自组装肽折叠形成的纳米纤维抗肿瘤疫苗及方法与流程

本发明属于分子生物学及免疫学技术领域，具体涉及一种自组装肽折叠形成的纳米纤维抗肿瘤疫苗及该疫苗的构建方法。

背景技术：

宫颈癌是威胁全球女性健康的第二大常见恶性肿瘤，人乳头瘤病毒（hpv）是宫颈癌的关键致病因子，几乎在所有的宫颈癌病例中均检测到hpv的存在。其中，hpv16型是hpv高危型，与50%的宫颈癌相关。此外，hpv还与多种肿瘤疾病相关，例如阴茎癌、阴道癌、肛门癌、口咽癌、头颈癌等。hpv癌蛋白e6和e7的表达通过促进感染细胞的细胞周期、抑制细胞凋亡和增加基因组不稳定性而导致感染细胞的转化和恶性细胞的增殖。e6和e7在感染和恶性的细胞中持续表达和存在，因此它们通常被用作针对hpv相关肿瘤的治疗性疫苗的理想抗原靶点。

肿瘤疫苗是通过触发肿瘤抗原特异性细胞免疫来治疗癌症的有前景的免疫治疗策略。目前，在临床前研究了大量治疗性hpv疫苗候选物，并且在动物模型中显示出一定的效果。然而，目前的疫苗在临床试验中通常缺乏显著的疗效，可能原因之一是不能产生足够强烈的抗肿瘤免疫应答，e6和e7蛋白或基于肽的亚单位疫苗的免疫原性通常是有限的，因此，探索有效的抗原递送载体可能是增强肿瘤疫苗临床功效的重要方法。

近年来，纳米颗粒疫苗已经引起广泛的关注，作为疫苗载体，其具有许多优点，例如高效呈递抗原和包载抗原、功能性修饰的灵活性、增加抗原的稳定性和良好的生物相容性。纳米颗粒疫苗包括聚合物纳米颗粒、无机纳米颗粒、基于脂质的纳米颗粒、病毒样纳米颗粒、细菌衍生的外膜囊泡和自组装肽纳米颗粒或纳米纤维。自组装肽定义为一种能自发地将其自身排列成有序纳米结构的肽，其可作为组织工程支架或用于药物和疫苗递送的载体。

q11是一段由11个氨基酸组成的短肽，经一定浓度的盐溶液、温度和时间装配，可以自组装成纳米级纤维结构，然而，在疫苗设计中，自组装纳米纤维的应用仍然是初步的，需要进一步探索，特别是在开发肿瘤疫苗方面的潜力。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种自组装肽折叠形成的纳米纤维抗肿瘤疫苗及该疫苗的构建方法。本发明首次使用自组装肽q11呈递hpv16e744-62抗原表位（e7-q11），探究e7-q11能否装配为纳米纤维及装配条件，随后探究e7-q11纳米纤维装配条件优化后形成的纳米纤维能否引发有效的抗肿瘤细胞免疫应答和抑制肿瘤生长的能力，并评估自组装的纳米纤维作为肿瘤疫苗载体的潜力，从而为癌症的免疫治疗提供一种新的疫苗方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

自组装肽折叠形成的纳米纤维抗肿瘤疫苗，包括e7-q11肽，所述的e7-q11肽的氨基酸序列如sediqno.1所示。

进一步，优选的是，所述的自组装肽折叠形成的纳米纤维抗肿瘤疫苗，是将e7-q11肽溶于无菌水至2mm，并放置4℃过夜，再用ph7.4的1×pbs溶液装配e7-q11肽为纳米纤维，得到纳米纤维抗肿瘤疫苗。

进一步，优选的是，用ph7.4的1×pbs溶液装配e7-q11肽为纳米纤维的具体方法为：用ph7.4的1×pbs溶液稀释e7-q11肽水溶液至0.5mm，并于20℃下静置4.5h。

进一步，优选的是，1l1×pbs溶液的制备方法为：将nacl8g、kcl0.2g、ha2hpo41.42g和kh2po40.27g溶于无菌水，调节ph至7.4，即得。

一种用于制备纳米纤维抗肿瘤疫苗的自组装肽，所述的自组装肽为e7-q11肽，所述的e7-q11肽的氨基酸序列如sediqno.1所示。

编码权利要求上述e7-q11肽的核苷酸，核苷酸序列如seqidno.2所示。

本发明同时提供上述e7-q11肽作为制备纳米纤维抗肿瘤疫苗的应用。

所述e7-q11肽的制备方法，具体是：将hpv16e744-62肽通过柔性臂化学修饰到自组装肽q11的n端，纯化，得到e7-q11肽。

进一步，优选的是，所述的柔性臂氨基酸序列如sediqno.3所示；所述的纯化采用反相hplc纯化。

本发明还提供所述的自组装肽折叠形成的纳米纤维抗肿瘤疫苗的构建方法，包括如下步骤：

将hpv16e744-62肽通过柔性臂化学修饰到自组装肽q11的n端，纯化，得到e7-q11肽，冻干，-20℃储存；

将冻干的e7-q11肽溶于无菌水至2mm，并放置4℃过夜，再用ph7.4的1×pbs溶液装配e7-q11肽为纳米纤维，得到纳米纤维抗肿瘤疫苗。

将该纳米纤维疫苗，以预防性策略免疫小鼠，即免疫三次再接种肿瘤，观察小鼠肿瘤生长情况，发现纳米纤维e7-q11免疫小鼠，小鼠肿瘤生长受到显著抑制；随后在小鼠第一次接种肿瘤细胞后12周再次接种肿瘤细胞，发现纳米纤维e7-q11免疫小鼠仍然显著抑制肿瘤生长，抑制率约为100%，且纳米纤维e7-q11免疫小鼠后可以提供长期的免疫保护作用。

将纳米纤维e7-q11以治疗性策略免疫小鼠，分别在肿瘤长至2-3mm和5-6mm时进行疫苗干预，共免疫三次，观察小鼠肿瘤生长情况。结果显示，纳米纤维e7-q11可以显著抑制2-3mm肿瘤生长，且可以治愈2-3mm肿瘤，治愈率约67%；在观测时间点结束后，收集小鼠的脾脏，进行elispot检测分泌ifn-γ的淋巴细胞数目，发现纳米纤维e7-q11免疫后，小鼠体内产生了较高水平的分泌ifn-γ的淋巴细胞数目；在5-6mm肿瘤的治疗性免疫中，结果显示，纳米纤维e7-q11可以显著抑制5-6mm肿瘤生长，且可以治愈较大肿瘤（5-6mm），治愈率约50%；在观测时间点结束后，收集小鼠的脾脏，通过流式细胞术（fcm）检测脾淋巴细胞中ctl、th1、th2、mdsc细胞的水平，发现以纳米纤维e7-q11免疫小鼠可以显著提高脾淋巴细胞中ctl和th1的水平，并显著抑制th2和mdsc的水平。

本发明所述的hpv相关肿瘤包括：由hpv引发的宫颈癌、口咽癌、阴茎癌、阴道和肛门癌。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

本发明首次使用自组装肽q11呈递hpv16e744-62抗原表位（e7-q11），并成功将e7-q11肽装配为纳米纤维，制成抗肿瘤疫苗；经实验研究发现，纳米纤维e7-q11疫苗预防性免疫小鼠后能够诱导机体产生强烈的hpv16e7特异性的细胞免疫应答，并完全抑制肿瘤的生长，激发免疫记忆，可以提供长期的抗肿瘤作用；纳米纤维e7-q11疫苗，免疫小鼠后可以诱导th1/ctl偏向性细胞免疫应答，并显著抑制免疫抑制性细胞mdsc；纳米纤维e7-q11疫苗，可以治愈部分小鼠移植肿瘤，治愈效果显著，可以作为一种有效的hpv相关肿瘤的治疗性疫苗；首次将自组装肽q11应用于hpv相关肿瘤疫苗的设计中，并显现了显著的抗肿瘤免疫效应，为肿瘤疫苗设计提供新的设计思路。

附图说明

图1为自组装肽q11形成的纳米纤维的透射电镜图；显示了q11可以装配为纳米纤维结构；

图2为e7-q11肽形成的纳米纤维的透射电镜图；显示e7-q11肽可以装配为纳米纤维结构；

图3为纳米纤维e7-q11预防性免疫策略的实验程序；

图4为小鼠预防性免疫纳米纤维e7-q11后小鼠肿瘤生长曲线图；显示了纳米纤维e7-q11免疫小鼠后显著抑制肿瘤生长，且可以提供长期的免疫保护，再次接种肿瘤细胞后小鼠肿瘤也未生长；

图5为2-3mm肿瘤的治疗性免疫策略的实验程序；

图6为2-3mm小鼠肿瘤治疗性免疫e7-q11纳米纤维后小鼠肿瘤生长曲线图；显示了纳米纤维e7-q11可以显著抑制2-3mm肿瘤的生长；

图7为2-3mm小鼠肿瘤免疫e7-q11纳米纤维的无肿瘤生存率图；显示了纳米纤维e7-q11可以治愈2-3mm肿瘤，治愈率约67%；

图8为纳米纤维e7-q11免疫小鼠后脾淋巴细胞中分泌ifnγ的淋巴细胞的elispot数据图；显示了经elispot分析，纳米纤维e7-q11免疫后可以提高脾淋巴细胞中分泌ifn-γ的t细胞数目；

图9为5-6mm肿瘤的治疗性免疫策略的实验程序；

图10为5-6mm小鼠肿瘤治疗性免疫e7-q11纳米纤维后小鼠肿瘤生长曲线图；显示了纳米纤维e7-q11可以显著抑制5-6mm肿瘤的生长；

图11为5-6mm小鼠肿瘤免疫e7-q11纳米纤维的无肿瘤生存率图；显示了纳米纤维e7-q11可以治愈5-6mm肿瘤，治愈率约50%；

图12为小鼠脾淋巴细胞ctl检测的流式代表性图；显示了经fcm分析，纳米纤维e7-q11免疫可以显著提高脾淋巴细胞中ctl的水平；

图13为小鼠脾淋巴细胞th1检测的流式代表性图；显示了经fcm分析，纳米纤维e7-q11免疫可以显著提高脾淋巴细胞中th1的水平；

图14为小鼠脾淋巴细胞th2检测的流式代表性图；显示了经fcm分析，纳米纤维e7-q11免疫可以显著抑制脾淋巴细胞中th2的水平；

图15为小鼠脾淋巴细胞mdsc检测的流式代表性图；显示了经fcm分析，纳米纤维e7-q11免疫可以显著抑制脾淋巴细胞中mdsc的水平。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

实施例1：纳米纤维抗肿瘤疫苗的制备及形态鉴定

将hpv16e744-62肽通过柔性臂ser-gly-ser-gly化学修饰到自组装肽q11的n端，利用反相hplc纯化e7-q11肽，冻干，-20℃储存。将冻干的e7-q11溶于无菌水至2mm，并放置4℃过夜，再用1×pbs（ph7.4）溶液装配e7-q11为纳米纤维，装配条件为1×pbs（ph7.4）溶液稀释e7-q11水溶液至0.5mm，并于室温20℃，静置4.5h，得到装配为纳米纤维的抗hpv相关肿瘤疫苗。

将装配后的e7-q11纳米纤维，通过透射电子显微镜（tem）观察e7-q11装配后的纤维形态。

其中，q11肽（氨基酸序列：ac-gln-gln-lys-phe-gln-phe-gln-phe-glu-gln-gln-am，如sediqno.4）和e744-62-q11肽（氨基酸序列：gln-ala-glu-pro-asp-arg-ala-his-tyr-asn-ile-val-thr-phe-cys-cys-lys-cys-asp-ser-gly-ser-gly-gln-gln-lys-phe-gln-phe-gln-phe-glu-gln-gln-am，如sediqno.1）由吉尔生化股份有限公司合成。对纳米纤维e7-q11的装配条件进行摸索并优化，具体优化后的装配条件如下：将冻干的e7-q11溶于无菌水至2mm，并放置4℃过夜，再用1×pbs（ph7.4）溶液装配e7-q11为纳米纤维，装配条件为1×pbs（ph7.4）溶液稀释e7-q11水溶液至0.5mm，并于室温20℃，静置4.5h（1×pbs配方如下：nacl8g，kcl0.2g，ha2hpo41.42g，kh2po40.27g，溶于无菌水，调ph至7.4，共1l）。

ac:acetyl，代表肽段的n端gln乙酰化修饰；

am：amide，代表肽段的c端gln酰胺化修饰

左边的ac是指左边的氨基酸gln进行了ac修饰；

右边的am是指右边的氨基酸gln进行了am修饰

将q11和e7-q11经磷钨酸负染后，电镜观察纳米纤维的形态（图1、图2）。

实施例2：预防性免疫策略和小鼠移植肿瘤模型建立

雌性c57bl小鼠，6-8周龄，在预防性免疫试验中，小鼠首先免疫3次，间隔2周，小鼠分为两组，每组5只小鼠，分别为免疫q11载体组（采用q11肽）和e7-q11疫苗组（采用纳米纤维e7-q11），免疫计量为12.5nmol，每只200ul，在第三次免疫后两周，在小鼠右侧腹皮下注射50ul体积，1×10⁵个tc-1细胞（细胞浓度2×10⁶cells/ml），且细胞与basementmembranematrix体积比1：1混匀（图3）。肿瘤接种后，每3-4天测量肿瘤大小（图4）。在肿瘤第一次接种后12周再次接种在左侧腹皮下注射1×10⁵个tc-1细胞（细胞浓度2×10⁶cells/ml），并每隔3-4天测量肿瘤大小。结果显示，再次接种肿瘤细胞后，纳米纤维e7-q11疫苗组小鼠肿瘤未生长，完全抑制再次接种的肿瘤。

实施例3：小鼠移植肿瘤模型建立和治疗性免疫2-3mm肿瘤

小鼠分为3组，在小鼠右侧腹皮下注射1×10⁵个tc-1细胞（细胞浓度2×10⁶cells/ml），免疫程序如图5，待肿瘤长至2-3mm，进行疫苗免疫，小鼠分为3组，分别为q11载体组，e7-q11疫苗组、e7-q11非装配组（e7-q11非装配组即为e7-q11冻干肽溶于无菌水就立即免疫小鼠，不经过1×pbs装配），免疫计量为每次12.5nmol、100ul，共免疫3次，间隔一周，并每3-4天测量肿瘤的大小（图6、图7），在第三次免疫后34天，取小鼠的脾脏，进行免疫学检测，利用elispot检测抗原特异性的分泌ifn-γ的淋巴细胞，应用e749-57肽进行刺激，操作步骤按mouseifnγprecoatedelispot试剂盒（北京达科为生物技术有限公司）的说明书进行，即取小鼠脾脏淋巴细胞，铺至96孔细胞培养板，每孔100ul体积，细胞数为3×10⁶个细胞数，并应用5ug/ml的e749-57肽进行体外刺激，37℃、5%co2培养箱内培养20h（图8）。

实施例4：小鼠移植肿瘤模型建立和治疗性免疫5-6mm肿瘤

小鼠右侧腹皮下接种肿瘤细胞，方法同上，待肿瘤直径长至5-6mm时，进行疫苗干预，小鼠分为q11载体组、e7-q11疫苗组和e7-q11非装配组，每组6只小鼠，共免疫3次，间隔一周（图9）。期间，每隔3-4天测量肿瘤的大小（图10、图11），在第三次免疫后3周，进行免疫学检测，取小鼠的脾淋巴细胞，通过fcm，检测脾淋巴细胞中的ctl，th1，th2，和mdsc细胞水平（图12-15），流式操作按流式抗体apcanti-mousecd8a，peanti-mouseifnγ，fitcanti-mousecd4，apcanti-mouseil4，peanti-mousegr-1，apcanti-mousecd11b（美国biolegend公司)说明书进行。

本发明疫苗免疫小鼠后可以突破免疫耐受，激发强烈的hpv16e7特异性细胞免疫应答，并提供长期的免疫保护，对hpv相关肿瘤具有显著的抑制作用。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

sediqno.1

glnalagluproaspargalahistyrasnvalthrphecyscyslys

151015

cysaspserglyserglyglnglnlyspheglnpheglnpheglugln

202530

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caggctgagcccgaccgcgcccactacaacatcgtcaccttctgttgtaagtgcgactcc60

ggatccggacaacaaaaatttcaatttcaatttgaacaacaa102

sediqno.3

serglysergly

1

sediqno.4

glnglnlyspheglnpheglnphegluglngln

1510

序列表

<110>中国医学科学院医学生物学研究所

<120>自组装肽折叠形成的纳米纤维抗肿瘤疫苗及方法

<160>4

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