青钱柳三萜部位在制备糖尿病肾病药物中的应用的制作方法

本发明涉及一种天然药物的用途，具体为青钱柳三萜部位通过自噬在制备改善或治疗糖尿病肾病的药物中的应用。

背景技术：

糖尿病肾病(diabetesnephropathy，dn)是糖尿病最常见的并发症，其特点是尿白蛋白排泄量升高、肾小球滤过率受损以及肾功能逐渐下降，最终导致终末期肾功能衰竭。流行病学表明，糖尿病肾病在糖尿病患者群中的发生率为20％-40％，伴有终末期糖尿病肾病的5年生存率小于20％。

dn是由多种因素造成的，包括遗传因素、代谢失调、内皮功能紊乱等有着密切关系。实验研究表明失调的代谢环境(包括高血糖、高脂血症和胰岛素抵抗)在dn发病过程中扮演着重要的角色，代谢异常则会造成肾脏细胞的过度凋亡。因此，肾细胞凋亡是导致糖尿病肾病的一个重要因素。

自噬，是真核生物中一种由溶酶体介导的高度保守的降解过程，可去除蛋白质聚集物和受损或过剩的细胞器，从而有助于维持在各种压力条件下的内稳态。越来越多的证据表明自噬在糖尿病肾病中扮演了重要角色。研究指出，增强自噬可以改善高糖诱导的肾细胞凋亡，从而改善糖尿病肾病。因此，增强自体吞噬和防止细胞凋亡是治疗dn的一个新策略。

目前临床上尚无直接治疗dn的特异性药物，当前的治疗模式依赖于早期发现、口服降糖药及降压药等。因此寻找能够治疗dn的药物具有重大的临床意义。

技术实现要素：

发明目的：为了解决现在治疗手段中糖尿病肾病缺乏有效的防治药物的问题，本发明提供了一种青钱柳的三萜部位在制备改善或治疗糖尿病肾病的药物中的应用。

技术方案：本发明所述的青钱柳的三萜部位，能够改善或治疗糖尿病肾病。

青钱柳三萜部位在制备改善或治疗糖尿病肾病药物中的应用。

所述的糖尿病肾病药物剂型为胶囊剂、片剂、口服制剂、微囊制剂、注射剂。

青钱柳三萜部位在制备自噬蛋白lc3增强剂的药物中的应用。

所述的自噬蛋白lc3增强剂的药物剂型为胶囊剂、片剂、口服制剂、微囊制剂、注射剂。

青钱柳三萜部位在制备抑制肾细胞凋亡的药物中的应用。

所述的抑制肾细胞凋亡的药物剂型为胶囊剂、片剂、口服制剂、微囊制剂、注射剂。

有益效果：本发明的青钱柳三萜部位可通过提高自噬来改善肾细胞的凋亡，抑制糖尿病肾病的进程，效果优于阳性药组。青钱柳作为我国的食品新资源，安全性高。

附图说明

图1是青钱柳三萜部位干预糖尿病肾病大鼠体重变化图；

图2是青钱柳三萜部位干预糖尿病肾病大鼠血糖变化图；

图3是a为青钱柳三萜部位干预糖尿病肾病大鼠尿白蛋白变化图；b为尿素氮变化图；c为肌酐变化图；

图4是青钱柳三萜部位对糖尿病大鼠肾脏病理变化示意图；

图5是青钱柳三萜部位对糖尿病大鼠肾脏细胞凋亡hoechst染色及tunel染色示意图；

图6是实施例2中青钱柳三萜部位对高糖刺激的肾小管上皮细胞的存活比例变化图；

图7是实施例2中青钱柳三萜部位对高糖刺激的肾小管上皮细胞的hoechst染色示意图；

图8是实施例3的动物肾组织蛋白印记法-免疫印迹实验(western-blot)图。a为蛋白印记图；b为lc3蛋白灰度积分图；c为p62蛋白灰度积分图；

图9是实施例3的细胞蛋白印记法-免疫印迹实验(western-blot)图。a为蛋白印记图；b为lc3蛋白灰度积分图；c为p62蛋白灰度积分图；

图10是实施例3的细胞lc3ii的免疫荧光示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容。但本发明并不限于以下实施方式。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从公开商业途径获得，其中青钱柳三萜部位提取方法参考公开专利：青钱柳有效部位在制备防治非酒精性脂肪肝药物中的应用(专利号cn104971090a)。

青钱柳三萜部位在糖尿病肾病中可以抑制肾细胞的凋亡，增加肾细胞的存活率。

为寻找青钱柳三萜部位在糖尿病肾病中可以抑制肾细胞凋亡的作用机制，开展体外细胞和体内动物实验，并检测自噬水平的标志性蛋白lc3的表达，采用westernblot、免疫荧光实验验证青钱柳三萜部位是通过提高自噬进而改善糖尿病肾病。

在本发明的一个优选实施方式中，所述病理特点为肾细胞的凋亡，所述实验动物为spf级的sd大鼠，所述的肾脏细胞为肾小管上皮细胞hk-2。具体实施方式的实验结果表明，在动物水平上，青钱柳三萜部位能改善链尿佐菌素(stz)刺激的sd大鼠的尿白蛋白、肌酐、尿素氮水平下降，自噬水平上升，从而减少肾细胞凋亡改善糖尿病肾病。在细胞水平上，青钱柳三萜部位能改善高糖刺激的肾细胞凋亡，自噬水平上升，最终达到改善糖尿病肾病的目的。

实施例1

青钱柳三萜部位能改善糖尿病肾病大鼠的肾功能损伤

取spf级体重为200±20g的雄性sd大鼠60只，适应性喂养1周后，禁食12h，用0.1mmol·l^-1柠檬酸缓冲液(ph＝4.2)溶解stz，以65mg·kg^-1剂量腹腔注射随机48只大鼠10ml·kg^-1，其余12只同等剂量注射柠檬酸缓冲液，1周后测定血糖值，血糖值均大于16.7mmol·l^-1，再将48只分为4组，每组12只，分别为模型组(stz组)、阳性药组(met组)、青钱柳三萜酸低剂量组(cptl组)、青钱柳三萜酸高剂量组(cpth组)，各组分别灌胃cmc-na溶液、200mg·kg^-1二甲双胍、40mg·kg^-1青钱柳三萜酸、160mg·kg^-1青钱柳三萜酸，连续干预10周,每周测定一次体重，实验结束后处死大鼠，收集血清，检测血糖、尿白蛋白、肌酐、尿素氮水平。取肾组织，进行he染色和pas观察病理变化。

结果发现青钱柳三萜部位具有良好的降糖效果及保护肾脏的作用。

对体重的影响结果如图1所示，青钱柳三萜部位能有效降低糖尿病肾病大鼠模型的体重。

对空腹血糖的影响结果如图2所示，青钱柳三萜部位能有效降低糖尿病肾病大鼠模型的血糖。

对尿白蛋白、尿素氮、肌酐影响结果如图3所示，青钱柳三萜部位能有效改善糖尿病肾病大鼠模型的肾功能损伤。

对大鼠肾脏病理变化的影响如图4所示，青钱柳三萜部位能有效改善肾小球系膜弥漫性增厚以及肾小球的广泛纤维化。

实施例2

青钱柳三萜部位能改善糖尿病肾病大鼠的肾细胞凋亡

取实施例1中一块肾组织，用10％中性福尔马林液浸泡固定48h，然后石蜡包埋，切成5μm厚的切片，进行hoechst染色和tunel染色，然后在荧光倒置显微镜下观察拍照，结果如图5所示，结果表明青钱柳三萜部位可以明显改善糖尿病大鼠的肾脏细胞凋亡。hoechst试剂盒和tunel试剂盒均来自于江苏凯基生物有限公司，操作均按照说明书操作。

实施例3

青钱柳三萜部位能改善肾小管上皮细胞凋亡

将人肾小管上皮细胞(hk-2)分为四组，每组有三个平行孔，按每孔接种5*10³个细胞接入96孔板，用含有10％胎牛血清的dmem高糖培养基培养，在5％co2的37℃培养箱中实施；接种细胞后对这三组细胞分别按照如下方法处理：第1组为空白组，葡萄糖浓度为5mm，第2组为高糖组，葡萄糖浓度为30mm，第3组和第4组分别为青钱柳低剂量组(5μg/ml)和青钱柳高剂量组(20μg/ml)，葡萄糖浓度为30mm，4组均处理48h。以上4组细胞按上述方法处理后，弃去培养基，加入噻唑蓝(mtt)，4h后加入dmso，进行mtt实验，酶标仪测定490nm处的吸收度，计算细胞活力，结果如图6所示。同时，将hk-2细胞按每孔接种10*10⁴个细胞接入48孔板，按上述4组细胞处理后，弃去培养基，加入hoechst试剂染色10min后，弃去，用pbs洗三遍，置于显微镜下拍照，结果如图7所示。

图6和图7结果均表明青钱柳三萜部位能改善高糖引起肾小管上皮细胞凋亡。

实施例4

青钱柳三萜部位对自噬的调控

实施例1中肾组织，洗净剪碎，称取20mg组织加入含蛋白酶抑制剂的ripa裂解液，用组织研磨器研磨后，冰上裂解30min，12000转离心15min，取上清的蛋白样本，通过bca法测定蛋白浓度，并进行westernblot实验(蛋白印记法)，使用15％sds-page分离蛋白质样品并转移到硝酸纤维素(nc)膜上。室温下，将膜放入在tbst缓冲液配置的5％bsa中封闭1h。然后，将膜与第一抗体lc3与p62与gapdh在4℃孵育过夜。第二天，将膜与相关的第二抗体在室温下孵育1小时，并通过ecl溶液发光，检测lc3蛋白的表达量，其中gapdh作为归一化内参蛋白。图8为westernblot动物中lc3ii蛋白、p62蛋白和内参蛋白的比值。

westernblot实验结果表明，和空白组相比，模型组的lc3ii蛋白下降，p62蛋白上升，药物组相对于模型组相比，lc3ii的蛋白水平上调，p62蛋白下降，且青钱柳三萜部位的效果优于阳性药二甲双胍；说明青钱柳三萜部位能通过提高自噬改善糖尿病肾病。

实施例3中的四组细胞，利用细胞刮收集细胞，转移至1.5ml的ep管中，加入含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的ripa裂解液，按上述westernblot方法检测lc3蛋白与p62的表达量。图9为westernblot细胞中lc3ii蛋白、p62蛋白和gapdh蛋白的比值。

westernblot实验结果表明，和空白组相比，高糖组的lc3ii蛋白下降，p62蛋白上升，药物组相对于高糖组相比，lc3ii的蛋白水平上调，p62蛋白下降，说明青钱柳三萜部位能通过提高自噬改善肾细胞凋亡。

实施例3中的四组细胞，吸去培养基，加入4％多聚甲醛固定；固定结束后，吸去多聚甲醛，每孔加入500μl的0.5％的tritonx-100(vtritonx/vpbs＝0.5)，细胞通透后用5％的fbs室温封闭1h，加入lc3ii一抗4℃孵育过夜。次日弃去一抗，避光加fitc标记的荧光二抗室温孵育1h。最后dapi复染。用荧光显微镜拍照，结果如图10所示，其中merge为lc3荧光与dapi荧光组合图。

图10可以看出，与空白组相比，高糖组的lc3ii荧光强度减弱，表达明显下降，药物组相对于高糖组相比，lc3ii的荧光变强，蛋白水平上调，进一步说明青钱柳三萜部位能通过提高自噬改善糖尿病肾病。