一种具有声动力治疗效果的金属-卟啉纳米颗粒、制备方法及其应用与流程

本发明涉及一种靶向多肽修饰的金属-卟啉纳米颗粒、制备方法，及其应用。

背景技术：

肝癌是临床最常见的肿瘤之一，位居恶性肿瘤发病率第六位，病死率第三位，每年有约50万的新增病例。目前针对肝癌的治疗方法主要有手术切除，射频消融，化疗，经肝动脉化疗栓塞(tace)等，但是均具有很大的局限性。手术切除和射频消融适应患者不足40％；化疗有严重的副作用以及耐药性，治疗效果差；tace有诸多禁忌症以及不良反应。光动力治疗(pdt)利用无毒的光与光敏剂产生活性氧(ros)杀伤肿瘤细胞，引起研究者的极大关注，其优点是可以有效的、选择性的破坏肿瘤组织而不损伤相邻的健康组织。与目前常用的治疗方法相比，虽然光动力治疗具有其独特的优点，但其临床应用依旧很少。这是因为目前光动力治疗技术存在很严重的限制，例如光的穿透深度浅、药物非特异性分布造成的皮肤光毒性等。声动力(sdt)治疗利用低频超声激活声敏剂，产生ros杀伤肿瘤细胞，较之pdt具有很好的穿透深度，可用于治疗深部肿瘤。但由于声敏剂靶向性差，肿瘤部位药物浓度低，以及细胞内抗氧化物质抵抗治疗效果，故治疗效果欠佳。

技术实现要素：

本发明的主要目的，在于提供一种卟啉类金属-有机纳米颗粒，可以特异性地富集在肿瘤区域，并且可以通过降低肿瘤细胞内抗氧化物质sod2的含量达到较好的声动力治疗效果。

本发明的技术方案如下：

一种具有声动力治疗效果的金属-卟啉纳米颗粒，利用卟啉的磺酸根与金属离子反应，形成纳米颗粒，然后在其表面修饰靶向多肽，最后再负载功能性sirna，形成具有肿瘤特异性靶向效果的多功能金属-卟啉纳米颗粒；其中，

所述的卟啉为磺酸根离子修饰的卟啉分子；

所述的金属离子包括铁离子(fe³⁺)、锰离子(mn²⁺)、钆离子(gd²⁺)、锌离子(zn²⁺)、铜离子(cu²⁺)中的至少一种；

所述的靶向多肽是crgdfc(cyclo(arg-gly-asp-d-phe-cys))，crgdyk(cyclo(arg-gly-asp-d-tyr-lys))，crgdyc(cyclo(arg-gly-asp-d-tyr-cys))，crgdfk(cyclo(arg-gly-asp-d-phe-lys))，中的至少一种；

所述的sirna是能够降低细胞内sod2表达的sirna。

作为优选，所述的卟啉类分子为meso-四(4-磺酸钠苯基)卟啉(tpps)。

本发明的另一目的，在于提供上述的一种具有声动力治疗效果的金属-卟啉纳米颗粒在肿瘤治疗制剂中的应用。

作为优选，所述的肿瘤治疗制剂为声动力和基因联合治疗癌症制剂。

本发明的再一目的，在于提供一种具有声动力治疗效果的金属-卟啉纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：

1)制备卟啉和金属离子组装的纳米结构；所述的卟啉为磺酸根离子修饰的卟啉分子；

所述的金属离子包括铁离子(fe³⁺)、锰离子(mn²⁺)、钆离子(gd²⁺)、锌离子(zn²⁺)、铜离子(cu²⁺)中的至少一种；

2)制备具有靶向性多肽偶联的zn(ii)-二甲基吡啶胺二聚体(bis(dpa-zn)；所述的靶向性多肽是指crgdfc，crgdyk，crgdyc，crgdfk中的一种；

3)将2)中制备有机分子加入到a)中制备纳米结构中进行表面修饰。

作为优选，所述的具有声动力治疗效果的金属-卟啉纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：

a)将三氯化铁与卟啉溶解于去离子水中，100-2000rpm室温搅拌12-36h；

b)将以上溶液移入30kd超滤管，3000-5000rpm室温离心10-20min；

c)去上清液，取沉淀，用去1-5ml离子水吹打混匀，放入超滤管中离心，3000-5000rpm15-25min，此步骤重复1-4次；

d)将以上沉淀用1-5ml去离子水重悬，制成初步的纳米颗粒；

e)首先制备dpa的二聚体—bis(dpa)；接着利用制备的bis(dpa)和rgd进行偶联；

第一，将2-4mgbis(dpa)和2-4mgsulfo-smcc加入到1-3mldmso中，震荡至均匀分散，并且反应2h-10h。

第二，1-2mgcrgdyk多肽分散到1-3mlpbs中，接着加入0.5-0.7mgtraut试剂；在3-5℃反应0.5-5h制备得到rgd-sh；

第三，bis(dpa)-smcc分散到dmso中，rgd-sh分散到pbs，按照摩尔比1-2:1-2在3-5℃反应12-36h，制备的bis(dpa)-rgd利用hplc进行纯化；

最后，制备混合溶液，其中含1-3mm分散在dmso中的bis(dpa)-rgd和3-5mmzn²⁺溶液，搅拌1-3h，制备成bis(dpa-zn)-rgd；

f)取0.5-2ml步骤d)制成的初步纳米颗粒，加入10-100ul的bis(dpa-zn)-rgd，室温搅拌(1000rpm)过夜，重复步骤(c)，将沉淀用0.5-2ml去离子水重悬，制成靶向纳米颗粒；

g)将靶向纳米颗粒与sirna按照50-100ug：10pm的比例混合，静置30-60min，得到最终的卟啉-金属纳米颗粒。

优选地，上述方法中，步骤1)为：

a)将三氯化铁与卟啉溶解于去离子水中，室温搅拌(1000rpm)24h；

b)将以上溶液移入30kd超滤管，室温离心(4000rpm)15min；

c)取沉淀用去3ml离子水吹打混匀，放入超滤管中离心(4000rpm)15-25min，此步骤重复3次；

d)将以上沉淀用3ml去离子水重悬，制成纳米结构。

优选地，上述方法中，步骤2)为：首先制备dpa的二聚体—bis(dpa)，接着利用制备的bis(dpa)和rgd进行偶联；

第一，将3.38mgbis(dpa)和2.18mgsulfo-smcc加入到2mldmso中，震荡至均匀分散，并且反应2h以上；

第二，1.73mgcrgdyk多肽分散到2mlpbs(ph7.4)中，接着加入0.6mgtraut试剂。在4℃反应2h制备得到rgd-sh；

第三，bis(dpa)-smcc分散到dmso中，rgd-sh分散到pbs(ph7.4)按照摩尔比1:1在4℃反应24h，制备的bis(dpa)-rgd利用hplc进行纯化；

最后，简单的混合2mlbis(dpa)-rgd溶液(2mm，分散在dmso中)和2mlzn²⁺溶液(4mm)，搅拌2h，制备成bis(dpa-zn)-rgd。

取1ml初步制成的纳米颗粒，加入10-100ul的bis(dpa-zn)-rgd，室温搅拌(1000rpm)过夜，重复步骤(c)，将沉淀用1ml去离子水重悬，制成靶向纳米颗粒。

本发明，纳米颗粒通过实体瘤的高通透性的滞留(epr)效应，对肿瘤具有良好的被动靶向效果，可以增加药物在肿瘤部位的蓄积，减少非特异性分布。除了被动靶向外，利用配体、受体可以实现纳米颗粒的主动靶向功能，进一步提高肿瘤特异性分布。其中，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(rgd)可以与肿瘤新生血管高表达的αvβ3整合素特异性结合。而所有实体瘤细胞(乳腺癌、前列腺癌、肝癌等)成瘤过程必然伴随着肿瘤新血管生成整合素αvβ3作为肿瘤发生发展过程中的共有物质，具有一定的特异性。

细胞内抗氧化物质主要有超氧化物歧化酶(sod1，sod2)、谷胱甘肽(gsh)以及维生素e等，细胞可以通过抗氧化物质抵抗ros的杀伤效果，故可以通过减少细胞内抗氧化物质的含量增强ros的杀伤效果。铁、铜、锰等金属离子可以将谷胱甘肽氧化，降低细胞抗氧化能力。通过递送特定序列的sirna进入细胞，可以下调超氧化物歧化酶的含量，实现两种抗肿瘤治疗的协同疗效。

从上述技术方案可以看出，本公开提供的金属-卟啉纳米颗粒，具有以下有益效果：

通过化学方法将卟啉制作成纳米颗粒，并在表面修饰靶向多肽，可以提高药物在肿瘤处的靶向富集，增强其声动力效果。通过递送的sirna降低肿瘤细胞内抗氧化酶sod2的含量，可以进一步增强声动力对肿瘤的杀伤效果，从而实现对深部位肝癌的较彻底治疗。

附图说明

图1为根据本公开实施例制备的的制备流程图。

图2a为根据本公开实施例制备的纳米颗粒的tem图。

图2b为根据本公开实施例制备的纳米颗粒的粒度分析图。

图2c为根据本公开实施例制备的纳米颗粒与普通的卟啉的吸收曲线图。

图2d为根据本公开实施例制备的纳米颗粒与普通的卟啉的荧光光谱图。

图3a、3b为根据本公开实施例制备的纳米颗粒的声动力产ros性能图。

图3c为根据本公开实施例制备的纳米颗粒的凝胶电泳图。

图3d为根据本公开实施例制备的纳米颗粒合成过程表面电势变化图。

图4a为根据本公开实施例制备的纳米颗粒下调细胞内超氧化物歧化酶2的westernblot图。

图4b为根据本公开实施例制备的纳米颗粒下调超氧化物歧化酶2相对定量图。

具体实施方式

为了本公开的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本公开进一步详细说明。

本发明提供一种卟啉类金属-有机纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：

a)将三氯化铁与卟啉溶解于去离子水中，室温搅拌(1000rpm)24h；

b)将以上溶液移入30kd超滤管，室温离心(4000rpm)15min；

c)取沉淀用去3ml离子水吹打混匀，放入超滤管中离心(4000rpm)15-25min，此步骤重复3次；

d)将以上沉淀用3ml去离子水重悬，初步制成的纳米颗粒；

e)首先结合申请人之前的工作制备dpa的二聚体—bis(dpa)(g.liu,k.y.choi,a.bhirde,m.swierczewska,x.chen,angew.chem.int.ed.2012,51,445-449)。接着利用制备的二甲基吡啶胺二聚体(bis(dpa))和rgd进行偶联。第一，将3.38mgbis(dpa)和2.18mg4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo-smcc)加入到2ml二甲基亚砜(dmso)中，震荡至均匀分散，并且反应2h以上。第二，1.73mgcrgdyk多肽分散到2mlpbs(ph7.4)中，接着加入0.6mgtraut试剂。在4℃反应2h制备得到rgd-sh。第三，bis(dpa)-smcc分散到dmso中，rgd-sh分散到pbs(ph7.4)按照摩尔比1:1在4℃反应24h，制备的bis(dpa)-rgd利用hplc进行纯化。最后，简单的混合2mlbis(dpa)-rgd溶液(2mm，分散在dmso中)和zn²⁺溶液(4mm)，搅拌2h，制备成bis(dpa-zn)-rgd。

f)取1ml初步制成的纳米颗粒，加入10-100ul的bis(dpa-zn)-rgd，室温搅拌(1000rpm)过夜，重复步骤(c)，将沉淀用1ml去离子水重悬，制成靶向纳米颗粒。

g)将靶向纳米颗粒与sirna按照50-100ug：10pm的比例混合，静置30-60min，得到最终的卟啉-金属纳米颗粒。

本公开提供的金属-卟啉纳米颗粒，通过金属离子与卟啉(tpps)的结合，修饰靶向多肽，共递送sirna，制备成金属-卟啉纳米颗粒(nanotpps)，其粒度约100nm，具有较好的肿瘤靶向性能及声动力产ros性能，同时联合基因治疗，具有很好的杀伤肿瘤细胞的效果。

图1为根据本公开实施例纳米颗粒的制备方法流程图，如图1所示，本公开卟啉-金属纳米颗粒的制备方法，包括：

步骤1：在卟啉与金属离子加入超纯水中，室温搅拌，超滤得纳米颗粒前体；

本实施例中的卟啉为meso-四(4-磺酸钠苯基)卟啉，其质量为1mg，超纯水的体积为

5ml；本实施例中的金属离子是指铁离子(fe³⁺)，其质量为20mg，在其它实施例中，

对于其他的场景，也可以是其他的离子，如锰离子(mn²⁺)、钆离子(gd²⁺)锌离子(zn²⁺)、铜离子(cu²⁺)等；

本实施例中的搅拌速度为1000rpm，搅拌时间为12h；

本实施例中，超滤过程中使用的超滤管分子量为30kd，离心转速为4000rpm，离心时间为15min；

步骤2：取bis(dpa)和sulfo-smcc加入dmso中，震荡混匀，静置反应得到bis(dpa)-smcc。

本实施例中bis(dpa)的质量为3.38mg，sulfo-smcc的质量为2.18mg，dmso的体积为2ml，反应时间为2-4h。

步骤3：在crgdyk多肽的pbs溶液中加入traut试剂，反应得到rgd-sh。

本实施例中，crgdyk多肽的质量为1.73mg，pbs溶液的ph为7.4，体积为2ml；

本本实施例中，traut试剂的质量为0.6mg；

本实施例中的反应温度为4℃，反应时间为2h；

步骤4：将bis(dpa)-smcc的dmso溶液与rgd-sh的pbs溶液混合，反应纯化得到bis(dpa-zn)-rgd；

本实施例中，bis(dpa)-smcc和rgd-sh的摩尔比为1:1；

本实施例中的反应温度为4℃，反应时间为24h；

本实施例中利用hplc对其纯化；

步骤5：bis(dpa-zn)-rgd溶液中加入锌离子(zn²⁺)，制备出bis(dpa-zn)-rgd。

本实施例中，bis(dpa-zn)-rgd溶解在dmso中，其浓度为2mm；

本实施例中，zn²⁺浓度为4mm，反应条件为搅拌(1000转/分钟)，时间为2h；

步骤6：在纳米颗前体溶液中，加入bis(dpa-zn)-rgd，反应过夜，超滤纯化得到靶向纳米颗粒。

本实施例中，将1mg纳米颗粒前体加入5ml的超纯水中；

本实施例中，bis(dpa-zn)-rgd的浓度为1mm，体积为100ul，

本实施例中，反应条件为室温搅拌(1000rpm)；

本实施例中，超滤管分子量为30kd，离心转速为4000rpm，离心时间为30min；

步骤7：在靶向纳米颗粒溶液中，加入sirna，反应得到最终的卟啉-金属纳米颗粒，将其避光4℃保存。

本实施例中，选用sirna的序列为5′-caacaggccuuauuccacu-3′。

本实施例中，靶向纳米颗粒与sirna的比例为50-100ug：10pm。

本实施例中，反应条件为4℃静置60min。

图2a为根据本实施例制备的纳米颗粒的tem图；图2b为根据本实施例制备的纳米颗粒的粒径分布图

结合图2a和图2b可知，该纳米颗粒呈梭形，粒径均一，结构稳定；该纳米颗粒在水中的平均直径为100nm，该粒径为其体内应用提供了保障。

基于以上实施例中制备的纳米颗粒，进行了基本的性能测试。

图2c和图2d为纳米颗粒与tpps的紫外吸收曲线图与荧光光谱图。根据图2c、2d可知，纳米化之后，药物吸收曲线红移，在红外光区有明显吸收并可以激发出红外区域的荧光，这对药物在体内的示踪，具有重要的意义。

图3a和图3b为根据本公开实施例制备的卟啉-金属纳米颗粒的声动力产ros性能检测图，利用ros检测试剂dma对其产ros性能进行检测，可以看出所制备的纳米颗粒具有较好的声动力产ros性能，且在一定范围内具有浓度依赖性。

图3c为根据本公开实施例制备的卟啉-金属纳米颗粒的sirna凝胶阻滞电泳检测图，结果显示，当纳米颗粒与sirna的比例为50μg：10pm和100μg：10pm时，纳米颗粒与sirna可以完全结合。

图3d为根据本公开实施例制备的卟啉-金属纳米颗粒合成过程中表面电势变化图，单纯的纳米颗粒表面电势为-65±4.08mv，纳米颗粒表面修饰靶向多肽后表面电势为-20±1.63mv，靶向纳米颗粒装载sirna后表面电势为-34±1.69mv。

图4a和图4b分别为根据本公开实施例制备的卟啉-金属纳米颗粒对细胞内sod2作用的westernblot结果图及其相对定量图，图中可以看出纳米颗粒装载具有下调sod2表达的sirna后，与细胞孵育24小时，可以明显下调细胞内抗氧化酶sod2的含量，并且相对于单纯的sirna，纳米化之后下调作用更明显，是由于靶向纳米颗粒可以递送更多的sirna进入细胞，产生作用。