一种利用拓扑结构调控免疫微环境并引导再生的仿生可降解人工神经导管及其制备方法与流程

本发明属组织工程领域，具体涉及利用拓扑结构调控免疫微环境并引导再生的仿生可降解人工神经导管及其制备方法。

背景技术：

我国作为人口大国，随着中国乃至世界经济的增长，生活质量的提高以及健康意识的增强，关于严重的创伤治疗以及慢性退行性疾病的医疗需求日益扩大。根据2018年《全国性健康数据报告》的数据显示：由于意外受伤、事故和其他关节创伤导致外周神经损伤而住院的患者人数占总住院治疗人数的9％，排名第三，仅位于呼吸疾病(12％)和消化道疾病(10％)。通过《国家重点基础研究发展计划(973计划)》披露的相关信息可知，世界外周神经损伤人数保守估计超9600万人。仅在我国，外周神经损伤治疗后仍存在功能障碍的患者超2000万人，且每年新增超200万人。可见，外周神经损伤后的治疗是十分常见的、充满挑战的全球性的临床难题。

不仅如此，外周神经损伤患者多为青壮年，往往是家庭经济来源的主要支柱，一人的疾病常常导致整个家庭的贫困，并且由于患者完全或部分丧失工作和独立生活能力，又需要家庭其他成员的照顾，这又进一步加重了疾病成本，造成本人及家庭的悲剧，给社会与家庭带来巨大的心理和经济负担。有效修复外周神经损伤、促进外周神经损伤的修复效果已经成为目前我国健康领域迫切需要解决的重大公共卫生问题，也是我国社会和经济发展的重大需求。

为了解决这一问题，现在临床上的修复手段主要为断端吻合，但是外周神经损伤后残端会倾向于收缩，这会导致神经残端之间的间隙过大，而这种方法只有在接合端无张力时才能实行，所以绝大部分患者并不适合直接进行这一手术操作，这就需要一段神经替代物来连接间隙，以引导神经纤维向外的生长。

现有的神经替代物主要包括三种，即自体神经移植物、异体或异种神经移植物、组织工程神经移植物。其中，自体神经移植物是指取病人自身其他位置的天然神经连接损伤神经的间隙，其虽被认为是修复外周神经缺损的“金标准”，却仍存在诸多问题：如自体神经移来源有限、供受体尺寸不匹配、会造成供区神经功能障碍、易形成创伤性神经瘤、会引发切口瘢痕等并发症、且增加了额外的麻醉和手术负担等，这些均极大地限制了其临床应用。

而异体或异种神经移植物则取自遗体捐献者或动物，其虽克服了来源问题，但其存在免疫排斥反应，生物相容性差的问题也极大地限制了其临床应用。

在这样的背景下，组织工程神经移植物应运而生。其由于生物相容性好、无抗原性、植入体内异物反应小、可控加工、桥接后管腔不易塌陷、可减少瘢痕干扰等诸多优势，成为了最具潜力的外周神经修复方式。

在现今的医疗市场上，部分组织工程外周神经移植物(如neuragen^tm，neuromatrix^tm，neuroflex^tm，neurawrap^tm，和neuromend^tm等)已经获得食品及药物管理局(fda)许可并上市。在已上市的产品中，可分为由天然高分子以及由合成高分子制备的两大类。其中，天然材料神经导管在缺血后存在管型塌陷、再生不良、吸收瘢痕组织增生及粘连、无法预计的免疫反应、免疫抑制、制作工艺的繁琐性、难以实现可控加工、难以长时间储存、活性维持差等诸多不足；而合成材料神经导管虽具有形貌高度可控、易加工成型、可防止瘢痕组织增生与粘连、可预计的免疫反应、性质稳定、可长时间储存的优点，但已上市的合成材料神经导管均存在缺乏仿生的拓扑引导结构且降解缓慢甚至不降解等问题。此外，生物材料植入体内后不可避免地会引起宿主的免疫反应，这种早期的免疫反应将影响后期组织重塑和再生效果。然而，过去的神经组织工程再生产品大都忽略了免疫系统的重要作用，这可能也是以往神经组织修复结果不令人满意的一个主要原因。通常修复材料在植入组织损伤部位后会经历三个相互重叠的时期：在第一个(炎症)阶段，炎症细胞迁移到损伤部位并吞噬坏死组织和凝块；在第二(修复)阶段，成纤维细胞在损伤部位增殖并合成和沉积细胞外基质成分，这其中也包括内源性干细胞的迁移，增殖和分化为组织特异性细胞；在第三个(重塑)阶段，新产生细胞外基质趋向天然排列，最终恢复天然形态和功能。其中早期炎症反应阶段是关键的时期，在迁移到损伤部位的各种类型炎症细胞中，已经证明巨噬细胞在炎症反应的不同阶段发挥重要作用，它可以响应植入材料的物理或生化信号并发生表型转换。不同表型的巨噬细胞对于下一阶段干细胞的迁移增殖和分化等行为具有直接调控作用，这些都最终会促进或妨碍组织再生。基于不同的激活因子、功能特性和表面标志物，已经证明了两个主要的巨噬细胞亚群。第一亚群(m1)可以被促炎因子激活，并且与细菌和细胞内病原体的免疫反应有关。第二群体(m2)(包括m2a，m2b和m2c)可以被抗炎因子诱导并且积极参与免疫调节和组织重塑。这些提示我们：可以通过控制神经材料的物理拓扑结构来调控修复部位的免疫微环境(巨噬细胞表型极化)进而促进神经组织重塑再生。

为此，迫切需要一款能够同时实现结构仿生、快速降解、调控免疫微环境以实现神经拟天然再生的新型组织工程外周神经导管，其必将提高广大外周神经损伤患者的康复效果与生存质量。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供用于引导再生的仿生可降解人工神经导管。解决现有已上市的神经导管产品中，缺乏仿生设计、降解速度与人体自身修复速度不匹配、无法激发自身重塑潜能的问题。

本发明公开了一种利用拓扑结构调控免疫微环境并引导再生的仿生可降解人工神经导管，包括外壳、内纤维，所述外壳采用降解时间为12-24个月的第一材料；所述内纤维采用降解时间为3-10个月的第二材料。设置目的在于，在神经修复过程中有瘢痕组织形成的风险，而第一材料在体内会在12个月以上的时间完成降解，可以对再生神经形成持续保护，防止周围成纤维细胞浸润形成瘢痕组织；损伤神经的内部神经干的再生需要3-10个月的时间，而第二材料在体内降解时间也恰好是在这一范围内，能够有效的配合神经修复。

优选地，所述第一材料采用左旋乳酸-己内酯共聚物(plcl，poly(l-lactide-co-caprolactone)。plcl完全降解时间为12-24个月，相对较长的降解时间，可有效防止植入神经导管周围成纤维细胞浸润形成瘢痕组织。

优选地，所述第二材料采用聚对二氧环己酮(pds，poly(p-dioxanone)。pds在体内降解时间为3-10个月，与神经细胞修复时间匹配度好，当完成其神经引导作用后，随即完全降解，有效避免了由于过慢的降解速度所导致的持续的空间位阻以及慢性炎症反应对神经再生的不利影响。

进一步地，所述内纤维采用高度取向的微米级拓扑引导结构，其可起到仿生引导作用，引导多种神经细胞以及其他组织细胞(包括雪旺细胞、神经元、轴突、内皮细胞等)沿其引导结构取向黏附、迁移与增殖。同时相比于纳米尺度，微米尺度的取向纤维在三维空间下具有不影响多细胞间的相互作用(包括细胞通讯、细胞分化、物质交换、能量代谢等)的优势，有利于使再生神经在结构与组成上与天然神经保持一致。所述内纤维能够对组织再生进程中的主要炎症细胞——巨噬细胞进行调控。相比无引导结构的神经导管，巨噬细胞黏附于高度取向的微米纤维后，由于其肌动蛋白骨架的取向伸长，从而极化为促组织再生的m2表型，进而分泌一系列促进组织再生的细胞因子、小rna、微囊泡等，进一步促进雪旺细胞的迁移与分化，并加快神经组织有序的功能再生。

进一步地，所述外壳采用无规则的纳米级拓扑结构，其较细的纤维直径可构成类似神经外膜的相对致密的细胞外基质结构，可以有效防止导管植入体内后，周围肌肉组织中成纤维细胞的浸润，从而防止粘连及瘢痕组织的形成。

进一步地，所述外壳采用无规则具有的孔径范围在4.80±1.22μm，具有良好的渗透性，在阻挡成纤维细胞浸润的同时，不会影响再生过程中再生神经细胞的营养的交换与物质传递，并且其具有良好的力学性质，可防止植入后的管型塌陷，且便于手术缝合。

进一步地，所述第一材料采用直径为500-10000nm的纤维制成。

进一步地，所述第二材料采用直径为1-100μm的纤维制成。

优选地，所述新型人工神经导管，包括外壳、内纤维，所述外壳采用无序拓扑结构的左旋乳酸-己内酯共聚物(plcl)纳米纤维，所述内纤维采用高度取向拓扑结构的聚对二氧环己酮(pds)微米纤维。

本发明还公开了利用拓扑结构调控免疫微环境并引导再生的仿生可降解人工神经导管的制备方法，包括如下步骤：

步骤1，制备外壳：采用第一材料利用静电纺丝法制备；

步骤2，制备内纤维：采用第二材料利用熔融纺丝法制备；

步骤3，装配所述外壳与所述内纤维，即得到产物。

优选地，所述步骤1按如下步骤完成：

步骤1.1，选取0.5-3g的plcl作为第一材料，与溶剂混合后在室温下搅拌过夜是指溶解，配制成浓度(溶质质量与溶剂体积比)为5-30g/ml的溶液；

步骤1.2，将直径为2-25mm不锈钢接收棒安装在静电纺丝机上并接地，将步骤1.1所述plcl溶液吸入到注射器中，将注射器安装在注射泵上，将注射器针头置于接收器前，使用高压直流电源在针头上加12-18kv电压；

步骤1.3，设定注射泵推进速度为1-8ml/h，接收棒转速为200-600rpm，纺丝时间为4-10min，制备完成后将其从静电纺丝仪上取下；

步骤1.4，将步骤1.3制备的产物置于真空干燥器中除去溶剂，完成后将管从接收棒取下即为神经导管外壳；

所述步骤2按如下步骤完成：

步骤2.1，选取5-30gpds作为第二材料，并添加到恒温加热料筒里，升温到110℃使pds充分熔融；

步骤2.2，将直径为4-15cm不锈钢接收棒安装在熔融纺丝仪上，设定料筒推进活塞速度为0.5-2ml/h，接收棒转速为100-300rpm，接收棒移动速度0.1-0.5mm/s，反应时间为30-60min；完成后将管从接收棒取下即为神经导管内纤维。

本发明的有益效果在于：

1、采用多层结构，内纤维降解速度与神经细胞修复速度相匹配；外壳降解速度与瘢痕组织生成周期相匹配，有效防止周围组织的浸润，防止形成瘢痕组织；

2、外壳有孔隙，不影响再生过程中神经细胞的营养的交换与物质传递，并且其具有良好的力学性质，可防止植入后的管型塌陷，且便于手术缝合；

3、外壳采用无规则拓扑结构材料，可构成类似神经外膜的相对致密的细胞外基质结构，其能够防止粘连及瘢痕组织的形成；

4、内纤维采用高度取向结构，能够引导神经细胞的生长，使再生神经在结构与组成上与天然神经保持一致；

5、内纤维采用高度取向结构，能够调控巨噬细胞极化为促组织再生的m2表型，进一步促进雪旺细胞的迁移与分化，并加快神经组织有序的功能再生；

6、pds与plcl均为已通过fda认证的生物医用材料，在体内降解产物为水和二氧化碳，对人体无潜在生物毒性。

附图说明

图1为本发明的结构示意图；

图2为神经内外层材料外观对比图(a为制备的plcl随机纳米纤维明场图；b为制备的pds取向微米纤维明场图；c为制备的plcl随机纳米纤维扫描电子显微镜图；d为制备的pds取向微米纤维扫描电子显微镜图)；

图3为神经导管制备及组装图(a为制备神经导管的示意图；b为神经导管制备完成后的明场图，其内纤维与外壳双重结构清晰可见；c为制备的plcl随机纳米纤维外壳的扫描电子显微镜图；d为图c在外壳加入pds取向微米内纤维后的扫描电子显微镜图；e为plcl随机纳米纤维外壳横截面的扫描电子显微镜图；f为pds取向微米内纤维的扫描电子显微镜图；g为图e的局部放大图；h为图c的局部放大图)；

图4为神经导管制备外层形状记忆特性表征(a为制备神经导管外层经压缩后可快速回弹；b为神经导管外层经撑张后可快速恢复；c为制备的多种尺寸的神经导管外层)；

图5为将雪旺细胞(最主要的神经基质细胞)种植于制备的膜支架培养不同时间后的细胞骨架染色图(a为雪旺细胞在plcl随机纳米纤维(randomplcl)以及pds取向微米纤维(orientedpds)上黏附6小时及12小时后的骨架染色图；b为雪旺细胞在plcl随机纳米纤维(randomplcl)以及pds取向微米纤维(orientedpds)上黏附1天、3天和5天后的骨架染色图；c为各时间点对应的细胞核型比统计结果；d为各时间点对应的雪旺细胞伸长比例；e为各时间点对应的雪旺细胞突触伸长长度)；

图6为将巨噬细胞种植于制备的膜支架培养24小时后的细胞骨架染色以及基因表达情况图(a为巨噬细胞在细胞培养板(tcp)、加入脂多糖(lps，用于模拟体内损伤后环境)的细胞培养板、加入脂多糖的plcl随机纳米纤维(randomplcl+lps)以及加入脂多糖的pds取向微米纤维(orientedpds+lps)上黏附24小时后的骨架染色图；b-e为巨噬细胞在四种培养条件下的促再生基因表达情况；f-h为巨噬细胞在四种培养条件下的促炎症基因表达情况)；

图7为将巨噬细胞表型极化后调控雪旺细胞迁移与分化情况图(a为巨噬细胞在transwell细胞迁移系统下室中，按照细胞培养板(tcp)、加入脂多糖(lps，用于模拟体内损伤后环境)的细胞培养板、加入脂多糖的plcl随机纳米纤维(randomplcl+lps)以及加入脂多糖的pds取向微米纤维(orientedpds+lps)上培养24小时后，对于上室雪旺细胞迁移影响图；b为对迁移情况的统计图；c为使用上述四种培养条件下巨噬细胞的条件培养基，对于雪旺细胞进行培养24小时后雪旺细胞分化状态图；d为对分化后雪旺细胞伸长比例统计图；e为对分化后雪旺细胞突触伸长长度统计图)；

图8为将神经导管移植sd大鼠坐骨神经3个月后组织切片组织学染色图，从左至右分别为：无引导结构的现有产品，本专利涉及的pds/plcl复合结构神经导管，自体神经反接(临床金标准)，未损伤天然神经(a为苏木素伊红染色图，b为快蓝染色，c为甲苯胺蓝染色(箭头指出为尼氏体)，d为比尔肖夫斯基染色)；cross代表横切，longitudinal代表纵切；

图9为将神经导管移植sd大鼠坐骨神经3个月后组织切片透射电镜(tem)以及免疫荧光染色图，从左至右分别为：无引导结构的现有产品，本专利涉及的pds/plcl复合结构神经导管，自体神经反接(临床金标准)，未损伤天然神经(a为髓鞘tem图(上为放大2500倍，下为25000倍)，b为髓磷脂蛋白染色，c为雪旺细胞染色，d为神经纤维染色)；cross代表横切，longitudinal代表纵切。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明使用的原料来源如下：

左旋乳酸-己内酯共聚物(poly(l-lactide-co-caprolactone)，plcl)：济南岱罡生物科技有限公司；

聚对二氧环己酮(poly(p-dioxanone)，pds)：sigmaaldrich(st.louis，mo，usa)；

plcl无规则纳米纤维：利用高压静电纺丝仪制备；

pds取向微米纤维：利用高温熔融纺丝仪制备。

本发明使用的检测设备如下：

高压静电纺丝仪(实验室自制)；

高温熔融纺丝仪(实验室自制)；

扫描电子显微镜(sem，quanta200，czech)；

透射电子显微镜(tem，hitachiht7700exalens，japan)；

冰冻切片机(leicacm1520，germany)；

石蜡切片机(leicaemuc6，germany)；

光学倒置显微镜(leicadm3000，germany)；

高级正置显微镜(zeissaxioimagerz1，germany)；

激光共聚焦显微镜(leicatcssp5，germany)。

实施例1

利用拓扑结构调控免疫微环境并引导再生的仿生可降解人工神经导管的制备方法，包括如下步骤：

步骤1，制备外壳：采用第一材料利用静电纺丝法制备；

步骤1.1，选取1g的plcl作为第一材料，与溶剂混合后在室温下搅拌过夜是指溶解，配制成浓度(溶质质量与溶剂体积比)为10g/ml的溶液；

步骤1.2，将直径为3mm不锈钢接收棒安装在静电纺丝机上并接地，将步骤1.1所述plcl溶液吸入到注射器中，将注射器安装在注射泵上，将注射器针头置于距离接收器15cm的位置，使用高压直流电源在针头上加16kv电压；

步骤1.3，设定注射泵推进速度为4ml/h，接收棒转速为400rpm，纺丝时间为5min，制备完成后将其从静电纺丝仪上取下；

步骤1.4，将步骤1.3制备的产物置于真空干燥器中除去溶剂，完成后将管从接收棒取下即为神经导管外壳；

步骤2，制备内纤维：采用第二材料利用熔融纺丝法制备；

步骤2.1，选取10gpds作为第二材料，并添加到恒温加热料筒里，升温到110℃使pds充分熔融；

步骤2.2，将直径为4cm不锈钢接收棒安装在熔融纺丝仪上，设定料筒推进活塞速度为2ml/h，接收棒转速为200rpm，接收棒移动速度0.5mm/s，反应时间为50min；完成后将管从接收棒取下即为神经导管内纤维

步骤3，装配所述外壳与所述内纤维，即得到产物。

实施例2-4

制备方式与实施例1相同，仅对制备参数进行调整。具体参数见表1-2。

表1实施例1-4所述外壳制备条件表

表2实施例1-4所述内纤维制备条件表

对于实施例1-4所得到的产物，进行了测试，测试结果如图2-9，可知本发明的产品可以达到引导神经导管再生的效果。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。