一种用于抑制肿瘤和促进修复的可注射生物活性水凝胶的制作方法

本发明涉及生物医学材料、组织工程与医学领域，尤其涉及一种抑制切除术后肿瘤复发和促进组织修复的可注射生物活性水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术：

临床上针对肿瘤的治疗手段包括手术治疗、药物治疗和放射治疗等。针对于一些体积较大，具有侵袭性的肿瘤，手术是最传统的治疗方式，可以从根本上抑制肿瘤的生长和转移。由于手术切除后癌细胞根除不完全，肿瘤复发仍是患者生存的主要挑战。同时，肿瘤切除后创面难以正常修复，甚至造成长期难以愈合的伤口。

通常情况下，对于防止肿瘤的复发采用化疗和放疗的方式。许多研究报道了纳米颗粒装载小分子药物，如阿霉素、紫杉醇和地塞米松等，用于肿瘤的化疗。然而，传统放化疗在破坏肿瘤的同时也会产生对健康细胞的毒性，导致不良副作用，包括严重的免疫抑制，肾毒性和心脏毒性等。此外，通过静脉注射全身施用药物会限制药物到达和穿透远处肿瘤细胞的能力，并且短半衰期降低了它们的有效性同时也会对体内其他正常组织造成损伤。肿瘤组织去除后会造成大面积的组织缺损，并且慢性炎症微环境中会导致不可避免的切口伤口的愈合受损。

很多研究只关注于肿瘤的治疗，而肿瘤去除后组织缺损的修复对于之后正常组织是否能发挥其功能有很大的影响。目前用于肿瘤治疗的生物材料功能都较单一，药物通常只能发挥抗肿瘤作用，对于后续组织缺损修复的问题，通常会另外选择其他修复药物，存在多种药物分子能否有序释放等问题，这些都限制了组织工程在应用于肿瘤切除后组织修复的进一步发展。

对于肿瘤切除后的局部组织，直接使用药物粉体或溶液会造成药物大量损失，高剂量的药物会对周围正常组织产生较大毒性，并且在整个抑制肿瘤复发和促进修复阶段，需要药物有序持续发挥作用。使用水凝胶作为延长药物释放的载体已经得到了广泛的研究，多种高分子材料被报道可以装载生物药物(如蛋白质和多肽)从而减轻体内酶促降解等来提高药物的疗效，如聚乙二醇、海藻酸钠和透明质酸等。

透明质酸是细胞外基质的主要成分之一，参与多种细胞信号通路的激活和传递过程，如炎症的形成、伤口愈合、肿瘤的发展和转移等。由于透明质酸水凝胶具有高亲水性，生物相容性等特性，是临床上很有前途的创伤修复敷料。但是，透明质酸传统的化学交联所需时间较长，需要提前准备好一定形状大小的水凝胶进行实验，无法满足可注射以及填充任意形状缺损的要求。同时，水凝胶包封药物易造成药物突释，影响治疗效果。

已有文献报道使用组织工程中合适的支架材料可以在局部杀死残存的肿瘤细胞并促进组织缺损修复，如利用抗肿瘤药物、某些小分子或者金属元素通过化疗、光热或光动力治疗杀死肿瘤细胞，随后复合支架中的修复因子促进缺损组织的修复等。但对于肉眼不可见的肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞的恶性增殖更为重要，而光热等治疗手段会对周围的正常组织产生巨大损伤。抗肿瘤药物和修复药物能否在时空顺序上发挥其功能，在临床上的应用受到限制。

在生物材料及医学领域，针对涉及肿瘤切除后多阶段治疗的问题仍未得到有效解决，对同时抑制肿瘤和促进修复的方法依然存在很大的需求。在组织工程领域，对组织工程支架多功能持续释放材料也依然存在很大需求。因此，本领域的技术人员致力于开发一种抑制切除术后肿瘤复发和促进组织修复的可注射生物活性水凝胶及其制备方法和应用。

技术实现要素：

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是针对肿瘤切除后的组织，如何实现通过一种药物进行多阶段治疗。

为实现上述目的一种用于抑制切除术后肿瘤复发和促进组织修复的可注射生物活性水凝胶，其特征在于，生物活性水凝胶含有高分子材料和多功能活性肽，高分子材料通过接枝剂接枝多功能活性肽，带有多功能活性肽的高分子材料通过光引发剂在紫外光下交联固化形成生物活性水凝胶。

进一步的，高分子材料为透明质酸。

进一步的，多功能活性肽为具有抗肿瘤和组织修复作用的多功能活性肽jm2，多功能活性肽jm2的氨基酸序列为vffkgvkdrvkgrsdc。

进一步的，接枝剂为甲基丙烯酸酐，光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂。

进一步的，其特征在于，生物活性水凝胶的内部为多孔结构。

本发明还提供一种用于抑制切除术后肿瘤复发和促进组织修复的可注射生物活性水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、将透明质酸水溶液和甲基丙烯酸酐溶液混合后反应，以制备接枝有甲基丙烯酸酐的改性透明质酸溶液，随后将其冷冻干燥，供后续使用；

步骤2、将步骤1的改性透明质酸溶液和多功能活性肽jm2混合后反应，以制备接枝有多功能活性肽jm2的功能化透明质酸，随后将其冷冻干燥，供后续使用；

步骤3、将步骤2的功能化透明质酸和光引发剂混合后加入模具，并通过在紫外光下进行交联固化而制得可注射生物活性水凝胶。

进一步的，步骤1中透明质酸水溶液的质量体积百分比为1％，透明质酸和甲基丙烯酸酐的摩尔比为1：10。

进一步的，步骤2中改性透明质酸和多功能活性肽jm2的摩尔比为1：10。

进一步的，步骤3中功能化透明质酸和光引发剂的质量比为9：1，紫外光功率为25mw/cm²。

本发明还提供可注射生物活性水凝胶在制备用于组织工程多种肿瘤切除后组织缺损修复支架材料中的应用。

技术效果

本发明的可注射生物活性水凝胶材料具有抑制肿瘤增殖、促进肿瘤细胞凋亡、减轻炎症、促进组织修复的能力，透明质酸-多功能活性肽jm2水凝胶持续释放药物分子，在整个阶段发挥不同治疗作用。制备得到的水凝胶材料具有可注射特点，可以填充不同形状的缺损。能更好地发挥同时抑制肿瘤复发和促进组织修复的联合治疗的效果。

在实际运用中，利用本发明可注射生物活性水凝胶材料能够在抑制肿瘤增殖、促进肿瘤细胞凋亡的同时减轻炎症、促进组织修复，其对肿瘤切除后的多阶段治疗具有良好的治疗效果。

本发明的抑制切除术后肿瘤复发和促进组织修复的可注射生物活性水凝胶制备方法简单，易于操作。临床用于皮肤肿瘤切除后治疗时，由于以液态方式施用并通过光交联固化，因此，可使用注射的方式，操作方便，大大减轻患者在治疗过程中痛苦，减少医护人员的工作强度，应用广，实用性高。

本发明的抑制切除术后肿瘤复发和促进组织修复的可注射生物活性水凝胶不仅具有良好的亲水性、无细胞毒性、稳定性、易塑形性和降解性能，并且具备持续释放药物分子的能力，从而改善了组织工程中药物分子易突释的缺陷，疗效安全持久。

本发明的抑制切除术后肿瘤复发和促进组织修复的可注射生物活性水凝胶体系简单，能发挥多种治疗功效，在抑制肿瘤增殖、促进肿瘤细胞凋亡的同时减轻炎症、促进组织修复，对肿瘤切除后的多阶段治疗具有良好的治疗效果。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1为本发明较佳实施例的透明质酸-多功能活性肽jm2可注射生物活性水凝胶的凝胶过程及外观图；

图2为本发明较佳实施例的透明质酸-多功能活性肽jm2可注射生物活性水凝胶发射扫描电子显微镜图；

图3为本发明较佳实施例的透明质酸-多功能活性肽jm2可注射生物活性水凝胶活性肽jm2分子随时间释放曲线图。

图4为本发明较佳实施例中包裹巨噬细胞的透明质酸-多功能活性肽jm2可注射生物活性水凝胶激光共聚焦显微镜图；

图5a为本发明较佳实施例中用透明质酸-多功能活性肽jm2可注射生物活性水凝胶处理c57bl/6小鼠背部创面的创面大小随时间变化照片。

图5b为本发明较佳实施例中用透明质酸-多功能活性肽jm2可注射生物活性水凝胶处理c57bl/6小鼠背部创面测定的相对创面面积随时间变化图。

图6为本发明较佳实施例中用透明质酸-多功能活性肽jm2可注射生物活性水凝胶处理c57bl/6小鼠背部创面的创面处h&e染色图；

图7为本发明较佳实施例中透明质酸-多功能活性肽jm2可注射生物活性水凝胶处理c57bl/6小鼠背部创面的创面处中性粒细胞和巨噬细胞浸润情况图；

图8为本发明较佳实施例中透明质酸-多功能活性肽jm2可注射生物活性水凝胶处理c57bl/6小鼠背部创面的创面处新生血管和成熟血管数量情况图；

图9为本发明较佳实施例中透明质酸-多功能活性肽jm2可注射生物活性水凝胶处理c57bl/6小鼠背部肿瘤切除后创面的创面后续肿瘤复发情况图；

图10为本发明较佳实施例中透明质酸-多功能活性肽jm2可注射生物活性水凝胶处理c57bl/6小鼠背部肿瘤切除后创面的创面h&e染色图；

图11为本发明较佳实施例中透明质酸-多功能活性肽jm2可注射生物活性水凝胶处理c57bl/6小鼠背部肿瘤切除后创面的创面恶性增殖细胞标志ki67表达情况图。

具体实施方式

以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。

本实施例中所使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。

实施例1：透明质酸-多功能活性肽jm2可注射生物活性水凝胶的制备

步骤1、将1g透明质酸粉体溶于100ml去离子水中不断搅拌制备得到1％的透明质酸溶液。将透明质酸溶液放置于4℃，ph＝8.0环境下，将7.4ml甲基丙烯酸酐溶液缓慢滴加到透明质酸溶液中搅拌均匀。将上述溶液在4℃，ph＝8.0环境下低速搅拌过夜。将上述溶液缓慢倒入1l无水乙醇中，沉淀，过夜。收集沉淀，通过透析袋(截留分子量7kda)透析7天，收集透析后的透明质酸溶液冷冻干燥待用；

步骤2、取100mg步骤1的冻干透明质酸溶液加入50ml三乙醇胺缓冲液，搅拌均匀。取37mg多功能活性肽jm2加入到上述溶液中，搅拌均匀。置于37℃环境下反应两h。收集上述溶液，通过透析袋(截留分子量7kda)透析3天。收集透析后溶液，随后将其冷冻干燥，供后续使用；

步骤3、将20mg步骤2的冻干功能化透明质酸溶液，加入2.2mg苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂，再加入2ml磷酸缓冲盐溶液，搅拌均匀。取约100μl上述混合溶液加入模具中，使用功率为25mw/cm²紫外光照射30s形成水凝胶。

实施例2：透明质酸-多功能活性肽jm2可注射生物活性水凝胶的外观和微观结构分析

如图1所示，实施例1制备好的透明质酸-多功能活性肽jm2可注射生物活性水凝胶具有可注射特性，且具有光滑外观。将实施例1制备好的透明质酸-多功能活性肽jm2可注射生物活性水凝胶冷冻干燥，切开干燥的缓释体系样品，得到较为平整的内部截面，经过表面喷金后采用发射扫描电子显微镜(sem)在10kv加速电压下观察活性物质缓释体系的截面结构。

如图2所示，透明质酸-多功能活性肽jm2可注射生物活性水凝胶发射扫描电子显微镜下内部为水凝胶片状结构，局部放大图显示为多孔结构。

实施例3：透明质酸-多功能活性肽jm2可注射生物活性水凝胶的持续释放活性肽jm2分子性能

步骤a、取50mg实施例1中步骤2中制备的冻干透明质酸-多功能活性肽jm2样品，加入5.6mg苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂粉体，再加入5ml磷酸缓冲盐溶液，形成混和溶液，搅拌均匀待用；

步骤b、取1ml步骤a中的混合溶液加入模具中，使用功率为25mw/cm²紫外光照射30s形成水凝胶，加入10ml磷酸缓冲盐溶液中于37℃下孵育。在8h、16h、24h、32h、48h、72h、168h分别收集1ml上清液并且加入1ml磷酸缓冲盐溶液。使用bca蛋白定量试剂盒(bcaproteinassaykit)对不同时间点的样品检测多肽浓度含量并且绘制释放曲线。

如图3所示，透明质酸-多功能活性肽jm2可注射生物活性水凝胶能够持续释放多肽药物，在肿瘤切除后前几天持续释放活性肽jm2分子抑制残余肿瘤细胞恶性增殖并促进凋亡，在第72h至168h活性肽jm2分子释放减少炎症，加速组织修复进程，整个时空上与肿瘤切除后修复进程一致，说明了本发明透明质酸-多功能药物可注射生物活性水凝胶材料具备同时调控肿瘤和修复双功能。

实施例4：透明质酸-多功能活性肽jm2可注射生物活性水凝胶对正常修复细胞的生物安全性验证

步骤i、取50mg实施例1的步骤2中制备的冻干透明质酸-多功能活性肽jm2样品，加入5.6mg苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂粉体，再加入5ml磷酸缓冲盐溶液，形成混合溶液搅拌均匀待用；

步骤ii、将巨噬细胞raw细胞以1×10⁵个/ml的密度加入100μl步骤i中的混合溶液中轻轻吹打混匀待用，使用功率为25mw/cm²紫外光照射30s形成水凝胶。

步骤iii、将步骤2中水凝胶转移到24孔板中，加入培养基，在37℃培养箱中培养包裹有raw细胞(巨噬细胞)的生物活性水凝胶3天；

步骤iv、配置活死(live-dead)细胞染液，在2.5ml磷酸缓冲盐溶液中加入5μlb试剂(乙啶同型二聚体-1)和1.25μla试剂(钙黄绿素am)混合均匀，铝箔包裹避光放置待用。将培养板中培养基吸走，磷酸缓冲盐溶液清洗三遍，每孔加入500μl染色液，培养箱中放置15min后取出，吸走染色液，使用磷酸缓冲盐溶液清洗细胞两遍，将水凝胶取出放置于载玻片上，通过激光共聚焦显微镜(clsm)进行观察。

如图4所示，在激光共聚焦显微镜下raw细胞活死状态的观察结果表明，本发明透明质酸-多功能活性肽jm2可注射生物活性水凝胶对修复细胞具有生物安全性。

实施例5：透明质酸-多功能活性肽jm2可注射生物活性水凝胶体内促进组织修复能力验证

第a步、取27只c57bl/6小鼠，使用剃毛机剃除其背部毛发，在其背部制造两个直径1cm的创面，并使用缝合环进行缝合固定；

第b步、根据实施例1所示方法，将透明质酸-多功能活性肽jm2混合溶液滴加到创面，并使用功率为25mw/cm²紫外光照射30s形成水凝胶填充伤口缺损，并设置空白组和无多功能药物的透明质酸对照组，每组设置3次重复；

第c步、在2天、6天、12天对c57bl/6小鼠背部创面进行拍照并处死，收集创面样本用于后续分析；

第d步、对第c步中创面照片进行统计学分析，比较创面区域相对大小，分析伤口愈合情况；

图5a所示为用透明质酸-多功能活性肽jm2可注射生物活性水凝胶处理c57bl/6小鼠背部创面的创面大小随时间变化照片(图中“空白”代表空白组；“ha”代表无多功能药物的透明质酸对照组；“ha-jm2”代表透明质酸-多功能活性肽jm2可注射生物活性水凝胶组)；图5b所示为用透明质酸-多功能活性肽jm2可注射生物活性水凝胶处理c57bl/6小鼠背部创面测定的相对创面面积随时间变化图(图中“空白”代表空白组；“ha”代表无多功能药物的透明质酸对照组；“ha-jm2”代表透明质酸-多功能活性肽jm2可注射生物活性水凝胶组；“*”代表两组结果之间存在显著差异)。如图5a和图5b结果所示，透明质酸-多功能活性肽jm2可注射生物活性水凝胶可促进创面闭合。

第e步、对第c步中收集的创面样本进行多聚甲醛固定过夜、70％酒精固定过夜、80％酒精脱水1h、90％酒精脱水1h、100％无水乙醇脱水30min、100％无水乙醇脱水30min、二甲苯与无水乙醇1：1透明1h、二甲苯i透明30min、二甲苯ii透明30min、石蜡i浸蜡2h、石蜡ii浸蜡2h、石蜡iii浸蜡2h、包埋等操作，并将包埋后的组织通过切片机切成5μm切片，通过一系列脱蜡至水步骤，对切片进行h&e染色、免疫组化中性粒细胞和巨噬细胞染色、免疫荧光染色。

图6所示为用透明质酸-多功能活性肽jm2可注射生物活性水凝胶处理c57bl/6小鼠背部创面的创面处h&e染色结果(图中“空白”代表空白组；“ha”代表无多功能药物的透明质酸对照组；“ha-jm2”代表透明质酸-多功能活性肽jm2可注射生物活性水凝胶组)。

图7为透明质酸-多功能活性肽jm2可注射生物活性水凝胶处理c57bl/6小鼠背部创面的创面处免疫组化染色所示中性粒细胞和巨噬细胞浸润情况(图中“空白”代表空白组；“ha”代表无多功能药物的透明质酸对照组；“ha-jm2”代表透明质酸-多功能活性肽jm2可注射生物活性水凝胶组)。

图8为透明质酸-多功能活性肽jm2可注射生物活性水凝胶处理c57bl/6小鼠背部创面的创面处免疫荧光染色所示新生血管和成熟血管数量情况(图中“空白”代表空白组；“ha”代表无多功能药物的透明质酸对照组；“ha-jm2”代表透明质酸-多功能活性肽jm2可注射生物活性水凝胶组)。

如图6至图8所示，透明质酸-多功能活性肽jm2可注射生物活性水凝胶可促进创面闭合，减少炎症细胞浸润，加快组织修复进程。

实施例6：透明质酸-多功能活性肽jm2可注射生物活性水凝胶体内抑制肿瘤切除后复发和促进组织修复能力验证

步骤1、取12只c57bl/6小鼠，使用剃毛机剃除其背部毛发，在其右侧背部注射2×10⁵个黑色素瘤细胞，7天后背部肿瘤长出，切除其背部肿瘤，残余少量肿瘤组织。并使用缝合环将肿瘤切除后创面进行缝合固定；

步骤2、根据实施例1所示方法，将透明质酸-多功能活性肽jm2混合溶液滴加到创面，并使用功率为25mw/cm²紫外光照射30s形成水凝胶填充伤口缺损，并设置无肿瘤正常创伤组、空白组和无多功能药物的透明质酸对照组，每组设置3次重复；

步骤3、在3天、7天、14天对c57bl/6小鼠背部创面进行拍照并于14天处死，收集创面样本用于后续分析；

步骤4、对步骤3中收集的创面样本进行多聚甲醛固定过夜、70％酒精固定过夜、80％酒精脱水1h、90％酒精脱水1h、100％无水乙醇脱水30min、100％无水乙醇脱水30min、二甲苯与无水乙醇1：1透明1h、二甲苯i透明30min、二甲苯ii透明30min、石蜡i浸蜡2h、石蜡ii浸蜡2h、石蜡iii浸蜡2h、包埋等操作，并将包埋后的组织通过切片机切成5μm切片，通过一系列脱蜡至水步骤，对切片进行h&e染色、免疫组化ki67增殖指标染色。

图9所示为透明质酸-多功能活性肽jm2可注射生物活性水凝胶处理c57bl/6小鼠背部肿瘤切除后创面的创面后续肿瘤复发情况图(图中“正常创伤”代表无肿瘤正常创伤组；“空白”代表空白组；“ha”代表无多功能药物的透明质酸对照组；“ha-jm2”代表透明质酸-多功能活性肽jm2可注射生物活性水凝胶组)。

图10所示为透明质酸-多功能活性肽jm2生物活性水凝胶处理c57bl/6小鼠背部肿瘤切除后创面的创面h&e染色结果(图中“正常创伤”代表无肿瘤正常创伤组；“空白”代表空白组；“ha”代表无多功能药物的透明质酸对照组；“ha-jm2”代表透明质酸-多功能活性肽jm2可注射生物活性水凝胶组)。

图11所示为透明质酸-多功能活性肽jm2可注射生物活性水凝胶处理c57bl/6小鼠背部肿瘤切除后创面的创面恶性增殖细胞标志ki67表达情况(图中“正常创伤”代表无肿瘤正常创伤组；“空白”代表空白组；“ha”代表无多功能药物的透明质酸对照组；“ha-jm2”代表透明质酸-多功能活性肽jm2可注射生物活性水凝胶组)。

如图9至图11所示，透明质酸-多功能活性肽jm2可注射生物活性水凝胶可抑制肿瘤细胞恶性增殖，促进组织修复。

本发明可注射生物活性水凝胶具有抑制肿瘤增殖、促进肿瘤细胞凋亡、减轻炎症、促进组织修复的能力，通过透明质酸-多功能活性肽jm2可注射生物活性水凝胶在皮肤肿瘤切除后至创伤修复的整个阶段持续缓慢释放接枝于透明质酸水凝胶材料的多功能活性肽jm2，在抑制肿瘤细胞恶性增殖、促进凋亡的同时，抑制细胞外atp释放，减少炎症细胞浸润，加速组织修复进程，在整个阶段发挥不同治疗作用。同时，制备得到的水凝胶材料具有可注射特点，可以填充不同形状的缺损。从而能更好地发挥同时抑制肿瘤复发和促进组织修复的联合治疗的效果。

在实际运用中，利用本发明可注射生物活性水凝胶材料能够在抑制肿瘤增殖、促进肿瘤细胞凋亡的同时减轻炎症、促进组织修复，其对肿瘤切除后的多阶段治疗具有良好的治疗效果。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。