一种纳米载体的制备方法和用途与流程

本发明涉及药物剂型和制剂技术领域，具体涉及一种高渗透、皮肤滞留时间长的纳米载体的制备方法及用途。

背景技术：

皮肤是人体最大的器官，由角质层、活性表皮层、真皮层和皮下组织组成，同时皮肤内存在毛囊、汗腺等皮肤附属器。起到保护人体不受外界物理化学伤害，散热和传感的作用。皮肤护理和皮肤疾病的治疗都需要活性成分持续作用于皮肤表皮层，在表皮层形成储库，持续稳定的释放，达到治疗或护理的目的。但由于皮肤角质层的独特性质，阻碍了大部分的活性成分的透过，造成或活性成分透过量低，滞留效果差，影响治疗效果。

皮肤护理越来热门，然而，由于皮肤护理制剂中的某些功效成分具有特殊的分子结构、理化性质等，加上人体皮肤独特的解剖学结构和生理功能及转运通道等诸多因素的影响，大多数皮肤护理功效成分难以通过皮肤外用的自然扩散、渗透、吸收等途径进入到皮肤及皮下组织，从而严重影响或明显削弱了这些天然药物或功效成分所应发挥的美白、保湿、抗皱、抗过敏、祛痘、嫩肤、延缓衰老等生理学作用。研究表明皮肤护理成分经缓控释系统装载调控，可以有效提高溶解度，增强穿透力，延长美容功效和活性成分在体内的存在时间。

目前真菌性皮肤病、球菌性皮肤病、病毒性皮肤病、杆菌性皮肤病等造成人们越来越多的困扰。采用透皮给药治疗皮肤疾病首先能够避免口服给药的首过效应，同时也能避免一些肠胃刺激的副作用，当使用者自身认为需要停止治疗时，还可以轻易的移除制剂。研究表明皮肤护理成分经缓控释系统装载调控，能够将药物高效输送到皮肤局部组织，在皮肤内形成较高的浓度的同时尽可能减少吸收入血，达到抗菌效果的同时还可以减少产生副作用。

而药物载体材料的选择要求良好的生物相容性、可降解性，同时对药物的药理作用不造成影响。目前常用的载体材料中，合成高分子材料生物相容性、可降解性和细胞毒性等方面存在诸多弊端，天然高分子载体材料在这方面有所缓解，但大多数天然高分子材料在含水环境中溶解或溶胀，造成包裹药物的快速溶出，不利于药物的持续释放。因此，选择合适的载体材料对皮肤护理和皮肤疾病的治疗尤为重要。

玉米醇溶蛋白，是玉米湿法生产淀粉、酒精、淀粉糖等时产生的主要副产物，是由多种具有不同分子量大小、溶解能力和电荷的肽通过二硫键聚集起来的非均相混合物，平均分子量为44kd，有较高比例的非极性氨基酸残基和较低比例的碱性、酸性氨基酸组成。有四分之三的亲脂性和四分之一的亲水性。作为载体材料，玉米醇溶蛋白具有以下特点：(1)具有良好生物相容性，生物降解性，绿色，天然，安全；(2)具有疏水性及独特溶解性，可作为疏水性药物或功能活性药物的理想载体；(3)分子链上带有羟基、氨基、羧基扥大量可反应的官能团，易与其他化合物化学修饰结合形成复合高聚物，构建成不同特性的载体输送药物；(4)玉米醇溶蛋白源于玉米黄粉，资源丰富，成本低廉。

磷脂是一种两亲性分子，是构成细胞膜的重要组分。具有控制多种成分进入细胞或排出细胞外的重要功能，也可发挥多种保健作用。人体所有细胞中都含有磷脂，它是维持生命活动的基础物质。磷脂对活化细胞，维持新陈代谢，基础代谢及荷尔蒙的均衡分泌，增强人体的免疫力和再生力，都能发挥重大的作用。磷脂常被用作载体材料，可增加活性成分的溶解度，促进细胞摄取。

采用相分离法，以合适的比例使玉米醇溶蛋白和磷脂自组装形成纳米载体，包裹皮肤护理或皮肤治疗功能成分，得到纳米制剂，透皮给药，以达到皮肤护理或皮肤治疗的目的还未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的是使活性成分持续作用于皮肤表皮层，在表皮层形成储库，持续稳定的释放，实现对皮肤的治疗或护理，因此，本发明涉及一种高渗透、皮肤滞留时间长的纳米载体的制备。

本发明采用相分离法，以合适的比例使玉米醇溶蛋白和磷脂自组装形成纳米载体，包裹活性成分，不仅绿色、可降解、载药量大，稳定性好，而且可促进活性成分穿透皮肤角质层进入皮肤深层组织，并在皮肤深处富集并长时间滞留，缓慢释放活性成分，降低不良反应。

本发明高渗透、皮肤滞留时间长的纳米载体材料包括玉米醇溶蛋白和磷脂。

所述的磷脂选自蛋黄卵磷脂，氢化蛋黄卵磷脂，大豆卵磷脂，氢化大豆卵磷脂，鞘磷脂，磷脂酰乙醇胺，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂酰胆碱，二硬酯酰磷脂酰胆碱，二油酰磷脂酰胆碱，二月桂酰磷脂酰胆碱中的一种或几种；所述的玉米醇溶蛋白和磷脂的质量比为1:10-4:1；所述的纳米载体包裹的活性成分可为皮肤护理、皮肤疾病治疗功能成分中的一种或一种以上的组合。

所述的活性成分包括但不限于熊果苷、人表皮生长因子、维生素e、银杏黄素、盐酸多塞平、盐酸左西替利嗪、水杨酸、三七总皂苷、酮康唑、盐酸特比萘芬、阿米卡星、隐丹参酮或克拉霉素丁。

所述的纳米载体的制备方法，其特征在于：将玉米醇溶蛋白溶于乙醇的水溶液中，磷脂溶于乙醇溶液中，分别搅拌状态下加热孵育一段时间后，两溶液混合后继续加热孵育一段时间，在磁力搅拌下将混合溶液快速分散于纯水中，常温下搅拌一定时间挥去乙醇得到纳米载体。

所述的纳米载体的制备方法，其特征在于孵育温度为10-100℃；所述的乙醇水溶液的体积分数为60-85％；所述的分散水体积为5ml-200ml。

所述的纳米载体的载药方法，其特征在于：将活性成分和玉米醇溶蛋白共同溶于乙醇的水溶液中，其余步骤与空白纳米载体制备方法完全相同。

所述的纳米载体包裹活性成分后可应用于皮肤护理、皮肤疾病的治疗。在皮肤护理方面的应用包括，但不限于美白、保湿、抗皱、抗过敏、祛痘、嫩肤、延缓衰老或其组合等；在皮肤疾病治疗方面的应用包括，但不限于真菌性皮肤病、球菌性皮肤病、病毒性皮肤病、杆菌性皮肤病或其组合等。

纳米载体载药后制得的纳米制剂溶液与空白乳膏以一定比例复配涂抹于皮肤进行给药。空白乳膏基质可以为油脂性基质、乳剂型基质、水溶性基质或其组合；空白乳膏制备方法可以是研磨法、乳化法、熔融法等。

本发明制备的关键点在于：所述的玉米醇溶蛋白和磷脂的质量比为1:10-4:1。如果玉米醇溶蛋白和磷脂的质量比低于1:10，药物的包封率和载药量显著下降；如果玉米醇溶蛋白和磷脂的质量比高于4:1，磷脂过少，此制剂的稳定性显著下降，呈浑浊状态。

给药微粒粒径对皮肤局部吸收影响较大。有报道发现给药微粒粒径越小，在皮肤中透过能力和滞留能力越强，药物在表皮、真皮和毛囊中富集越高。本发明制备的纳米载体粒径范围为100-250nm，对于玉米醇溶蛋白和磷脂自组装形成的纳米载体而言，控制在这个较小的粒径范围，处方和工艺是非常重要的。而且，这个粒径范围的纳米载体在皮肤中的透过能力和滞留能力是非常强的。本发明的优点在于：所述的纳米载体的制备方法简单，对设备要求较低，所需材料廉价易得，适合工业化生产，并且给药灵活方便。刺激性实验表明此纳米载体载药后制得的纳米制剂无刺激性或刺激性较低。药效实验表明，载体材料生物粘附性特点与纳米技术的结合促进了活性成分的渗透，延长了皮肤滞留时间，从而增强了活性成分的药效。

附图说明

图1是实施例1空白纳米载体透射电镜图；

图2是实施例4熊果苷纳米粒粒径分布图；

图3是实施例4熊果苷纳米粒皮肤累积透过曲线。

具体实施方式

以下通过具体实施例进一步说明本发明，但本发明并不限于下列实施例包含的内容。

实施例1

将玉米醇溶蛋白30mg溶于3ml体积分数为80％乙醇溶液中，30mg蛋黄卵磷脂溶于1ml乙醇中，分别于40℃孵育0.5h，两溶液混合后继续孵育1h，最后在1000rpm磁力搅拌下将混合溶液快速分散于30ml纯水中，常温下搅拌3h挥去乙醇得到粒径为191nm的空白纳米载体。

实施例2

将熊果苷30mg和玉米醇溶蛋白50mg溶于4ml体积分数为80％乙醇溶液中，10mg蛋黄卵磷脂溶于2ml乙醇中，分别于40℃孵育0.5h，两溶液混合后继续孵育1h，最后在1000rpm磁力搅拌下将混合溶液快速分散于30ml纯水中，常温下搅拌3h挥去乙醇得到浑浊的液体，未能形成纳米粒。

实施例3

将熊果苷30mg和玉米醇溶蛋白5mg溶于4ml体积分数为80％乙醇溶液中，55mg蛋黄卵磷脂溶于2ml乙醇中，分别于40℃孵育0.5h，两溶液混合后继续孵育1h，最后在1000rpm磁力搅拌下将混合溶液快速分散于30ml纯水中，常温下搅拌3h挥去乙醇得到粒径为207nm的纳米粒，包封率为31.56％，载药量为13.63％。此熊果苷纳米粒的包封率和载药量较低。

实施例4

将熊果苷30mg和玉米醇溶蛋白30mg溶于4ml体积分数为80％乙醇溶液中，40mg蛋黄卵磷脂溶于2ml乙醇中，分别于40℃孵育0.5h，两溶液混合后继续孵育1h，最后在1000rpm磁力搅拌下将混合溶液快速分散于30ml纯水中，常温下搅拌3h挥去乙醇得到粒径为219nm的纳米粒，包封率为73.02％，载药量为23.84％。此熊果苷纳米粒经透皮给药后，可用于皮肤美白，抑制黑色素的生成，消退老年黄褐斑，雀斑。

实施例5

将人表皮生长因子20mg和玉米醇溶蛋白30mg溶于3ml体积分数为60％乙醇溶液中，40mg蛋黄卵磷脂溶于1ml乙醇中，分别于30℃孵育0.5h，两溶液混合后继续孵育1h，最后在1000rpm磁力搅拌下将混合溶液快速分散于30ml纯水中，常温下搅拌3h挥去乙醇得到粒径为240nm的纳米粒，包封率为63.31％，载药量为15.32％。此人表皮生长因子纳米粒经透皮给药后，可用于保湿，增加皮肤含水量，进而增加皮肤弹性，减少皮肤皱纹和防止皮肤衰老。

实施例6

将维生素e20mg和玉米醇溶蛋白20mg溶于3ml体积分数为70％乙醇溶液中，40mg大豆卵磷脂溶于1ml乙醇中，分别于40℃孵育0.5h，两溶液混合后继续孵育1h，最后在1000rpm磁力搅拌下将混合溶液快速分散于30ml纯水中，常温下搅拌3h挥去乙醇得到粒径为176nm的纳米粒，包封率为80.31％，载药量为21.12％。此维生素e纳米粒经透皮给药后，可用于皮肤老化的防治，改善不同脸部部位的皮肤皱纹及因为长期干燥而出现的皮肤细纹，提高皮肤弹性。

实施例7

将银杏黄素5mg和玉米醇溶蛋白20mg溶于3ml体积分数为80％乙醇溶液中，35mg大豆卵磷脂和1mg二月桂酰磷脂酰胆碱溶于1ml乙醇中，分别于40℃孵育0.5h，两溶液混合后继续孵育1h，最后在1000rpm磁力搅拌下将混合溶液快速分散于30ml纯水中，常温下搅拌3h挥去乙醇得到粒径为204nm的纳米粒，包封率为65.54％，载药量为5.53％。此银杏黄素纳米粒经透皮给药后，可用于皮肤老化的防治，改善不同脸部部位的皮肤皱纹及因为长期干燥而出现的皮肤细纹，提高皮肤弹性。

实施例8

将盐酸多塞平20mg和玉米醇溶蛋白20mg溶于2ml体积分数为75％乙醇溶液中，25mg蛋黄卵磷脂和1mg鞘磷脂溶于1ml乙醇中，分别于40℃孵育0.5h，两溶液混合后继续孵育1h，最后在1000rpm磁力搅拌下将混合溶液快速分散于30ml纯水中，常温下搅拌3h挥去乙醇得到粒径为181nm的纳米粒，包封率为82.29％，载药量为26.35％。此盐酸多塞平纳米粒经透皮给药后，可用于止痒、抑制致炎性物质所致毛细血管通透性增加，发挥抗过敏作用。。

实施例9

将盐酸左西替利嗪20mg和玉米醇溶蛋白20mg溶于4ml体积分数为75％乙醇溶液中，25mg蛋黄卵磷脂和2mg磷脂酰乙醇胺溶于1ml乙醇中，分别于40℃孵育0.5h，两溶液混合后继续孵育1h，最后在1000rpm磁力搅拌下将混合溶液快速分散于30ml纯水中，常温下搅拌3h挥去乙醇得到粒径为224nm的纳米粒，包封率为70.00％，载药量为22.95％。此盐酸左西替利嗪纳米粒经透皮给药后，可用于止痒和对局部过敏性皮肤病的治疗。

实施例10

将水杨酸15mg和玉米醇溶蛋白20mg溶于2ml体积分数为65％乙醇溶液中，20mg蛋黄卵磷脂溶于1ml乙醇中，分别于40℃孵育0.5h，两溶液混合后继续孵育1h，最后在1000rpm磁力搅拌下将混合溶液快速分散于30ml纯水中，常温下搅拌3h挥去乙醇得到粒径为201nm的纳米粒，包封率为75.51％，载药量为22.07％。此水杨酸纳米粒经透皮给药后，可用于祛痘、淡化色素色斑、缩小毛孔、祛除细小皱纹及改善日晒引起的老化，此外，还可应用于治疗各种慢性皮肤病，如浅部真菌感染、痤疮、脂溢性皮炎、疣、鸡眼、银屑病及局部角质增生等。

实施例11

将三七总皂苷20mg和玉米醇溶蛋白20mg溶于2ml体积分数为75％乙醇溶液中，20mg蛋黄卵磷脂和2mg二棕榈酰磷脂酰胆碱溶于1ml乙醇中，分别于40℃孵育0.5h，两溶液混合后继续孵育1h，最后在1000rpm磁力搅拌下将混合溶液快速分散于30ml纯水中，常温下搅拌3h挥去乙醇得到粒径为180nm的纳米粒，包封率为61.97％，载药量为22.79％。此三七总皂苷纳米粒经透皮给药后，可用于嫩肤增颜，延缓衰老等。

实施例12

将酮康唑20mg和玉米醇溶蛋白40mg溶于2ml体积分数为75％乙醇溶液中，40mg蛋黄卵磷脂溶于1ml乙醇中，分别于40℃孵育0.5h，两溶液混合后继续孵育1h，最后在1000rpm磁力搅拌下将混合溶液快速分散于30ml纯水中，常温下搅拌3h挥去乙醇得到粒径为220nm的纳米粒，包封率为81.33％，载药量为16.90％。此酮康唑纳米粒经透皮给药后，可用于抑制真菌麦角甾醇等固醇的生物合成，治疗皮肤真菌病、阴道念珠菌病等。

实施例13

将盐酸特比萘芬20mg和玉米醇溶蛋白30mg溶于3ml体积分数为80％乙醇溶液中，40mg氢化蛋黄卵磷脂溶于1ml乙醇中，分别于40℃孵育0.5h，两溶液混合后继续孵育1h，最后在1000rpm磁力搅拌下将混合溶液快速分散于30ml纯水中，常温下搅拌3h挥去乙醇得到粒径为190nm的纳米粒，包封率为79.82％，载药量为18.57％。此盐酸特比萘芬纳米粒经透皮给药后，可用于治疗由真菌引起的皮肤感染。

实施例14

将阿米卡星10mg和玉米醇溶蛋白30mg溶于3ml体积分数为65％乙醇溶液中，40mg氢化大豆卵磷脂溶于1ml乙醇中，分别于40℃孵育0.5h，两溶液混合后继续孵育1h，最后在1000rpm磁力搅拌下将混合溶液快速分散于30ml纯水中，常温下搅拌3h挥去乙醇得到粒径为218nm的纳米粒，包封率为64.70％，载药量为8.46％。此阿米卡星纳米粒经透皮给药后，可用于治疗球菌感染性皮肤病，如常见的有脓疱疮、毛囊炎、疖、丹毒、蜂窝织炎等。

实施例15

将隐丹参酮30mg和玉米醇溶蛋白30mg溶于4ml体积分数为70％乙醇溶液中，40mg氢化大豆卵磷脂溶于1ml乙醇中，分别于40℃孵育0.5h，两溶液混合后继续孵育1h，最后在1000rpm磁力搅拌下将混合溶液快速分散于30ml纯水中，常温下搅拌3h挥去乙醇得到粒径为186nm的纳米粒，包封率为76.61％，载药量为24.72％。此隐丹参酮纳米粒经透皮给药后，可用于治疗由金黄色葡萄球菌及绿脓杆菌引起的感染性皮肤病。

实施例16

将西咪替丁20mg和玉米醇溶蛋白30mg溶于2ml体积分数为80％乙醇溶液中，40mg蛋黄卵磷脂溶于1ml乙醇中，分别于40℃孵育0.5h，两溶液混合后继续孵育1h，最后在1000rpm磁力搅拌下将混合溶液快速分散于30ml纯水中，常温下搅拌3h挥去乙醇得到粒径为185nm的纳米粒，包封率为84.45％，载药量为19.62％。此西咪替丁纳米粒经透皮给药后，可用于治疗带状疱疹、水痘、扁平疣等病毒性皮肤病。

实施例17

将克拉霉素丁5mg和玉米醇溶蛋白20mg溶于4ml体积分数为80％乙醇溶液中，10mg蛋黄卵磷脂、10mg二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱和5mg二硬酯酰磷脂酰胆碱溶于3ml乙醇中，分别于40℃孵育0.5h，两溶液混合后继续孵育1h，最后在1000rpm磁力搅拌下将混合溶液快速分散于30ml纯水中，常温下搅拌3h挥去乙醇得到粒径为231nm的纳米粒，包封率为72.82％，载药量为7.49％。此克拉霉素纳米粒经透皮给药后，可用于治疗幽门螺杆菌、链球菌属、肺炎球菌、葡萄球菌相关性皮肤病。

实施例18

将环孢菌素20mg和玉米醇溶蛋白30mg溶于3ml体积分数为80％乙醇溶液中，20mg大豆卵磷脂和5mg二油酰磷脂酰胆碱溶于2ml乙醇中，分别于40℃孵育0.5h，两溶液混合后继续孵育1h，最后在1000rpm磁力搅拌下将混合溶液快速分散于30ml纯水中，常温下搅拌3h挥去乙醇得到粒径为181nm的纳米粒，包封率为69.67％，载药量为20.21％。此环孢菌素纳米粒经透皮给药后，可用于治疗还可用于治疗牛皮癣、严重遗传性皮肤炎、坏疽性脓皮病、慢性自体免疫荨麻疹、类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮等相关疾病。

实施例19：体外渗透实验

取balb/c裸小鼠背部皮肤，去除脂肪、肌肉、黏膜等组织后，平整置于franz透皮扩散仪扩散池的结合部，角质层面向供给池，另一层面向接受池，水浴温度37℃。用30％乙醇-生理盐水溶液作为接收液，供给池内分别加入实施例4纳米粒样品及同浓度含药混悬液对照品(对照品制备方法，除不加玉米醇溶蛋白和磷脂外，其他步骤与实施例4的样品制备方法相同)1ml，上方用保鲜膜封闭，接收池用聚四氟乙烯搅拌子搅拌，转速400r/min，0.5，1，2，4，6，8，12，24h抽取接受液0.5ml，同时补充相同体积等温的接收溶液。hplc进样测定其中透过药物量，计算出累计透过量(qn)。每组平行操作3份。

表1实施例4样品溶液及其混悬对照溶液的平均累积透皮量(μg·cm^-2，x±sd,n＝3)

表1结果显示，实施例4纳米溶液的累计渗透量是其混悬对照液的2.57倍，说明此纳米制剂可以有效增强活性成分在皮肤的渗透性。

实施例20：离体滞留实验

取balb/c裸小鼠背部皮肤，去除脂肪、肌肉、黏膜等组织后，平铺于培养皿中，32℃水浴。皮肤表面给予实施例4纳米粒样品及同浓度含药混悬液对照品(对照品制备方法，除不加玉米醇溶蛋白和磷脂外，其他步骤与实施例4的样品制备方法相同)1ml，于1.0、2.0、6.0、8.0h取出组织，清洗干净，称重，加入甲醇溶液5ml匀浆，离心，取上清液经hplc检测药物浓度，计算平均滞留量。每组平行操作3份。

表2实施例4样品溶液及其混悬对照溶液的平均滞留量(μg·cm^-2，x±sd,n＝3)

表2结果显示，实施例4纳米溶液的滞留量远高于其混悬对照液，说明此纳米制剂可以有效延长活性成分在皮肤内的滞留时间。

实施例21：刺激性实验

取体重(2.0±0.2)kg的健康家兔若干，随机分为16组，n＝6。于实验前24h将家兔背部皮肤两侧去毛，去毛后24h检查去毛皮肤确保无受伤情况，在其背部划出5×5cm²的实验区域。每组分别于实验区域涂抹空白乳膏组和实施例4-18与空白乳膏1:1体积比复配组，每天涂抹三次，连续涂抹7天。空白乳膏制备方法为：将油相成分单硬脂酸甘油酯6g、白凡士林2g、液体石蜡10g和水相成分聚山梨酯-800.4g、尼泊金乙酯0.04g、蒸馏水25g分别加热至80℃，搅拌下将水相缓缓加入油相中，恒温搅匀几分钟，在室温下搅拌至冷凝，即得。

表3实施例4-18及空白对照皮肤刺激性结果

“+”表示家兔皮肤充血、红肿；“++”表示充血、红肿现象仍在，并有增加趋势；“-”表示无充血、红肿现象。

表3结果显示，本发明实施例4-18分别与空白乳膏1:1复配的样品涂抹于家兔皮肤无充血、红肿现象，表明实施实施例4-18均无皮肤刺激性。

实施例22：保湿效果评价实验

取体重(20±2)g的balb/c裸小鼠若干置于温度为22～24℃，湿度为50％～60％的室内，随机分为3组，n＝6，在其背部划出4×4cm²的实验区域。于恒定环境中30min后，使用皮肤水分测试仪comeometercm825检测每个实验部位，分别重复5次，得出其平均值。之后在实验区域分别均匀涂抹空白乳膏组，实施例5对照混悬液与空白乳膏1:1体积比复配组，和实施例5与空白乳膏1:1体积比复配组0.2g。实施例5对照混悬液制备方法，除不加玉米醇溶蛋白和磷脂外，其他步骤与实施例5的样品制备方法相同。空白乳膏制备方法为：将油相成分单硬脂酸甘油酯6g、白凡士林2g、液体石蜡10g和水相成分聚山梨酯-800.4g、尼泊金乙酯0.04g、蒸馏水25g分别加热至80℃，搅拌下将水相缓缓加入油相中，恒温搅匀几分钟，在室温下搅拌至冷凝，即得。在涂抹后即刻、15min、30min、45min、60min、75min、90min、和120min使用comeometercm825再次分别检测。将每次检测的平均值减去涂抹前的平均值即为该时段该部位的测定值。其结果通过设定的湿度测量值(moisturemeasurementvalue，mmv)来表示。mmv为0～150的数值。

表4实施例5及其对照保湿效果结果

表4结果显示，实施例5与空白乳膏1:1复配组的保湿效果明显好于空白乳膏组和实施例5对照混悬液与空白乳膏1:1复配组，说明此纳米制剂可以有效增强人表皮生长因子的保湿性能。