一种叶酸-蒜酶缀合物及其制备方法与流程

本发明涉及有机合成技术领域，尤其涉及一种叶酸-蒜酶缀合物及其制备方法。

背景技术：

大蒜是多年生百合科葱属植物蒜(alliumsativuml.)的地下鳞茎，具有悠久的医药和食品历史。大蒜的化学成分主要包括含硫有机化合物和皂苷类，含硫有机化合物是大蒜重要的活性物质，主要是蒜氨酸和大蒜辣素。蒜酶(alliinase)是大蒜中一种二聚体糖蛋白，可催化合成具有多种生物活性的大蒜辣素。

叶酸受体是一种肿瘤相关蛋白，它可以通过内吞摄入叶酸以及叶酸衍生物。叶酸受体在超过90％的卵巢癌、肾癌、肺癌和乳腺癌以及其他妇科癌症中均高度表达，而在正常组织中的表达高度保守。叶酸的缺乏可以导致乳腺癌、卵巢癌等人体肿瘤的发生。叶酸受体(folatereceptors，fr)是目前研究较热的靶点之一，具有较高的组织特异性，能与叶酸特异性结合。叶酸是一种配体，能够靶向共价结合的生物活性物质。利用叶酸作为药物载体与药物结合的靶向给药系统正倍受关注。研究发现，叶酸受体主要是识别叶酸中的蝶酸部分，谷氨酸残基对受体识别的影响不大，所以载体部分可以看做是叶酸中的蝶酸，利用谷氨酸与药物键合形成叶酸-药物缀合物。

目前，现有技术中以叶酸作为载体的缀合物的种类还很少。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种叶酸-蒜酶缀合物，拓展叶酸缀合物的种类。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种叶酸-蒜酶缀合物，其结构式如式ⅰ所示：

本发明提供了一种所述叶酸-蒜酶缀合物的制备方法，包含如下步骤：

(1)将叶酸溶于磷酸盐缓冲液中得到叶酸溶液；

(2)将所述叶酸溶液和碳二亚胺盐酸盐混合进行加成反应，得到加成产物体系；

(3)将蒜酶溶于磷酸盐缓冲液中得到蒜酶溶液；

(4)将所述加成产物体系和所述蒜酶溶液混合进行酰胺化反应，生成叶酸-蒜酶缀合物；

步骤(1)～(2)和步骤(3)无先后顺序限制。

优选的，所述步骤(1)和步骤(3)中的磷酸盐缓冲液的ph值独立地为7～8；

所述步骤(1)中叶酸的质量和磷酸盐缓冲液的体积之比为(20～40)mg:(1～5)ml；

所述步骤(3)中蒜酶的质量和磷酸盐缓冲液的体积之比为(140～160)mg:(8～12)ml；

所述步骤(1)中叶酸和步骤(3)中蒜酶的质量比为(20～40):(140～160)。

优选的，所述步骤(2)中碳二亚胺盐酸盐和步骤(1)中叶酸的质量比为(70～80):(20～40)；

所述加成反应在室温下进行，时间为20～40min。

优选的，所述步骤(4)中酰胺化反应在室温下进行，时间为1～3h。

本发明提供了另外一种所述叶酸-蒜酶缀合物的制备方法，包含如下步骤：

(1)将叶酸溶于磷酸盐缓冲液中得到叶酸溶液；

(2)将所述叶酸溶液、碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺混合进行反应，得到产物体系；

(3)将蒜酶溶于磷酸盐缓冲液中得到蒜酶溶液；

(4)将所述产物体系和所述蒜酶溶液混合进行酰胺化反应，生成叶酸-蒜酶缀合物；

步骤(1)～(2)和步骤(3)无先后顺序限制。

优选的，所述步骤(1)中磷酸盐缓冲液的ph值为6～7；

所述步骤(3)中的磷酸盐缓冲液的ph值为7～8；

所述步骤(1)中叶酸的质量和磷酸盐缓冲液的体积之比为(20～40)mg:(1～5)ml；

所述步骤(3)中蒜酶的质量和磷酸盐缓冲液的体积之比为(140～160)mg:(8～12)ml；

所述步骤(1)中叶酸和步骤(3)中蒜酶的质量比为(20～40):(140～160)。

优选的，所述步骤(2)中碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺和步骤(1)中叶酸的质量比为(70～80):(70～80):(20～40)；

所述反应在室温下进行，时间为20～40min。

优选的，所述步骤(4)中酰胺化反应在室温下进行，时间为1～3h。

本发明提供了一种叶酸-蒜酶缀合物和两种制备所述叶酸-蒜酶缀合物的方法。本发明将叶酸溶于磷酸盐缓冲液中得到叶酸溶液；将所述叶酸溶液和碳二亚胺盐酸盐混合进行加成反应，得到加成产物体系；将蒜酶溶于磷酸盐缓冲液中得到蒜酶溶液；将所述加成产物体系和所述蒜酶溶液混合进行酰胺化反应，生成叶酸-蒜酶缀合物。或者将叶酸溶于磷酸盐缓冲液中得到叶酸溶液；将所述叶酸溶液、碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺混合进行反应，得到产物体系；将蒜酶溶于磷酸盐缓冲液中得到蒜酶溶液；将所述产物体系和所述蒜酶溶液混合进行酰胺化反应，生成叶酸-蒜酶缀合物。本发明以叶酸作为蒜酶载体，分别采用碳二亚胺活化法、碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺联用活化法来合成一种新的叶酸类缀合物——叶酸-蒜酶缀合物。根据实施例结果可知，本发明能够成功制备叶酸-蒜酶缀合物，且所得叶酸-蒜酶缀合物的靶向性良好，能够与肿瘤细胞结合；所述叶酸-蒜酶缀合物在体外条件下对靶细胞具有良好的特异性识别功能。

附图说明

图1为实施例1所用原料和所得叶酸-蒜酶缀合物的紫外光谱图；

图2为实施例2所用原料和所得叶酸-蒜酶缀合物的紫外光谱图；

图3.1为实施例2所用叶酸的红外光谱图；

图3.2为实施例2所用蒜酶的红外光谱图；

图3.3为实施例2所得叶酸-蒜酶缀合物的红外光谱图；

图4为实施例2所得叶酸-蒜酶缀合物的凝胶电泳图谱；

图5为实施例2所得叶酸-蒜酶缀合物倒置荧光显微镜图(a明场；b蓝光；c绿光)；

图6为实施例2所得叶酸-蒜酶缀合物的流式细胞图。

具体实施方式

本发明提供了一种叶酸-蒜酶缀合物，其结构式如式ⅰ所示：

在本发明中，alliinase-nh2代表蒜酶分子，alliinase-代表蒜酶中除去-nh2的部分。

本发明提供了一种所述叶酸-蒜酶缀合物的制备方法，包含如下步骤：

(1)将叶酸溶于磷酸盐缓冲液中得到叶酸溶液；

(2)将所述叶酸溶液和碳二亚胺盐酸盐混合进行加成反应，得到加成产物体系；

(3)将蒜酶溶于磷酸盐缓冲液中得到蒜酶溶液；

(4)将所述加成产物体系和所述蒜酶溶液混合进行酰胺化反应，生成叶酸-蒜酶缀合物；

步骤(1)～(2)和步骤(3)无先后顺序限制。

本发明将叶酸溶于磷酸盐缓冲液中得到叶酸溶液；本发明优选将叶酸溶于磷酸盐缓冲液后进行磁力搅拌，得到充分溶解的叶酸溶液。在本发明中，所述磷酸盐缓冲液的ph值优选为7～8，更优选为7.4～7.6；所述叶酸的质量和磷酸盐缓冲液的体积之比优选为(20～40)mg:(1～5)ml，更优选为(30～35)mg:(2～3)ml；所述磁力搅拌的速率优选为400～600rpm，更优选为500～550rpm；所述磁力搅拌的时间优选为10～30min，更优选为20～25min。

得到叶酸溶液后，本发明将所述叶酸溶液和碳二亚胺盐酸盐混合进行加成反应，得到加成产物体系。

在本发明中，在叶酸核心支架上只有某些确定的位置可以附着在其余的缀合物上，而不损害叶酸受体的高结合强度，其中端羧基证明是最有利的；叶酸端羧基中的氧原子具有孤对电子，易进攻碳二亚胺盐酸盐的共轭双键，形成相对稳定的-n＝c-nh-，进而形成加成产物；叶酸和碳二亚胺盐酸盐的反应过程如式(1)所示：

在本发明中，所述步骤(2)中碳二亚胺盐酸盐和步骤(1)中叶酸的质量比优选为(70～80):(20～40)，更优选为(74～76):(30～35)；所述加成反应在室温下进行，时间优选为20～40min，更优选为30～35min。在本发明中，所述加成反应优选在磁力搅拌条件下进行，所述磁力搅拌的速率优选为400～600rpm，更优选为500～550rpm。

本发明将蒜酶溶于磷酸盐缓冲液中得到蒜酶溶液。本发明优选将蒜酶溶于磷酸盐缓冲液后进行涡旋，得到充分溶解的蒜酶溶液。在本发明中，所述磷酸盐缓冲液的ph值优选为7～8，更优选为7.4～7.6；所述蒜酶的质量和磷酸盐缓冲液的体积之比优选为(140～160)mg:(8～12)ml，更优选为(150～155)mg:(10～11)ml；所述涡旋的速率优选为2500～3500r/min，更优选为2800～3000r/min；所述涡旋的时间优选为1～3min，更优选为2min。本发明采用涡旋手段就加速蒜酶的溶解，对蒜酶的活力影响较小。

在本发明中，所述步骤(1)中叶酸和步骤(3)中蒜酶的质量比优选为(20～40):(140～160)，更优选为(30～35):(150～155)。

本发明将所述加成产物体系和所述蒜酶溶液混合进行酰胺化反应，生成叶酸-蒜酶缀合物。

在本发明中，所述酰胺化反应如式(2)所示：

在本发明中，所述步骤(4)中酰胺化反应在室温下进行，时间优选为1～3h，更优选为2h。在本发明中，所述酰胺化反应优选在磁力搅拌条件下进行，所述磁力搅拌的速率优选为400～600rpm，更优选为500～550rpm。

所述酰胺化反应结束后，本发明优选将得到的产物体系转移至分子量为3500的透析袋中，用蒸馏水做透析液进行透析，在透析过程中每隔4h更换一次透析液，共透析72h。透析结束后，本发明优选收集透析袋中的溶液，用ph值为7.4的pbs溶液定容，-4℃下保存。

本发明还提供了所述叶酸-蒜酶缀合物的另外一种制备方法，包含如下步骤：

(1)将叶酸溶于磷酸盐缓冲液中得到叶酸溶液；

(2)将所述叶酸溶液、碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺混合进行反应，得到产物体系；

(3)将蒜酶溶于磷酸盐缓冲液中得到蒜酶溶液；

(4)将所述产物体系和所述蒜酶溶液混合进行酰胺化反应，生成叶酸-蒜酶缀合物；

步骤(1)～(2)和步骤(3)无先后顺序限制。

本发明将叶酸溶于磷酸盐缓冲液中得到叶酸溶液；本发明优选将叶酸溶于磷酸盐缓冲液后进行磁力搅拌，得到充分溶解的叶酸溶液。在本发明中，所述磷酸盐缓冲液的ph值优选为6～7，更优选为6.5；所述叶酸的质量和磷酸盐缓冲液的体积之比优选为(20～40)mg:(1～5)ml，更优选为(30～35)mg:(2～3)ml；所述磁力搅拌的速率优选为400～600rpm，更优选为500～550rpm；所述磁力搅拌的时间优选为10～30min，更优选为20～25min。

得到叶酸溶液后，本发明将所述叶酸溶液、碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺混合进行反应，得到产物体系。

在本发明中，所述反应具体为叶酸先和碳二亚胺盐酸盐(edc·hcl)发生加成反应，生成的中间体再与n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)进行取代反应。其中，所述加成反应如上文所述式(1)所示，在此不再进行赘述；所述取代反应如式(3)所示，本方法所得的fa-alliinase的偶联比(偶联比是指一个蒜酶成功偶联叶酸的个数，偶联比越高，产物的靶向性越好)更高。

在本发明中，所述步骤(2)中碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺和步骤(1)中叶酸的质量比为(70～80):(70～80):(20～40)，更优选为(74～76):(74～76):(30～35)；所述反应在室温下进行，时间优选为20～40min，更优选为30～35min。在本发明中，所述反应优选在磁力搅拌条件下进行，所述磁力搅拌的速率优选为400～600rpm，更优选为500～550rpm。

本发明将蒜酶溶于磷酸盐缓冲液中得到蒜酶溶液。本发明优选将蒜酶溶于磷酸盐缓冲液后进行涡旋，得到充分溶解的蒜酶溶液。在本发明中，所述磷酸盐缓冲液的ph值优选为7～8，更优选为7.4～7.6；所述蒜酶的质量和磷酸盐缓冲液的体积之比优选为(140～160)mg:(8～12)ml，更优选为(150～155)mg:(10～11)ml；所述涡旋的速率优选为2500～3500r/min，更优选为2800～3000r/min；所述涡旋的时间优选为1～3min，更优选为2min。本发明采用涡旋手段就加速蒜酶的溶解，对蒜酶的活力影响较小。

在本发明中，所述步骤(1)中叶酸和步骤(3)中蒜酶的质量比优选为(20～40):(140～160)，更优选为(30～35):(150～155)。

本发明将所述产物体系和所述蒜酶溶液混合进行酰胺化反应，生成叶酸-蒜酶缀合物。

在本发明中，所述酰胺化反应如式(4)所示：

在本发明中，所述步骤(4)中酰胺化反应在室温下进行，时间优选为1～3h，更优选为2h。在本发明中，所述酰胺化反应优选在磁力搅拌条件下进行，所述磁力搅拌的速率优选为400～600rpm，更优选为500～550rpm。

所述酰胺化反应结束后，本发明优选将得到的产物体系转移至10kda的超滤离子管中，以8000rpm，4℃的条件超滤离心5min，收集沉淀用超纯水复溶三次，最后收集沉淀即为目标产品。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

仪器与试剂

gl-5250a磁力搅拌器(江苏其林贝儿仪器制造有限公司)；

ab135-s分析天平(mettlertoledo集团)；

紫外风光光度计(uv2550，日本岛津)；

叶酸(美国sigma，纯度99.8％)；

碳二亚胺盐酸盐(edc·hcl，北京西亚试剂有限公司)；

蒜酶供试品(20091001，新疆埃乐欣药业提供)。

实施例1

称取蒜酶150.00mg，用10mlph7.4的pbs溶液以3000r·min^-1的速率涡旋2min溶解成15mg·ml^-1的蒜酶溶液。

称取叶酸30.00mg溶于3mlph7.4的pbs溶液中磁力搅拌(500rpm，20min)至叶酸完全溶解，得到叶酸溶液。向所得叶酸溶液中加入74.00mgedc·hcl室温磁力搅拌(500rpm，30min)进行加成反应。反应结束后向体系中加入上述所得15mg·ml^-1的蒜酶溶液，室温磁力搅拌反应(500rpm，2h)即得叶酸-蒜酶缀合物(fa-alliinase)粗品。

该反应结束后，将反应物转移到分子量为3500的透析袋中，用蒸馏水做透析液，每隔4h更换一次透析液，透析3天。收集透析袋中溶液，ph7.4的pbs溶液定容至50ml，-4℃保存。

本实施例所用原料和所得叶酸-蒜酶缀合物的紫外光谱图如图1所示。由图1可知，叶酸(fa)在214nm、280nm、344nm有紫外吸收，最大吸收峰在280nm。edc(也即edc·hcl)在214nm有特征吸收，而在280nm、344nm没有紫外吸收。蒜酶在265nm有紫外吸收。因此若叶酸与蒜酶成功键合，则fa-alliinase应在280nm、344nm有紫外吸收，且紫外吸收值小于fa在280nm、344nm的吸收值。因为不同浓度的fa溶液，在280nm、344nm处吸收值的比值(a280/a344)为一定值，因此不同浓度的fa-alliinase溶液的a280/a344也是一个定值。所以可以通过计算fa-alliinase合成产物与原料的a280/a344的比值判断fa是否与alliinase键合。

当控制所有体系浓度与反应体系一致时，fa、edc、alliinase单纯混合组a280/a344为3.54，fa-alliinase的a280/a344为1.89。alliinase在344nm无紫外吸收，由此可知fa-alliinase在344nm的吸收值来源于fa，由此推断fa已与alliinase键合。

实施例2

称取蒜酶150.00mg，用10mlph7.4的pbs溶液以3000r·min^-1的速率涡旋2min溶解成15mg·ml^-1的蒜酶溶液。

称取叶酸30mg溶于3mlph6.5的磷酸缓冲液(pbs)中磁力搅拌20min(500rpm)至叶酸完全溶解，得到叶酸溶液。向所得叶酸溶液中加入加入74.00mgedc·hcl、74.00mgnhs室温磁力搅拌反应(500rpm,30min)。反应结束后加入15mg·ml^-1的蒜酶溶液，室温磁力搅拌反应(500rpm,2h)即得叶酸-蒜酶缀合物粗品。

反应结束后，将反应物转移到10kda的超滤离心管中，8000rpm，4℃超滤离心5min，收集沉淀用超纯水复溶离心三次，最后收集沉淀复溶至13ml得到fa-alliinase溶液，保存。

本实施例所用原料和所得叶酸-蒜酶缀合物的紫外光谱图如图2所示。由图2可知，fa在282nm、353nm为紫外吸收峰值，最大吸收峰在282nm。蒜酶的最大吸收波长在263nm，fa-alliinase的最大吸收波长为0.57。若叶酸与蒜酶键合成功，则fa-alliinase应在282nm、353nm处有紫外吸收，且紫外吸收值小于fa在282nm、353nm处的吸收值。在相同的稀释倍数情况下，叶酸、蒜酶、叶酸-蒜酶缀合物、叶酸和蒜酶无交联剂的物理性混合的紫外吸收曲线比较有明显的变化，表明缀合物合成成功。

本实施例所用叶酸的红外光谱图如图3所示。由图3可知，3549cm^-1与-nh2的伸缩振动相符，表明结构中含有-nh2；3410cm^-1、3321cm^-1与-nh的伸缩振动相符，表明结构中含有-nh；3116cm^-1的弱尖吸收峰为-cooh的伸缩振动；1693cm^-1为-nh(伯酰胺)的伸缩振动；1604cm^-1的吸收峰为苯环骨架和-c＝n的伸缩振动。与叶酸的红外光谱标准谱图一致。

图3.2为实施例2所用蒜酶的红外光谱图；图3.3为实施例2所得叶酸-蒜酶缀合物的红外光谱图。从fa-alliinase的红外图谱解析可知，fa-alliinase谱带在3400～1800cm^-1之间与蒜酶相似。fa-alliinase与蒜酶均在3300cm^-1处有一个强宽吸收峰，在2800～1800cm^-1没有吸收峰。但是fa-alliinase的谱带与alliinase谱带相比在3286cm^-1有-nh2吸收峰；1636cm^-1出现-nh(伯酰胺)的伸缩振动；1600～1500cm^-1左右出现苯环骨架的c＝c的吸收峰以及c＝n双键的吸收峰。由此可知，叶酸已与蒜酶键合。

本实施例所得叶酸-蒜酶缀合物的凝胶电泳图谱如图4所示。图4中，s:蒜酶蛋白条带；a：fa-alliinase缀合物蛋白条带。

将图4导入gel-proanalyzer软件，设置彩色预染蛋白marker为标准，得fa-alliinase的rf值为0.338，alliinase的rf值为0.395，比移值相差0.057。从图4可看出fa-alliinase的条带与蒜酶条带相比滞后，原因是sds-page凝胶电泳法采用的是垂直板电泳，分子量越小，迁移速度越快，条带越靠近凝胶底部。分子量越大，迁移速度越慢，条带越靠后。蒜酶与叶酸键合后分子量有所增加，所以fa-alliinase的迁移速度比蒜酶慢，条带滞后。

叶酸-蒜酶缀合物对宫颈癌hela细胞的体外靶向性评价

取本实施例得到的叶酸-蒜酶缀合物4ml加入0.6ml1mg/ml的异硫氰酸荧光素(fitc)溶液，磁力搅拌12h，4℃，避光，即制得fitc标记的叶酸-蒜酶缀合物。

倒置荧光显微镜检测：

宫颈癌细胞hela表面高度表达叶酸受体，叶酸可以与叶酸受体特异性结合。采用倒置荧光显微镜可以观察到异硫氰酸荧光素(fitc)标记的叶酸-蒜酶缀合物与该细胞的结合，从而评价叶酸-蒜酶缀合物对肿瘤细胞的靶向识别作用。

取对数生长期的肿瘤细胞，弃去原培养液用3mlph＝7.4的缓冲盐溶液冲洗，洗去游离的死细胞，向培养瓶中加入0.5ml0.25％胰酶消化，无菌条件下加入3ml完全培养液终止消化，吹打至单个细胞悬液后接种于培养皿中，于37℃、5％co2，恒温细胞培养箱中培养24小时。弃去培养液，ph＝7.4的缓冲盐溶液洗涤3遍，另加入完全培养液1ml。向培养皿中滴加荧光物质fitc标记的叶酸-蒜酶缀合物30ul，于37℃、5％co2，恒温细胞培养箱中共培养6小时后，用pbs洗涤两遍，除去游离的死细胞和游离的荧光药物(消除干扰)，用浓度为4％的甲醛固定细胞(15min)，ph＝7.4的缓冲盐溶液洗3遍，然后以hoechst33342试剂复染色细胞核(5min)，ph＝7.4的缓冲盐溶液洗涤两次，用倒置荧光显微镜观察，结果如图5所示。

图5为实施例2所得叶酸-蒜酶缀合物倒置荧光显微镜图(a明场；b蓝光；c绿光)。如图所示，分别在明场、蓝光光源及绿光光源下观察给药后的细胞，明场下观察细胞形态；蓝色荧光为hoechest染色剂，用于定位细胞核；绿色荧光为fitc标记的叶酸-蒜酶缀合物。在荧光倒置显微镜视野上可以看到，靶向药物叶酸-蒜酶缀合物识别并结合到靶细胞表面的叶酸受体上，使细胞表面带有荧光，显示出绿色荧光，证明了叶酸-蒜酶缀合物的靶向性良好，叶酸-蒜酶缀合物已与肿瘤细胞结合。

流式细胞术检测：

宫颈癌细胞hela表面高度表达叶酸受体，叶酸可以与叶酸受体特异性结合。采用流式细胞仪可以检测异硫氰酸荧光素(fitc)标记的叶酸-蒜酶缀合物与该细胞的结合，细胞荧光强度与hela细胞所结合的叶酸-蒜酶缀合物的量呈正相关。通过流式实验考察细胞荧光强度。

分别取对数生长期的肿瘤细胞，接种于培养皿中培养24h。吸去培养基溶液后，用ph＝7.4的缓冲盐溶液洗3遍，另加入1.5ml完全培养液。向培养皿中加入30ulfitc标记的叶酸-蒜酶缀合物，于培养箱中孵育5h。孵育结束后，弃去培养液，加入2ml预冷的ph＝7.4的缓冲盐溶液终止摄取，再用pbs冲洗2遍。用0.5ml0.25％胰酶消化，无菌条件下加入2ml完全培养液终止消化，吹打至单个细胞悬液离心，1000rpm，5min。细胞用1mlpbs重悬，流式细胞仪检测荧光强度。以不加叶酸-蒜酶靶向药物的细胞作为空白对照，结果如图6所示。

图6为实施例2所得叶酸-蒜酶缀合物的流式细胞图，采用流式细胞仪测定荧光标记的叶酸-蒜酶缀合物对叶酸受体的识别功能。由图可知，与空白对照相比，荧光标记叶酸-蒜酶缀合物的荧光峰偏移，说明靶向药物叶酸-蒜酶缀合物识别并结合到靶细胞表面的叶酸受体上，使细胞表面带有荧光，出现了荧光峰偏移。说明叶酸-蒜酶缀合物在体外条件下对靶细胞具有良好的特异性识别功能。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。