基于H2-18抗体偶联药物盐酸阿霉素的ADC及其制备方法和应用与流程

本发明属于药物研发领域，具体涉及一种基于单克隆抗体h2-18偶联药物盐酸阿霉素的adc及其制备方法和应用。

背景技术：

胃癌是全球发病率最高的癌症之一，死亡率居恶性肿瘤的第二位，5年生存率在5％-20％。因多数胃癌早期并无明显症状，就诊时已处于进展期或者晚期，而传统的手术、放疗及化疗等方法疗效欠佳。因此，寻找更为有效的胃癌治疗方法迫在眉睫。经临床证实，20％～25％人胃癌中，存在her2的扩增与过度表达，其已成为不良临床病征的诱因，它使得肿瘤细胞更易复发或转移，无病生存期短，预后较差。her2是由位于染色体17q21，由her2基因编码的具有跨膜酪氨酸激酶(ptk)活性的跨膜糖蛋白，它为表皮生长因子受体(egfr)家族成员之一。鉴于her2在乳腺癌发病机制中地位和它作为已知药物作用细胞外受体靶点，her2被公认为是一个潜在的抗体治疗的候选靶向。dtssp是3,3'-dithiobis(sulfosuccinimidylpropionate)即3,3’-二硫双代(硫酸琥珀酰亚氨基丙酸酯)，分子式c14h14n2na2o14s4，是蛋白修饰交联剂，具有水溶性，可被还原剂剪切。dtssp是一种可切割的蛋白质交联剂，它的八个原子间隔臂中含有二硫键，dtssp是一种膜不渗透的同双官能团交联剂，它与胺(氨基)官能团反应。在ph值7-9范围内，这种反应对初级胺基团特别具有选择性，从而形成稳定的酰胺键。由于dtssp上磺酸盐基团的亲脂性，这种交联剂不渗透到细胞膜上，使dtssp在不干扰细胞间蛋白的情况下尤其适用于细胞表面的膜蛋白交联。

抗体偶联药物(adc，antibody-drugconjugates)是新一代抗体靶向治疗药物，主要用于癌症和肿瘤的治疗，目前已经成为一个开发热点，多个adc正处于不同的临床开发阶段。adc主要是通过在大分子抗体上偶联多个高毒性的小分子化合物，在发挥抗体高靶向特异性优势的同时，将小分子毒物也带入到靶组织周围，甚至靶细胞内，从而发挥更强的杀伤效应。相对于常规抗体而言，adc对肿瘤组织的杀伤作用获得了进一步的提高。同时关于偶联的方式和技术也具有了较大的发展，不但可以进行定点偶联，而且可以进行组合药物的偶联，进一步为抗her2抗体偶联药物的开发提供了技术支持。从结构上，adc药物由“弹头”药物(细胞毒药物)、抗体以及偶联抗体和药物的偶联链3部分组成，通过化学偶联的方法将细胞毒性药物连接到抗体蛋白上。得益于稳定结合子型的adc能够确切地将药物携带至细胞内，而在外周血和细胞表面很少降解；在同等给药剂量下，使用稳定型adc更像缓释剂一样能够长时间在体保持有效的杀伤浓度而不释放出多余的毒素，从而使得adc在抗肿瘤中具有更高效的杀伤效应和更小的不良反应。因此，抗体-药物偶联物(antibody-drugconjugates，adc)一定程度上既克服了抗体杀伤不足的同时，也明显降低了化疗药物对正常组织的毒副作用。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种新型的抗体偶联药物，来克服抗体杀伤不足以及化疗药物对正常组织的毒副作用的问题。

本发明的一个目的在于提供一种基于h2-18抗体偶联化疗药物盐酸阿霉素的adc。

本发明的另一个目的在于提供一种制备基于h2-18抗体偶联化疗药物盐酸阿霉素的adc方法。

本发明的再一个目的在于提供基于h2-18抗体偶联化疗药物盐酸阿霉素的adc的用途。

具体的技术方案提供如下：

本发明的一个技术方案是提供一种抗体偶联药物，其特征在于，所述抗体和药物通过交联剂连接。

优选地，所述抗体是h2-18。

优选地，所述抗体h2-18是经巯基化的抗体。

优选地，所述抗体h2-18的轻链序列如seqidno.1所示，所述抗体h2-18的重链序列如seqidno.2所示。

优选地，所述药物选自盐酸阿霉素、阿霉素或紫杉醇。

优选地，所述交联剂带有双硫键。

优选地，所述交联剂为硫酸琥珀酰亚氨基丙酸脂。

本发明的另一个技术方案是提供一种制备前面所述的抗体偶联药物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤一：将抗体用2-亚胺四氢噻吩(2-it)进行巯基化，得到巯基化的抗体；

步骤二：将药物与交联剂反应，得到带有双硫键的药物；

步骤三：将所述巯基化的抗体与所述带有双硫键的药物反应，得到抗体偶联药物。

优选地，在步骤一中，所述抗体与2-it的浓度比为2～5mg/ml，所述每个抗体巯基化后结合6-7个巯基。

优选地，在步骤二中，所述药物与交联剂的摩尔比为1：1。

本发明的又一个技术方案是提供一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含前面所述的抗体偶联药物。

本发明的再一个技术方案是前面所述的抗体偶联药物在制备用于抑制胃癌细胞n87生长的药物中的应用。

本发明的再一个技术方案是前面所述的抗体偶联药物在制备用于治疗与her2相关的疾病的药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下详细的技术手段：

所述的单克隆抗体的制备及其纯化方法包括以下步骤：

第一步：用293tgemedium无血清培养基培养293f细胞，并扩增；

第二步：待密度到达1.2-1.8×106个/ml，活率>95％时进行转染：将250μg线性的pei加入5ml的opti-mem混匀静置5min后加入已混匀静置的轻链重链质粒各50μg于5mlopti-mem中(每瓶)，振荡混匀静置15min(每瓶)，约10ml边摇晃边加入培养瓶中，转染24h后加10％feed-x补料；

第三步：约7-10天，收集转染上清离心，并用0.45um孔径滤膜过滤，用biologicduoflow纯化仪进行纯化。

所述的培养基均为293tgemedium无血清培养基。

所述的线性pei分子量为25000da。

所述转染所用的溶液均用0.45μm孔径滤膜过滤。

所述的单克隆抗体偶联盐酸阿霉素的制备方法包括以下步骤：

第一步：将抗体与2-it在ph＝7.4的pbs下反应，将抗体进行巯基化；

第二步：将化疗药物与带有双硫键的交联剂溶于二甲基亚砜后，室温避光反应48h，得到带有双硫键的化疗药物，所述的交联剂为硫酸琥珀酰亚氨基丙酸脂(dtssp)；

第三步：将已经巯基化的抗体用ph＝7.4的pbs稀释后，与已经带有双硫键的化疗药物的超纯水中反应，低速磁力搅拌器上室温反应4.5h，透析：用1l透析液、透析袋为mwco1000daltons通入n2，用保鲜膜密封，透析48h即可制得。

本发明以单克隆抗体、化疗药物为基本材料，通过交联剂将具有主动靶向的抗体与有脂溶性的化疗药物连接起来的adc，本发明的主要技术方案是：首先通过培养转染293f细胞，制备并纯化抗体；接着将盐酸阿霉素与带有双硫键的硫酸琥珀酰亚氨基丙酸脂(dtssp)反应生成带有双硫键的盐酸阿霉素化合物，将抗体与带有双硫键的盐酸阿霉素化合物进行反应。并由此取得了如下显著的技术进步：

1、本发明的抗体偶联化疗药物adc能够减少药物的使用剂量，从而降低药物对正常组织的杀伤，降低药物的毒副作用。

2、本发明的基于抗体偶联技术旨在利用h2-18抗体的靶向性和抗肿瘤药物盐酸阿霉素的抗癌性能，该体系不仅保留了单个h2-18抗体的靶向性和单独化疗药物对肿瘤的强杀伤性，也使大量的adm有效富集到肿瘤部位。

附图说明

图1是h2-18的sds-page电泳图谱。

图2是h2-18的粒径图。

图3是h2-18与帕妥珠单抗对n87细胞的流式检测图。

图4是h2-18的轻链序列(seqidno.1，上图)和重链序列(seqidno.2，下图)。

图5是抗体巯基化标准曲线图及检测原理图。

图6是adm标准曲线图。

图7是细胞毒性实验。

图8是adc体内抑瘤细胞效果示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式进行详细说明。下述实验中未注明具体条件的实验方法，按照常规实验方法和条件进行，本发明所用的试剂和仪器设备也是本领域技术人员熟知并可以在市场上购买得到。

实施例1.轻链和重链质粒的提取

无菌条件下，甘油菌和卡那霉素均按1:1000比例加入无菌lb培养基，37℃、转速250rpm进行旋转振荡过夜培养(培养时间不超过16小时)。6000g，15min，4℃离心收集菌液；用plasmidmidikit试剂盒提取质粒：6mlbufferp1重悬菌体；加6mlbufferp2颠倒4-6次充分混匀，室温(15-25℃)静置5min；加6mlbufferp3，立即充分混匀，颠倒4-6次，至完全变白；将裂解液加入20ml注射剂(带有qiafiltercartridge)，室温静置10min，不要插入注射皿内芯。平衡hispeedtip:加4mlbufferqbt通过重力作用使其流尽，将qiafiltercartridge下面的帽拧掉，将内芯缓慢插入注射器，将裂解液打入预先平衡的hispeedtip，让裂解液在重力下流下；用20mlbufferqc洗hispeedtip。用5mlbufferqf洗脱dna，前3-4滴不要接，后用15ml离心管接qf洗脱下来的dna，加入3.5ml(0.7倍体积)异丙醇，混均，静置5min；将20ml注射皿的内芯拔出，插上qiapreacipitatormidimodules，将洗脱dna/异丙醇加入注射皿中，插入内芯，用恒力将混合物推入qiapreacipitator，拔掉qiapreacipitator，拔出内芯，再插上qiapreacipitator，将2ml乙醇加入注射皿中，洗dna，拔掉qiapreacipitator，拔出内芯，再插上qiapreacipitator，尽量将乙醇除尽，重复一次，在吸水纸晾干qiapreacipitator，使乙醇挥发干净。将新的5ml注射皿的内芯拔出，插上qiapreacipitator，加1ml(600ul)bufferte至5ml注射皿中，插上内芯，再推至1.5mlep管中，用紫外分光光度计测定所提取质粒浓度，标记，并于-20℃保存以备后用。

实施例2.h2-18抗体的制备及纯化

从液氮罐中取出293f细胞，37℃水浴锅中快速摇晃融化；75％酒精喷拭擦洗冻存管，用约5ml的293tgemedium无血清培养基于15ml重悬细胞，离心1000rpm，4分钟。弃上清，剩余沉淀细胞用约10ml的293tgemedium无血清培养基进行重悬，移入30ml量程的三角培养瓶，在37℃恒温足够湿度的摇床旋转培养2天，countstar细胞仪对293f细胞密度及活率进行测定；若活率过低，可以将细胞悬液离心1000rpm，4分钟重新培养(刚复苏细胞活率一般不高，此步可快速提高细胞活率)。当细胞密度达到1.0-1.8×10⁶个/ml，细胞活率大于90％时，用新鲜培养液按1:3扩增培养；每天观察培养液颜色，并检测细胞密度及活率。countstar细胞仪计数293f细胞密度及活率。当细胞密度达1.2-1.8×10⁶个/ml，细胞活率大于95％时，适合转染。用0.22um孔径滤膜过滤前期保存的h2-18重轻链质粒及配制的pei溶液；h2-18的轻链、重链质粒各50μg加入5ml的opti-mem(每瓶量)中，混匀静置5min；250μg线性pei加入5ml的opti-mem中(每瓶量)，混匀静置5min后加至含有重轻链的opti-mem中，振荡混匀，室温避光静置15min；将混合液逐滴滴入90ml培养液中，边滴边摇晃细胞培养瓶(总体积约100ml)；24h后向培养液中加入10％补料feed-x；监测细胞密度及活率(如细胞不扩增，活率低应适当降低pei总量)。7-10天后收集细胞(此时细胞密度应大于6×10⁶个/ml，细胞活率大于50％)，超高速离心机4℃，8000rpm离心30分钟；收集上清于4℃冰箱短期保存，待进一步抗体纯化。293f细胞瞬时转染上清(冰上操作)和0.1mglycine-hcl(ph＝2.7)、1mtris-hcl(ph＝8.0)均用0.45um孔径滤膜过滤待用；biologicduoflow纯化仪开机自检后，先用双蒸水正向反向冲洗管道，排出系统内气泡，然后安装proteina亲和层析柱(层析柱内不得有气泡)；至少10个柱体积的pbs平衡液平衡整个纯化系统，打开biologicquadtecuv-visdetector，并调零；将过滤后的细胞上清放置于冰上，3ml/min速度上样；上样结束，用pbs平衡纯化系统至波线平稳；用0.1mglycine-hcl(ph＝2.7)溶液洗脱抗体，当开始出现洗脱峰时即收集洗脱液。边洗脱边用1mtris-hcl(ph＝8.0)溶液中和(中和不及时易导致抗体变性)，将ph调整至7.4(缓慢调整，过碱易导致抗体析出，且难再溶)；30kd超滤离心管置换洗脱液，3500rpm，离心30分钟；向超滤离心管v形槽中加入适量pbs，用100ul移液器吸取pbs并反复吹打v形槽壁。重复该步骤，直至将抗体置换至pbs溶液中，用0.22um孔径滤膜过滤，用紫外分光光度计测定抗体浓度，分装后置于-80℃长期保存；用pbs平衡纯化系统并关机。

实施例3.h2-18分子大小鉴定及粒径的测定

采用12％sds-page凝胶蛋白凝胶电泳及考马斯亮蓝染色对得到的h2-18抗体进行分子量大小和纯度的鉴定。在非还原的条件下，h2-18和trastuzumab呈现分子量大小介于130kd-250kd的清晰条带，无明显杂带(图1)。

利用动静态激光散射仪对已纯化的h2-18的粒子大小进行检测。取实施例2所制备的h2-18用超纯水(已过0.22um滤膜过滤)稀释浓度至20-100μg/ml，然后将样品吸入dls管中(约1ml)，丙酮润洗dls管表面，吹干后置于检测室内检测(如图2)。

实施例4.h2-18功能的检测

取指数生长期的n87细胞消化后重悬，计数并调整细胞密度为1.5×10⁵个/ml，每孔500ul于24孔板中，于37℃，5％co2培养箱中培养待细胞贴壁牢固后(15h左右)，弃去原有dmem培养基，用pbs洗2次，向孔板加入对应的含有培养基的药物，于37℃，5％co2培养箱中培养；药物作用24小时后，弃去原有dmem培养基，pbs洗一次，每孔加入150μl胰酶，轻轻晃动，让胰酶覆盖细胞表面，当细胞变圆、部分细胞开始脱落细胞壁时用dmem培养基终止消化；将细胞收集于已标记的流式管中，800rpm，离心5分钟，弃上清，用吸水纸轻轻蘸干流式管管口的液体，向流式管中加入500ul的pbs，重悬，800rpm，离心5分钟。弃上清，每管加入200μl新配的1×结合缓冲液，用移液枪枪头轻轻重悬细胞，加入5μlannexinv并轻轻重悬，室温避光孵育10分钟后，再加入5μlpi染料，室温避光孵育5分钟后置于冰盒，在半小时内facscalibur流式细胞仪进行检测并保存数据(图3)。

实施例5.巯基化h2-18的制备

取1mgh2-18和80μl2-it于提前通入n2的反应瓶中，放于磁力搅拌器上低速转动，室温避光2h(用锡纸包裹)。用移液器将反应后的混合液转入1000道尔顿的透析袋内，置于1l透析液内(ph＝7.4，1×pbs50ml，5mmedta50ml)，透析2h。

实施例6.抗体巯基化标准曲线

2-it(2-亚胺四氢噻吩)是一种偶联剂，可在具氨基的化合物上引入巯基，直接偶联。特点是在修饰蛋白(抗体)时保持了它的正电荷，这样不影响蛋白质构型，保持原有的生物活性。通过l-半胱氨酸标准液，配制梯度浓度，制作标准曲线。通过该氨基酸巯基化的量计算蛋白巯基化的量。dtnb为5,5′-二硫代双(2硝基苯甲酸)，即ellman试剂，在325nm处有特征吸收，与巯基硅烷化试剂或磁性微粒表面巯基反应后置换出硫硝基苯甲酸，简称tnb，微碱性条件下，tnb在412nm处呈强吸收峰，且与巯基浓度符合朗伯-比尔定律。

试剂的配置：

(1)用超纯水配制0.25m的tris-hcl(ph＝8.3)缓冲液。

(2)1mm的半胱氨酸(l-cys)标准液：准确称取0.012116gl-cys(wm＝121.16)先用1ml甲酸溶解，再用超纯水定容至100ml。

(3)配制10mm的dtnb贮存液，准确称取0.198175gdtnb(wm＝396.35)，用50mm的na2hpo4(ph＝7.0)配制成50ml溶液，避光低温保存备用。

(4)制备0.1mmdtnb分析液：将10mm的dtnb贮存液与0.25m的tris-hcl按1:99配制，避光4℃放置备用。

半胱氨酸标准曲线的制备：

(a)室温下，用0.25mtris-hcl(ph＝8.3)缓冲液稀释1mm的半胱氨酸(l-cys)标准液，配置成浓度为0.00mm、0.025mm、0.05mm、0.1mm、0.15mm、0.2mm各1ml。

(b)取上述配置好的浓度各50ul于标记好的的ep管中，各加入500μl的dntb分析液，吹打混匀，避光静止10min，于412nm处测定吸光度值。

(c)处理数据，即得到吸光度对半胱氨酸浓度的标准曲线，结果如图5显示，计算可得，一个抗体结合6个巯基，为后续的巯基化的抗体与dtssp反应提供条件。

实施例7.h2-18-adm的制备

取50μg/ml盐酸阿霉素1ml与交联剂30μg/ml1ml，于室温反应2h。将已经巯基化的抗体用超纯水稀释后，取0.5ml与已经带有双硫键的化疗药物反应，低速磁力搅拌器上室温反应2.5h，将反应后的溶液用移液枪吸入1000道尔顿中，于50ml透析液(超纯水)中透析12h，即制得adc。

实施例8.游离adm浓度的检测

对实施案例7制备得到的adc中adm浓度的检测。adm的紫外吸收峰在290nm，采用紫外分光光度计来检测adm浓度。用超纯水制备25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、125μg/ml的盐酸阿霉素，在290nm测定其吸收值，制备标准曲线。取100μl透析前的溶液，用超纯水稀释10倍，于290nm测定其吸收值。游离的阿霉素浓度为c(adm)＝[a(290)-0.0433]/0.014＝(0.1835-0433)/0.014＝1.02μg/ml，游离的阿霉素质量为m1＝c(adm)×10，故adc的浓度为c(adc)＝50μg/ml×1ml-m1＝40.8μg/ml。

实施例9.细胞毒性试验

将游离的抗体，游离的化疗药物及其制备的adc对细胞的毒性进行评价。取对数生长期的人胃癌细胞ncl-n87消化离心，按1×10⁵个/ml，每孔100μl于96孔板中，周围一圈每孔加100μlpbs，于37℃，5％co2培养约16小时。分别取游离的抗体，游离的化疗药物，以及制备好的adc加入96孔板，浓度分别为0.625、1.25、2.5、5μg/ml(每个浓度设置3复孔)与n87细胞共孵育36h。吸去旧的培养基，每孔加100μlcck8溶液(10倍稀释)设置3个单独cck8溶液的空白对照，于37℃，5％co2孵育0.5-2h，用酶标仪在450nm处读取96孔板中的吸光度值，对数据进行处理，计算细胞抑制率。

细胞抑制率计算公式：1-[(as-ab)/(ac-ab)]×100％

其中，as:实验孔的吸光度(含细胞、培养基、cck-8溶液和药物溶液)

ac:对照孔的吸光度(含细胞、培养基、cck-8溶液，不含药物)

ab:空白孔的吸光度(含培养基、cck-8溶液，不含细胞、药物)

实验结果如图显示：图7中表明，游离的抗体，游离的adm以及adc，随着药物浓度的增大，细胞的存活率逐渐降低。由此可见，adc对n87细胞的抑制效果要明显优于游离的抗体和游离的adm。

实施例10.体内抑瘤试验

扩增n87细胞，并取对数生长期的细胞，用提前预热的pbs洗一次。用含有0.25％含有edta的胰酶消化，用含有血清的dmem培养基终止消化，1000rpm，离心5min，用pbs调整细胞密度为1×10⁸个/ml，重悬置于冰上待用。接种于balb/c裸鼠右上背部皮下，1mlbd注射器抽取细胞悬液，每只裸鼠注射100μl，晚上小鼠比较活跃，选择上午进行注射。将荷瘤的balb/c裸鼠随机分为5组，每组4只，包括pbs对照组，游离的h2-18组(num-20组，10mg/kg)，游离的adm(包括阿霉素和紫杉醇两种市售药物5mg/kg)，h2-18-adm组(num-60)，药物注射后每天观察记录并观察并记录每组裸鼠的存活情况，活动情况，体重及肿瘤大小。肿瘤体积计算方法如下：

肿瘤体积计算公式：长×(宽)²/2

对balb/c裸鼠在药物注射20天后对全部balb/c裸鼠处死，取出瘤块，测量全部balb/c裸鼠的肿瘤的体积及质量，对数据进行统计处理。结果如图8显示，表明制备的h2-18-adm能实现对肿瘤组织的较好治疗。

该实验进一步证明本方法合成的抗体偶联物(h2-18-adm)得到提高于临床肿瘤的治疗。这些都得益于抗体靶向性并在肿瘤部位富集以及adm强烈的细胞毒性，使得其对肿瘤细胞的杀伤效果最好。adc药物(h2-18-adm)无疑是更具有市场前景的新型抗体-化疗复合治疗的药物剂型。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

序列表

<110>上海健康医学院

<120>基于h2-18抗体偶联药物盐酸阿霉素的adc及其制备方法和应用

<130>l18090163f

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1136

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gaacgacactttacataatgagttcgcattcttgttacttcacgcagcccgccgccctac60

ctgaggccgccatccacgccggttgagtcgcgttctgccgcctcccgcctgtggtgcctc120

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tgctcaactctagttaacggtggagggctctgtgggttcccaggtgctgaataattgacc300

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