一种累托石-甲壳素纳米凝胶复合止血材料及其制备方法与流程

本发明涉及一种累托石-甲壳素纳米凝胶复合止血材料及其制备方法，属于天然高分子领域，也属于化学、医学领域。
背景技术：
：不可控制的大出血是战争、车祸及其他意外事故死亡的主要原因。以沸石为原料的止血材料quikclot已经在战场上救活了成百上千人，然而由于沸石在止血的过程中会散发大量的热，容易对伤口造成二次伤害，这大大限制了quikclot的应用。商品化止血剂celox、combatgauze、hemcon、fastactseraseal等价格比较昂贵，不利于大规模使用。因此开发副作用低、廉价易得、止血效果好的止血材料是一个迫切需要解决的问题。甲壳素是地球上存在量仅次于纤维素的多糖，也是自然界中除蛋白质外数量最大的含氮天然有机高分子化合物。甲壳素具有良好的生物相容性，具有促进伤口愈合和止血的功能。研究表明甲壳素可以结合红细胞，同时比壳聚糖更能聚集血小板(y.okamoto,r.yano,k.miyatake,i.tomohiro,y.shigemasaands.minami,carbohydratepolymers,2003,53,337-342.)。目前的报道主要采用粒径较大的甲壳素粉，将甲壳素制备具有成纳米凝胶可增大其比表面积，在止血的过程中能够迅速吸收血液，更好地结合红细胞和聚集血小板，因此可以更好的发挥止血作用。但是，甲壳素纳米凝胶的止血速度并不理想。粘土类物质由于其表面的负电荷与可以与血浆蛋白结合，激活内源性凝血机制，从而具有良好的凝血效果，但单纯的粘土类物质如累托石具有一定的生物毒性，作为止血剂时生物安全性差(j.i.dawsonandr.o.oreffo,advancedmaterials,2013,25,4069-4086.)。技术实现要素：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种累托石-甲壳素纳米凝胶复合止血材料，既解决了单纯累托石毒性大的问题，又解决了累托石和甲壳素纳米凝胶止血速度慢的问题。本发明提供的技术方案具体如下：一种累托石-甲壳素纳米凝胶复合止血材料的制备方法，包括以下步骤：将甲壳素粉末加入含6～12wt％naoh、2～8wt％尿素的水溶液中，循环冷冻，得到溶解均一的甲壳素水溶液，其中，甲壳素的含量为0.5～10wt％；将累托石粉末均匀分散到甲壳素水溶液中，得到混悬液，甲壳素粉末与累托石粉末的重量比为1:1～3；然后用5000r/min以上的速度对上述混悬液进行搅拌，得到胶状乳液；所得胶状乳液在超纯水中透析至中性，最后冷冻干燥，即得到累托石-甲壳素纳米凝胶复合止血材料。优选地：naoh的含量为8wt％，尿素的含量为4wt％。循环冷冻的温度为-10～-40℃。循环冷冻的次数为2次及其以上。搅拌时间为5～90min。搅拌速度为6000～20000r/min。透析胶状乳液所用的透析纸的截留分子量为8000～14000。一种累托石-甲壳素纳米凝胶复合止血材料，由上述制备方法制备得到。本发明甲壳素粉末的原料来源可以是虾、蟹等甲壳动物及各类昆虫的表皮，也可以是乌贼、贝类等软体动物的骨骼以及菌类的细胞壁中的甲壳素的一种或几种。使用前经过已知技术的方法纯化，如酸处理除去钙盐、碱处理除去蛋白、氧化处理脱色等。本发明首先将甲壳素粉末在naoh和尿素体系中循环冷冻溶解得到甲壳素水溶液，然后在分散机高速搅拌的过程中由于体系温度的升高甲壳素水溶液中的分子链自组装形成聚集的纳米凝胶，同时由于高速剪切的作用使聚集的纳米凝胶分散均一。在高速的搅拌下可以使甲壳素与累托石粉末混合均匀，形成的甲壳素纳米凝胶通过氢键和电荷的作用紧密地黏附在累托石表面，制备形成均一、生物相容性良好的累托石-甲壳素纳米凝胶复合止血材料。本发明首次将甲壳素与累托石复合通过物理变化制备成纳米级别的凝胶，同时形成的甲壳素纳米凝胶通过氢键或者正负电荷的作用黏附在累托石的表面，使甲壳素与同样具有凝血作用的累托石紧密结合，形成无生物毒性的累托石-甲壳素纳米凝胶复合止血材料，且由于协同作用，当甲壳素粉末与累托石粉末的重量比为1:1～3时，累托石-甲壳素纳米凝胶复合止血材料的凝血速度比累托石和甲壳素凝胶都快，大大出乎本领域技术人员的意料，与商品化的止血剂celox相比，其止血速度远快于celox，具有很高的推广价值。本发明的制备方法反应条件温和，绿色环保，成本低廉，制备简单，并且可一次性大规模制备，在生物医用领域有广泛应用潜力。附图说明图1为累托石-甲壳素纳米凝胶复合止血材料的透射电镜图；其中，图1(a)为甲壳素/累托石重量比为1/1的样品4的透射电镜图，图1(b)为甲壳素/累托石重量比为3/1的样品5的透射电镜图。图2为表2的条状图。具体实施方式以下将通过实施例具体说明本发明的技术方案，但这些具体实施例不以任何方式限制本发明的保护范围。实施例1将2重量份甲壳素粉末加入到98重量份含8wt％naoh和4wt％尿素的水溶液中，在-30℃下循环冷冻2次，使其溶解为均一的甲壳素水溶液；用分散机以10000r/min的速度对甲壳素水溶液高速搅拌30min，得到胶状乳液；最后，将胶状乳液用截留分子量为8000-14000的透析纸在超纯水中透析6天至中性，最后冷冻干燥，得到甲壳素纳米凝胶材料，即样品8。实施例2将2重量份甲壳素粉末加入到92重量份含8wt％naoh和4wt％尿素的水溶液中，在-30℃下循环冷冻2次使其溶解为均一的甲壳素水溶液，将6重量份累托石粉末均匀分散到甲壳素水溶液中得到混悬液；用分散机以10000r/min的速度对混悬液高速搅拌30min，得到胶状乳液；最后，将胶状乳液用截留分子量为8000-14000的透析纸在超纯水中透析6天至中性，最后冷冻干燥，即可得到甲壳素/累托石重量比为1/3的的累托石-甲壳素纳米凝胶复合止血材料，即样品2。实施例3将2重量份甲壳素粉末加入到94重量份含8wt％naoh和4wt％尿素的水溶液中，在-30℃下循环冷冻2次使其溶解为均一的甲壳素水溶液；将4重量份累托石粉末均匀分散到甲壳素水溶液中得到混悬液；用分散机以10000r/min的速度对混悬液高速搅拌30min，得到胶状乳液；最后，将胶状乳液用截留分子量为8000-14000的透析纸在超纯水中透析6天至中性，最后冷冻干燥，得到甲壳素/累托石重量比为1/2的的累托石-甲壳素纳米凝胶复合止血材料，即样品3。实施例4将2重量份甲壳素粉末加入到96重量份含8wt％naoh和4wt％尿素的水溶液中，在-30℃下循环冷冻2次使其溶解为均一的甲壳素水溶液；将2重量份累托石粉末均匀分散到甲壳素水溶液中得到混悬液；用分散机以10000r/min的速度对混悬液高速搅拌30min，得到胶状乳液；最后，将胶状乳液用截留分子量为8000-14000的透析纸在超纯水中透析6天至中性，最后冷冻干燥，得到甲壳素/累托石重量比为1/1的的累托石-甲壳素纳米凝胶复合止血材料，即样品4。实施例5将2重量份甲壳素粉末加入到97.33重量份含8wt％naoh和4wt％尿素的水溶液中，在-25℃下循环冷冻2次，使其溶解为均一的甲壳素水溶液；将0.67重量份累托石粉末均匀分散到甲壳素水溶液中，得到混悬液；用分散机以8000r/min的速度对混悬液高速搅拌30min，得到胶状乳液；最后，将胶状乳液用截留分子量为8000-14000的透析纸在超纯水中透析6天至中性，最后冷冻干燥，得到甲壳素/累托石重量比例为3/1的累托石-甲壳素纳米凝胶复合止血材料，即样品5。实施例6将2重量份甲壳素粉末加入到97.67重量份含8wt％naoh和4wt％尿素的水溶液中，在-30℃下循环冷冻2次，使其溶解为均一的甲壳素水溶液；将0.33重量份累托石粉末均匀分散到甲壳素水溶液中，得到混悬液；用分散机以10000r/min的速度对混悬液高速搅拌30min，得到胶状乳液；最后，将胶状乳液用截留分子量为8000-14000的透析纸在超纯水中透析6天至中性，最后冷冻干燥，得到甲壳素/累托石重量比为6/1的累托石-甲壳素纳米凝胶复合止血材料，即样品6。实施例7将2重量份甲壳素粉末加入到97.83重量份含8wt％naoh和4wt％尿素的水溶液中，在-30℃下循环冷冻2次，使其溶解为均一的甲壳素水溶液；将0.17重量份累托石粉末均匀分散到甲壳素水溶液中，得到混悬液；用分散机以10000r/min的速度对混悬液高速搅拌30min，得到胶状乳液；最后，将胶状乳液用截留分子量为8000-14000的透析纸在超纯水中透析6天至中性，最后冷冻干燥，得到甲壳素/累托石重量比为12/1的累托石-甲壳素纳米凝胶复合止血材料，即样品7。实施例8将2重量份甲壳素粉末加入到96重量份含8wt％naoh和5wt％尿素的水溶液中，在-30℃下循环冷冻2次使其溶解为均一的甲壳素水溶液；将2重量份沸石粉末均匀分散到甲壳素水溶液中得到混悬液；用分散机以12000r/min的速度对混悬液高速搅拌30min，得到胶状乳液；最后，将胶状乳液用截留分子量为8000-14000的透析纸在超纯水中透析6天至中性，最后冷冻干燥，得到甲壳素/沸石比例为1/1的沸石-甲壳素纳米凝胶复合止血材料，即样品10。实施例9将2重量份甲壳素粉末加入到96重量份含10wt％naoh和3wt％的尿素的水溶液中，在-30℃下循环冷冻2次使其溶解为均一的甲壳素水溶液；将2重量份蒙脱石粉末均匀分散到甲壳素水溶液中得到混悬液；用分散机以10000r/min的速度对混悬液高速搅拌30min，得到胶状乳液；最后，将胶状乳液用截留分子量为8000-14000的透析纸在超纯水中透析6天至中性，最后冷冻干燥，即可得到甲壳素/蒙脱石的比例为1/1的蒙脱石-甲壳素纳米凝胶复合止血材料，即样品11。实施例10将2重量份甲壳素粉末加入到96重量份含8wt％naoh和4wt％尿素的水溶液中，在-30℃下循环冷冻2次使其溶解为均一的甲壳素水溶液；将2重量份膨润土粉末均匀分散到甲壳素水溶液中得到混悬液；用分散机以10000r/min的速度对混悬液高速搅拌30min，得到胶状乳液；最后，将胶状乳液用截留分子量为8000-14000的透析纸在超纯水中透析6天至中性，最后冷冻干燥，得到甲壳素/膨润土比例为1/1的膨润土-甲壳素纳米凝胶复合止血材料，即样品12。实施例11将2重量份甲壳素粉末加入到96重量份含8wt％naoh和4wt％尿素的水溶液中，在-30℃下循环冷冻2次使其溶解为均一的甲壳素水溶液；将2重量份二氧化硅粉末均匀分散到甲壳素水溶液中得到混悬液；用分散机以15000r/min的速度对混悬液高速搅拌30min，得到胶状乳液；最后，将胶状乳液用截留分子量为8000-14000的透析纸在超纯水中透析6天至中性，最后冷冻干燥，得到甲壳素/二氧化硅重量比为1/1的二氧化硅-甲壳素纳米凝胶复合止血材料，即样品13。实施例12将2重量份甲壳素粉末加入到96重量份含8wt％naoh和4wt％尿素的水溶液中，在-30℃下循环冷冻2次使其溶解为均一的甲壳素水溶液；将2重量份高岭土粉末均匀分散到甲壳素水溶液中得到混悬液；用分散机以10000r/min的速度对混悬液高速搅拌20min，得到胶状乳液；最后用超纯水将胶状乳液抽滤至中性，最后冷冻干燥，得到甲壳素/高岭土重量比为1/1的高岭土-甲壳素纳米凝胶复合止血材料，即样品14。实施例13：毒性试验复合材料mtt体外细胞毒性实验是通过在材料表面或材料的浸提液中培养细胞来检测材料的细胞相容性情况。浸提液是依照iso标准，材料质量与浸提介质体积比为0.2g/ml，加入低糖dmem培养液(浸提介质)后置于37℃培养箱中培养72h。将对数生长期的l929细胞制成的细胞悬液，以每孔1×103的密度接种于96孔培养板(100ul/孔)中。加入完全培养基75ul和材料浸提液25ul，0孔和阴性对照孔中加入等量血清含量为75％完全培养基，设置6个复孔。培养至1d、2d、3d时，在各实验孔中加入5mg/ml的mtt，继续培养4h，倒掉原培养液，用pbs冲洗后，再在每孔中加入dmso，震荡10～15min，在酶联免疫检测仪上于490nm波长处测其吸光度值，od值正比于细胞数量，评价材料对细胞增殖能力的影响mtt细胞毒性。实验结果表明，甲壳素/累托石重量比为1/1的累托石-甲壳素纳米凝胶复合止血材料的细胞存活率在90％以上。表1细胞毒性实验结果样品/细胞存活率(％)24h48h72h空白对照组100100100纯甲壳素纳米凝胶11496113甲壳素/累托石重量比为12/1118105107甲壳素/累托石重量比为6/1115102113甲壳素/累托石重量比为3/1131122128甲壳素/累托石重量比为1/1125100102甲壳素/累托石重量比为1/21328580甲壳素/累托石重量比为1/312990101纯累托石433739实施例14：凝血时间试验用试管法测定甲壳素纳米凝胶的体外凝血时间。取洁净的试管，加入40mg的止血材料粉末，使粉末尽量铺开于试管底部，在37℃水浴中保温1h，将1ml新鲜抗凝兔血加入上述试管中，之后每个试管中加入20μlcacl2溶液，每隔30s将试管倾斜一次，直到试管缓慢倒置血液不流动为止，按停秒表，记下凝血时间，每个样品做6组平行实验。结果表明纯甲壳素纳米凝胶的平均体外凝血时间为302s，未加止血材料的空白对照组的平均体外凝血时间为534s，甲壳素/累托石重量比为1/1-3时，加了累托石-甲壳素纳米凝胶复合止血材料的兔血的平均体外凝血时间竟远低于加了纯累托石和纯甲壳素凝胶的兔血的体外凝血时间。表2兔血的体外凝血时间上面结合具体实施例对本发明的技术方案作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12