一种中药常山的炮制方法及其炮制品的质量检测方法与流程

本发明涉及一种中药的炮制方法，具体涉及中药常山的炮制方法及其炮制品的质量检测方法。

背景技术：

中药常山，为虎耳草科常山属植物常山dichroafebrifugalour.的干燥根。常山味苦、辛，性寒，有小毒。具有截疟、劫痰、解毒的功效。常山的原植物品种在唐代以前以芸香科植物臭常山为正品，至宋代逐渐发现虎耳草科植物黄常山的抗疟效果更强，遂将黄常山定为主流正品。

常山的化学成分主要为喹唑酮类生物碱(包括常山碱甲、乙和丙三种)、香豆素、甾体、多酚等化学成分。其中常山的主要活性成分为常山酮(抗肿瘤、抗鸡球虫病成分)、常山乙素(又名常山碱)、常山甲素(又名异常山碱)。二者的分子式均为c16h19o3n3，二者为同分异构体。

常山是传统中医临床治疗疟疾的首选药物，其主要的药效学物质是常山生物碱，其中常山乙素比常山甲素更具毒性也更具药效。为了降低其致吐的毒性副作用，须炮制后入药。历代常山的炮制方法有润、泡、清炒、麸炒、醋炙、酒炙、酒炖等方式，其中酒制与醋制常山又是其中应用较为广泛的炮制方法。

目前国内关于常山的系统炮制工艺筛选较少，关于中药常山及其炮制品的质量检测方法的研究尚无统一的结论。本发明通过单因素实验与正交设计相结合的方法，以常山炮制品中有效成分含量为指标，利用高效液相色谱法建立中药常山以及其炮制品的质量检测方法，通过大量的工艺筛选试验，研究常山的最佳炮制工艺，对全面客观评价常山及其炮制品的质量标准具有重要的意义。

技术实现要素：

发明目的：本发明的目的是解决现有技术的补足，提供一种炮制工艺合理，炮制工艺稳定，特别是可以提高有效成分常山碱和异常山碱的常山炮制方法。本发明另一个目的是提供常山炮制品的质量检测方法。该检测方法可以客观、准确的评价常山及其炮制品的质量，为保证临床疗效具有重要意义。

技术方案：为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种中药常山的炮制方法，其特征在于，包括以下步骤：

取中药常山原药材，加入黄酒，闷润，炒干，晾凉，打粉，既得。

作为优选方案，以上所述的中药常山的炮制方法，包括以下步骤：

取中药常山原药材100g，加入黄酒100ml，闷润20min，120℃炒干，晾凉，打粉，既得。

本发明所述的中药常山的炮制品的质量检测方法，包括以下步骤：

(1)混合对照品的制备

精密称取定量的常山碱和异常山碱对照品，加入50％甲醇水溶液定容，配置成浓度均为100ug/ml的常山碱和异常山碱混合对照品溶液；

(2)常山供试品的制备

精密称取适量的常山与常山炮制品，料液比1:1的氨水润湿，加入100倍体积的氯仿超声处理2小时，补足失重，取滤液蒸干后用50％甲醇溶液定容至20ml，过0.45um微孔滤膜，得供试品溶液；

(3)标准曲线的制备

取步骤(1)混合对照品溶液稀释至不同浓度，分别取10μl，注入高效液相色谱仪进行分析，以峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标，绘制常山碱和异常山碱的标准曲线；

(4)含量测定

取步骤(2)常山供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪进行分析，根据常山碱和异常山碱的保留时间，将常山碱和异常山碱的峰面积代入步骤(3)制得的线性回归方程，计算供试品溶液中常山碱和异常山碱的含量。

作为优选方案，以上所述的中药常山的炮制品的质量检测方法，步骤(3)和步骤(4)的高效液相色谱仪的色谱条件为：

ymc-pack-ods-a的c18色谱柱，流动相为乙腈和0.75％的三乙胺水溶液，体积比为9:91等度洗脱，三乙胺水溶液用冰醋酸调ph至5.5-6.5，流速为1ml/min，柱温30℃，检测波长254nm，进样量10ul。

作为优选方案，以上所述的中药常山的质量检测方法，步骤(3)制得的常山碱标准曲线为y＝9721.8x-553.6，r²＝0.9998；异常山碱标准曲线y＝9493.5x-5950.9，r²＝0.9997。

一、炮制工艺的筛选实验：

1、试剂

甲醇、乙醇、乙腈(fisher公司，hplc级)，氨水、三乙胺、冰醋酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。

2、对照品

常山碱(批号180427，成都普菲德生物技术有限公司)，异常山碱(批号180314，成都普菲德生物技术有限公司)

常山药材产地：四川。

3.方法与结果

3.1炮制工艺的初筛

3.1.1常山的炮制工艺

3.1.1.1生常山：取原药材100g，打粉，过50目筛。

3.1.1.2酒常山：取原药材100g，加入100ml黄酒，闷润20min，120℃炒干，晾凉，打粉。

3.1.1.3醋常山：取原药材100g，加入100ml陈醋，闷润20min，120℃炒干，晾凉，打粉。

3.1.1.4麸炒常山：取100g麦麸炒至冒烟，投入100g原药材炒至常山药材表面成黄褐色，晾凉，打粉。

3.1.1.5甘草汁制常山：先取甘草20g加入200ml水煎煮得200ml甘草汁供取用。取原药材100g加100ml甘草汁闷润20min，120℃炒干，晾凉，打粉。

3.1.1.6甘草汁与酒共制常山：取甘草汁50ml和黄酒50ml，取原药材100g闷润20min，120℃炒干，晾凉，打粉。

3.2常山炮制品含量测定

3.2.1色谱条件

ymc-pack-ods-a的c18色谱柱，流动相为乙腈和0.75％的三乙胺水溶液，体积比为9:91等度洗脱，三乙胺水溶液用冰醋酸调ph至5.5-6.5，流速为1ml/min，柱温30℃，检测波长254nm，进样量10ul。

3.2.2常山供试品的制备

分别取常山生品和炮制品各0.5g，取0.5ml氨水润湿，加入50ml氯仿，超声(40kw，100khz)回流2h，补足失重，抽滤，滤液至于水浴锅上蒸干，后用50％甲醇溶解，再定容至20ml容量瓶中。作为样品液。过0.45um微孔滤膜，得供试品溶液。

3.2.3常山混合对照品的制备

取2.5mg常山碱和2.5mg异常山碱至25ml容量瓶中，用50％甲醇溶解。得到浓度均为约100ug/ml的常山碱和异常山碱混合对照品溶液。

3.2.4含量测定结果

生品的常山碱和异常山碱含量最高。炮制品中酒制常山的常山碱异常山碱含量最高。由此选择酒制常山做炮制正交工艺的考察。数据记录见表1。

表1常山炮制品含量(％)

由以上实验结果表明，酒制常山炮制品中有效成分常山碱、异常山碱的含量最高，因此优选酒制作为常山的炮制工艺。

二、最佳酒制炮制工艺的筛选实验：

1、酒制常山的单因素考察

对酒制常山闷润时间，烘干温度，料液比三个因素进行单因素考察。

2、闷润时间的因素考察

取三份生常山药材，每份50g，按料液比1:1分别加入50ml黄酒，炮制不同时间，具体时间见表2,至烘箱中120℃烘干(30min)，取出，晾凉，打粉，按上述3.2.2供试品制备方法制备供试品。

表2酒制常山闷润时间考察表

可见闷润时间不同，常山中常山碱和异常山碱的含量均有变化，闷润时间可以成为影响常山碱异常山碱含量变化的因素。经实验结果表明，单因素最佳闷润时间为20min。

3、烘干温度的因素考察

取三份生常山药材，每份50g，按料液比1:1分别加入50ml黄酒，炮制20min，至烘箱中以不同温度烘干(30min)，具体温度见表/3，取出，晾凉，打粉，按上述3.2.2供试品制备方法制备供试品。

表3酒制常山烘干温度考察表

可见烘干温度不同，常山中常山碱和异常山碱的含量均有变化，烘干温度可以成为影响常山碱异常山碱含量变化的因素。经结果表明，单因素最佳烘干温度为120℃。

4、料液比的因素考察

取三份生常山药材，每份50g，按不同料液比分别加入50ml黄酒，炮制20min，至烘箱中120℃烘干(30min)，具体料液比见表4，取出，晾凉，打粉，按上述3.2.2供试品制备方法制备供试品。

表4酒制常山料液比考察表

可见料液比不同，常山中常山碱和异常山碱的含量均有变化，料液比可以成为影响常山碱异常山碱含量变化的因素。经实验结果表明，单因素最佳料液比为2:1。

5、单因素实验结果

通过单因素考察，确定以闷润时间(min)，烘干温度(℃)，料液比三个因素为酒制常山正交工艺考察的三因素。

6、酒制常山的正交实验设计

根据单因素考察，确定以闷润时间(min)，烘干温度(℃)，料液比为考察因素，以常山碱和异常山碱的含量百分比为指标，分别设立三个水平，选用l9(3³)正交实验。分别取9份生常山药材每份50g，按正交表进行炮制，按3.2.2供试品制备方法制备供试品。实验因素和水平，正交实验结果及其方差分析等见表5、表6、表7。

表5正交因素水平表

表6正交实验结果表

表7方差分析表

由正交表实验及方差分析表得，酒制常山的三个影响因素影响大小为a(烘干温度)＞c(料液比)＞b(闷润时间)。

有研究表明常山主要的药效学物质是常山生物碱，其中常山乙素比常山甲素药效作用更强，有更大的抗疟作用(约50倍)。因此综合平衡下，常山炮制最佳方式为酒制，最佳工艺为a1b1c1，即闷润20min，120℃烘干，料液比1:1，制备的酒制常山炮制品中常山乙素含量为0.0302％,常山甲素含量为0.0242％。

有益效果：

1、本发明通过大量对比实验筛选不同的炮制工艺，筛选出常山最佳的炮制方法，并通过单因素和正交实验表筛选出最佳的炮制工艺。

2、另外本发明通过大量实验筛选出常山炮制品的质量检测方法，特别是通过大量实验筛选出最佳的流动相组成、流速、检测波长、色谱柱、柱温等分析条件，经方法学验证表明，本发明提供的常山的质量检测方法，具有方法简便、稳定性好、精密度高、重现性好等优点。

3、本发明提供的常山炮制品的质量检测方法可以较全面、客观、准确的检测和评价常山的质量，为保证其临床疗效具有重要意义。

附图说明

图1为本发明的常山的hplc色谱图，其中1是常山碱、2是异常山碱。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所述试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

中药常山的炮制方法，其包括以下步骤：

取中药常山原药材100g，加入黄酒100ml，闷润20min，120℃炒干，晾凉，打粉，即得。

实施例2

中药常山的炮制品的质量检测方法，其包括以下步骤：

(1)混合对照品的制备

精密称取2.5mg常山碱与2.5mg异常山碱，用体积浓度50％甲醇定容至25ml，得到浓度均为100ug/ml的常山碱和异常山碱混合对照品溶液；

(2)常山供试品的制备

取实施例1的常山炮制品0.5g，用0.5ml氨水润湿，加入50ml氯仿，超声回流2h，补足失重，抽滤，滤液置于水浴锅上蒸干，然后用体积浓度50％甲醇溶解，再定容至20ml容量瓶中，过0.45um微孔滤膜，得供试品溶液；

(3)标准曲线的制备

精密量取常山乙素、常山甲素对照品溶液用流动相稀释成浓度为2ug/ml、5ug/ml、10ug/ml、20ug/ml、30ug/ml、40ug/ml、50ug/ml、60ug/ml、70ug/ml、80ug/ml、90ug/ml、100ug/ml的常山乙素、常山甲素对照品溶液，摇匀，滤过，按“2.2.1”色谱条件精密吸取10μl进样测定常山乙素、常山甲素，以浓度(x)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标，经回归拟合得方程为：常山乙素为y＝9721.8x-553.6，r²＝0.9998，常山甲素为y＝9493.5x-5950.9，r²＝0.9997，结果表明常山乙素与常山甲素在2-100μg/ml浓度范围内二者浓度与峰面积线性关系良好。

(4)含量测定

取步骤(2)常山供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪进行分析，根据常山碱和异常山碱的保留时间，将常山碱和异常山碱的峰面积代入步骤(3)制得的线性回归方程，计算供试品溶液中常山碱和异常山碱的百分含量分别为0.0303％和0.0242％。

上述步骤(3)和步骤(4)的高效液相色谱仪的色谱条件为：

ymc-pack-ods-a的c18色谱柱，流动相为乙腈和0.75％的三乙胺水溶液，体积比为9:91等度洗脱，三乙胺水溶液用冰醋酸调ph至5.5-6.5，流速为1ml/min，柱温30℃，检测波长254nm，进样量10ul。

实施例2方法学考察

1、精密度实验

取实施例1制备得常山供试品溶液，连续进样6次，每次10μl，测定供试品溶液中常山碱和异常山碱的保留时间和峰面积，计算常山碱，异常山碱保留时间和峰面积的rsd见表8和表9。

表8常山碱精密度实验数据

表9异常山碱精密度实验数据

2、稳定性实验

取实施例1制备得常山供试品溶液，分别在0,2,4,6,8,12h进样10μl，测定供试品溶液中常山碱和异常山碱的保留时间和峰面积，计算常山碱，异常山碱保留时间和峰面积的rsd，见表10和表11。

表10常山碱稳定性实验数据

表11异常山碱稳定性实验数据

3、重复性实验

取实施例1制备得常山供试品溶液，分别测定六份平行供试品溶液中常山碱和异常山碱的保留时间和峰面积，计算保留时间和峰面积的rsd，见表12和表13。

表12常山碱重复性实验数据

表13异常山碱重复性实验数据

4、加样回收率实验

分别取酒制常山各6份，每份约0.25g，加入0.5ml浓氨水润湿，在每份样品瓶中加入约0.05mg的常山碱和异常山碱，加入50ml氯仿，超声(40kw，100khz)回流2h，补足失重，抽滤，滤液至于水浴锅上蒸干，后用50％甲醇溶解，再定容至20ml容量瓶中。作为样品液。过0.45um微孔滤膜，得供试品溶液，进行测定，如表14测定结果。

表14加样回收率实验数据

以上实验结果表明，本发明提供的常山及其炮制品的质量检测方法，稳定性好、精密度高、重复性好，能全面客观评价常山及其炮制品的质量。

以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本发明技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。