(cis,20mg/kg)，采用腹腔注射。第1至5天以管喂方式投予牛樟芝组合物(400mg/kg)，第1天管喂时间为施打化疗药物4小时后。动物组别分别为控制组、cis及牛樟芝组合物(ac)，每组6只小鼠，3组共18只。

3)骨髓造血能力的评估

第6天以co2牺牲实验动物，手术取下小鼠大腿骨，剪开骨头两端，冲出骨髓细胞，离心并清洗后，将细胞加入methocultm3334medium或methocultm3234medium，静置在37℃含5％co2的湿润培养箱中培养，前者培养48小时后以显微镜观察并计算cfu-e(colony-formingunit-erythroid)的colony数目，后者培养7天后以显微镜观察并计算cfu-gm(colony-formingunit-granulocyte,macrophage)的colony数目。cfu-e及cfu-gm的colony数目计数采用全视野观察。

4)周边血液白血球变化的评估

实验动物牺牲前，以脸颊采血方式收集全血，以抗凝全血进行全血细胞计数(completebloodcount，cbc)，判定周边血液白血球数目。

5)统计分析方法

以单因子变异数分析(one-wayanova)进行数据分析，当分析结果达到显著时，以fisherlsd进行后续比较。动物实验结果如图5、图6和图7所示。

图5结果显示化疗药物cisplatin会使免疫正常小鼠的白血球数目下降，牛樟芝组合物与化疗药物cisplatin合用时，牛樟芝组合物可有效改善化疗药物cisplatin造成的白血球数目下降，使其恢复与控制组相当。图6结果显示化疗药物cisplatin会抑制免疫正常小鼠的骨髓白血球前驱细胞cfu-gm数量，牛樟芝组合物与化疗药物cisplatin合用时，牛樟芝组合物可有效改善化疗药物cisplatin造成的骨髓抑制，使cfu-gm数目显著提升。图7结果显示化疗药物cisplatin会抑制免疫正常小鼠的骨髓红血球前驱细胞cfu-e数量，牛樟芝组合物与化疗药物cisplatin合用时，牛樟芝组合物可有效改善化疗药物cisplatin造成的骨髓抑制，使cfu-e数目显著提升。

以上结果说明牛樟芝组合物与化疗药物cisplatin合用时，可改善化疗药物cisplatin对免疫正常小鼠产生的副作用包括白血球数目下降、骨髓红白血球前驱细胞cfu-gm和cfu-e的数量减少。

另外，本发明实施例提供了一种医药组合物，该组合物包括治疗有效剂量的如上述方法制得的粗萃取物(crude)及视情况医药学上可接受的载剂，用于制备预防或治疗大肠癌、肝癌及皮肤癌的医药品。该医药品对大肠癌、肝癌及皮肤癌细胞具有毒杀效果。

另外，本发明实施例提供了一种医药组合物，该组合物包括治疗有效剂量的如上述方法制得的牛樟芝萃取物的分萃物f2或分萃物f3及视情况医药学上可接受的载剂，用于制备预防或治疗大肠癌、肝癌、胃癌、肺癌、乳癌及皮肤癌的医药品。该医药品对大肠癌、肝癌、胃癌、肺癌、乳癌及皮肤癌细胞具有毒杀效果。

另外，本发明实施例还提供了一种医药组合物，该组合物包括治疗有效剂量的如上述方法制得的牛樟芝组合物及视情况医药学上可接受的载剂，用于制备改善化疗药物顺铂及含铂系列药物造成副作用的药品。该药品可改善化疗药物顺铂系列药物造成的白血球数目低下和骨髓抑制现象。

除非本文另外界定，否则本发明所用的科学及技术术语应具有本领域技术人员所理解的含义。这些技术术语的含义及范畴应为清晰的。然而，在任何潜在歧义的情况下，本文所提供的定义优于任何辞典或外在定义。除非另外指出，否则如本发明内容所用的以下术语应理解为具有以下含义。如本发明所用的术语“癌症”系指恶性组织细胞生长失去控制的疾病。这种细胞生长可能会造成转移，侵入相邻的组织。如本发明所用的术语“治疗”表示缓解或改善生病个体的症状。如本发明所用的术语“个体”表示动物，尤其哺乳动物。如本发明所用的术语“治疗有效剂量”系指单独或与其他治疗/药物组合使用以治疗癌症显示治疗功效的活性成份的量。术语“载剂”或“医药学上可接受的载剂”系指本领域技术人员所熟知的用于制备医药组合物的稀释剂、赋形剂、接受剂或类似物。

本领域技术人员能理解到本发明实施例可容易达成目标，并获得所提到的结果及优点，以及那些存在于其中的东西。本发明实施例中的组合物及其制备方法为较佳实施例的代表，其为示范性且不仅局限于本发明领域。本领域技术人员将会想到其中可修改之处及其他用途。这些修改都包含在本发明的精神中，并在本发明的保护范围内界定。

本发明的内容叙述与实施例均揭示详细，使得本领域技术人员任何熟能够制造及使用本发明，即使其中有各种不同的改变、修饰及进步之处，仍应视为不脱离本发明的精神及范围。

在此所适当地举例说明的发明，可能得以在缺乏任何要件，或许多要件、限制条件或并非特定为本文中所揭示的限制情况下实施。所使用的名词及表达是作为说明书的描述而非限制，同时并无意图使用这类排除任何等同于所示及说明的特点或其部份的名词及表达，但需认清的是，在本发明的保护范围之内有可能出现各种不同的改变。因此，应了解到虽然已根据较佳实施例及任意的特点来具体揭示本发明，但是本领域技术人员仍会修改和改变其中所揭示的内容，诸如此类的修改和变化仍在本发明的保护范围之内。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。