一种具有长效抑菌作用的表面改性氧化锆材料及其制备方法和用途与流程

本发明属于口腔种植体技术领域，具体涉及一种具有长效抑菌作用的表面改性氧化锆材料及其制备方法和用途。

背景技术：

自20世纪80年代以来，口腔种植临床技术迅速发展，已逐渐成为一种缺失牙的主流修复方式。种植修复的成功不仅取决于良好、稳定的骨结合，种植体颈部结构与周围软组织间的结合同样重要。种植体周围软组织附着于种植体颈部基台结构形成一圈封闭良好的“袖口”结构，成为一种功能性生物封闭屏障，可抵挡细菌及其他炎症因子的侵入而保持长期稳定的作用，减少种植体周围炎的发生。然而，种植体周围上皮关键结构的缺少、平行排列的胶原纤维、血液免疫的降低导致种植体周围软组织屏障与天然牙相比呈现较薄弱的状态。另一方面，口腔中存在大量致病菌，种植体植入后，这些细菌将快速占据种植材料表面，影响软组织与种植体的愈合。种植体初期因细菌影响造成的愈合不良将使形成的种植体软组织屏障更加脆弱。理想的种植体颈部基台结构表面应具有抑制细菌粘附及菌斑生成，并可维持一定的时间，在种植体软组织初期愈合的关键时期2周内起到抑菌作用。

目前临床尚无一种可主动产生杀菌、抑菌作用的种植基台。在种植体植入初期愈合过程中，目前采取的做法是：嘱患者2周内使用抑菌漱口水进行口腔清洁，并同时辅助应用口服抗生素。除了操作不便以外，上述方法还存在很多缺点：局部漱口水清洁不能产生长效的抑菌作用，随着唾液分泌，漱口水浓度减少，抑菌效果减弱。部分常见漱口水(如氯己定等)有一定副作用，可能导致患者味觉下降、舌苔着色。口服抗生素作用广泛，并不局限于口腔种植术后创口，因此作用不精准，口服抗生素不当可能引起全身菌群失调，并有可能产生抗生素耐药。

氧化锆是一种生物相容性良好，机械性能稳定且美观性好的全瓷材料，已在口腔修复的各个领域有了广泛的应用。光滑的氧化锆表面相较于钛表面更有利于牙龈成纤维细胞的增殖，氧化锆材料凭借导电性低的优势较钛材料可减少菌斑的堆积，因此氧化锆作为基台材料应用于种植修复具有良好的前景。但除基台材料类型外，材料表面的特性同样将影响周围软组织结合。目前已有大量研究表明，通过改变氧化锆材料表面特性，可以赋予其表面抑菌能力，进而促进种植体的软组织结合。现有技术的相关研究主要集中在改性氧化锆材料的短期杀菌作用方面。例如，通过对氧化锆改性，使其表面附着有机抗菌剂，如抗生素、抗菌肽和氯己定等。但是，这种技术有其自身缺陷，具体可包括有限的抗菌谱及作用时间、耐药风险、与氧化锆表面结合强度不佳等，其加工难度较高，也难以长期持续地起到抑菌作用。

本发明人此前的研究发现，通过大气压冷等离子体射流，采用高纯氦气最长处理氧化锆种植基台90秒，最长培养72小时对口腔致病菌具有杀灭作用，但是随着时间延长，材料表面粘附细菌逐渐增加，提示有可能培养更长时间后，改性氧化锆材料的杀菌效果会不佳。需要指出的是，短期杀菌作用，并不能满足口腔种植体领域的临床需求，本领域需要的是获得一种表面细菌不易粘附，且能够抵抗细菌在材料表面生长的长效抑菌改性材料。此外，基于口腔种植体技术领域的普遍认知，随着唾液的分泌，种植体或基台表面的抑菌物质浓度会不断下降，导致抑菌效果会减弱，使得通常无法获得具有长效抑菌作用的种植体或基台。对氧化锆改性材料的研究也发现，改性后在氧化锆表面产生的活性氧自由基有衰减作用，将随着处理后时间的延长而减弱。因此，在现有理论知识水平的教导下，通常认为此类材料一般不具有长效抑菌作用，事实上现有技术中也不存在具有长效主动抑菌作用的口腔用表面改性氧化锆材料。

然而，本发明人克服了现有技术中存在的上述技术偏见，发现采用本发明技术处理氧化锆种植体或基台的表面后，氧化锆种植体或基台可获得长达14天的长效主动抑菌作用，并且本发明处理方法简便，只需要在临床种植基台放入前在椅旁进行一次处理即可。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供了一种具有长效抑菌作用的表面改性氧化锆材料及其制备方法和用途。本发明高效、经济、便捷，且采用本发明方法制备得到的表面改性氧化锆材料具有长效主动抑菌作用，填补了本领域的技术空白。

为达到本发明的目的，本发明采用了如下技术方案：

在第一个方面中，本发明提供了一种具有长效抑菌作用的表面改性氧化锆材料的制备方法，包括以下步骤：将氧化锆试件清洗后置于载物台上方，调整载物台高度，使氧化锆表面与大气压冷等离子体射流出口处距离为1厘米，将氧化锆试件中心置于冷等离子体射流中心，以惰性气体作为气体源，处理时间为30-90秒。

在一个实施方式中，所述惰性气体为氦气、氩气、氙气或其任意比例的混合气体。优选地，所述惰性气体为氦气。

在另一个实施方式中，所述处理时间为30秒、60秒或90秒。优选地，所述处理时间为60秒。

在一个优选的实施方式中，所述冷等离子体射流是通过将220v供给电压转化输出为17.0khz的高压交流电，击穿流经的惰性气体产生的。

在另一个优选的实施方式中，所述氧化锆试件为直径为15mm、厚度为1mm的圆形片状。

在进一步优选的实施方式中，所述清洗操作为：用蒸馏水冲洗后，将氧化锆置于无水乙醇中超声振荡20分钟，然后用去离子水超声振荡20分钟，清洗完成后将试件自然干燥。

在第二个方面中，本发明提供了一种具有长效抑菌作用的表面改性氧化锆材料，所述表面改性氧化锆材料是通过上文所述的本发明制备方法制备而成的。

在第三个方面中，本发明提供了一种本发明的表面改性氧化锆材料在制备具有长效抑菌作用的氧化锆口腔种植体或氧化锆口腔种植基台中的应用。

在一个实施方式中，所述长效抑菌作用的抑菌时间为至少7天。优选地，所述抑菌时间为至少14天。

在另一个实施方式中，所针对的菌种为变形链球菌和/或牙龈卟啉单胞菌。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

本发明提供了一种新型氧化锆表面改性方法，改性后的氧化锆表面可具有长效抑菌效果。本发明可使氧化锆主动产生抑菌效果，即细菌在表面的粘附、生物膜形成降低，而不是传统的短期杀菌作用。本发明的方法高效、经济、便捷。本发明处理后，抑菌效果可持续14天，比较持久，可以满足软组织初步形成自身屏障的需求。因此，在无需使用漱口水和口服抗生素的前提下即可大大降低种植体周围细菌感染的发生率，在降低维护成本的同时，提高了种植修复远期的成功率。

附图说明

图1：氧化锆表面变形链球菌活性氧激发结果(比例尺为20μm)。a.未处理组b.氦气大气压冷等离子体处理60s(he–cap60s)组c.阳性对照组。

图2：氧化锆表面变形链球菌粘附增殖情况。不同字母、不同上标表示p<0.05。

图3：氧化锆表面变形链球菌生物膜形成情况。不同字母、不同上标表示p<0.05。

图4：氧化锆表面变形链球菌扫描电镜结果(a-c×5.00k，d-f×10.0k)。a,d.未处理组b,e.he–cap60s组c,f.冷等离子体处理60s+活性氧清除剂组。

图5：氧化锆表面变形链球菌活/死荧光染色结果(比例尺为20μm)。a.未处理组b.he–cap60s组c.冷等离子体处理60s+活性氧清除剂组。

图6：氧化锆表面水接触角随时间变化情况。不同字母表示p<0.05，组间差异有统计学意义。

图7：x射线光电子能谱o1s分峰拟合结果。a.未处理组,b.基线组,c.1天,d.2天,e.3天,f.4天,g.5天,h.7天,i.10天,j.14天。

图8：变形链球菌粘附及增殖情况。不同字母表示p<0.05，组间差异有统计学意义。

图9：变形链球菌生物膜形成情况。不同字母表示p<0.05，组间差异有统计学意义。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。并且，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。

实施例1：冷等离子体流表面改性氧化锆材料的制备

本发明采用清华大学工程物理系等离子体健康科技研究组自主研发的新型笔式大气压冷等离子体射流装置。该装置通过介质阻挡放电原理，经过电压调节，将220v供给电压转化输出为17.0khz的高压交流电，击穿流经射流笔中的工作气体(例如，99.999％高纯氦气)而产生冷等离子体射流。通过控制面板，可连续调节电源的驱动频率、输出电压以及工作气体流量。该装置体积较小，射流笔及射流出口均包被了绝缘介质，因此便于移动操作，可安全应用于口腔材料的表面改性中。

使用该装置改性氧化锆表面。在开始处理之前，先将工作气体通入1分钟，以吹净电极间的余气。将氧化锆试件经清洗后置于载物台上方，调整载物台高度，使其表面与冷等离子体射流出口处距离为1厘米。将氧化锆试件中心置于冷等离子体射流的中心，处理较短的一段时间(例如，60秒)。

氧化锆试件为直径为15mm、厚度为1mm的圆形片状。清洗操作为：用蒸馏水冲洗后，将氧化锆置于无水乙醇中超声振荡20分钟，然后用去离子水超声振荡20分钟，清洗完成后将试件自然干燥。

表1大气压冷等离子体的示例性放电参数

实施例2：生物学性能测试

第一部分：实验材料和方法(一)细菌胞内活性氧激发情况检测

本研究使用活性氧检测试剂盒中的dcfh-da进行接种至氧化锆材料表面细菌胞内活性氧激发情况的检测。

其工作原理为：dcfh-da本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞后，可以被细胞内的酯酶水解生成dcfh。而dcfh不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的dcfh生成有荧光的dcf，并在激光照射下发出绿色荧光(ex/em＝485/525nm)。通过检测dcf的荧光以判定细菌胞内活性氧的水平。

具体操作方法为：先将dcfh-da装载至细菌内，使用指数生长期的变形链球菌菌液，向其中加入1ml配制好的dcfh-da工作液，在二氧化碳培养箱内孵育20分钟，随后使用离心机在3000×g速度下离心10分钟，并弃去上清液。加入0.1mol/l的pbs溶液冲洗并在相同转速下离心三次，以洗去未进入细菌内的dcfh-da。

将氧化锆试件分为三组，分别为：未处理组(阴性对照组)，氦气大气压冷等离子体处理60秒组(he-cap60s)，活性氧阳性对照组，每组三个平行样本。进行表面处理前，使用无水乙醇及去离子水超声荡洗氧化锆试件各20分钟，自然干燥备用。使用氦气大气压冷等离子体处理时，将氧化锆试件中心置于冷等离子体射流的中心，处理相应时间。使用75％酒精浸泡20分钟，随后使用0.1mol/l的pbs溶液冲洗三次，置于24孔板内，并于表面接种装载有探针的菌液，使其终浓度为1×10⁶cfu/ml，并在活性氧阳性对照组试件表面加入活性氧检测试剂盒中的阳性对照液(rosup，终浓度为5mg/ml)，避光置于二氧化碳培养箱中培养3小时后，吸去氧化锆材料表面液体，再次使用0.1mol/l的pbs溶液冲洗氧化锆试件表面三次，并使用激光共聚焦显微镜观察。(二)伴有活性氧清除剂的氧化锆表面细菌生长情况检测

本研究采用活性氧清除剂n-乙酰基-l-半胱氨酸(nac)与细菌共同在经氦气大气压冷等离子体处理的氧化锆表面培养，探索伴有活性氧清除剂时，氧化锆表面的变形链球菌生长情况。

其工作原理为：nac是l-半胱氨酸的前体药物，作为一种活性氧清除剂，其能将自由基还原为非自由基，从而清除细胞内产生过多的活性氧自由基，从而具有保护细胞和组织免受氧化损伤的作用。因此，本部分研究在经氦气大气压冷等离子体处理后的表面接种伴有nac的变形链球菌菌液，通过mtt法、场发射扫描电镜观察、活/死细菌荧光染色后经激光共聚焦显微镜观察，以获知材料表面细菌的粘附、增殖情况，并使用结晶紫染色法获知材料表面细菌生物膜形成的情况。

将氧化锆试件分为五组，分别为：未处理组(阴性对照)、氦气大气压冷等离子体处理60秒组(he-cap60s)、氦气大气压冷等离子体处理60秒+活性氧清除剂组(he-cap60s+nac)、阳性对照组(h2o2)、阳性对照+活性氧清除剂组(h2o2+nac)，每组三个平行样本。进行表面处理前，使用无水乙醇及去离子水超声荡洗氧化锆试件各20分钟，自然干燥备用。各组处理方法如下：

未处理组(阴性对照)：氧化锆表面直接接种终浓度为1×10⁸cfu/ml的变形链球菌菌液；

he-cap60s组：将氧化锆试件中心置于冷等离子体射流的中心，处理60s，随后在处理后的样品表面接种终浓度为1×10⁸cfu/ml的变形链球菌菌液；

he-cap60s+nac组：首先将0.1mol/l的nac工作液加入至变形链球菌菌液中，避光共培养2小时，随后将氧化锆试件中心置于冷等离子体射流的中心，处理60s，在处理后的试件表面接种含有nac的菌液，使菌液的终浓度为1×10⁸cfu/ml；

h2o2组(阳性对照)：将氧化锆试件置于24孔板中，加入过氧化氢溶液，使其终浓度为100μmol/l，随后在处理后的样品表面接种终浓度为1×10⁸cfu/ml的变形链球菌菌液；

h2o2+nac组：首先将0.1mol/l的nac工作液加入至变形链球菌菌液中，避光共培养2小时，随后在氧化锆试件表面加入加入过氧化氢溶液，使其终浓度为100μmol/l，在试件表面再接种含有nac的菌液，使菌液的终浓度为1×10⁸cfu/ml。

将上述方法接种后的氧化锆试件置于二氧化碳培养箱中培养24小时，随后采用mtt法测试细菌粘附及增殖量，并采用结晶紫生物膜染色法判断生成生物膜的总量。另采用场发射扫描电镜观察未处理组、he-cap60s组及he-cap60s+nac组的细菌粘附形态，采用活/死荧光染色后经激光共聚焦显微镜观察表面活死菌及死细菌的比例。

(三)大气压冷等离子体改性氧化锆表面的维持时间

氧化锆表面经过氦气大气压冷等离子体处理后，材料表面富含以羟基自由基团为代表的活性氧基团，这些自由基团往往具有衰减的性质，将随着处理后时间的延长而逐渐减弱。因此，本研究采用视频光学接触角测量仪、x射线光电子能谱仪测量大气压冷等离子体改性的氧化锆经存放后表面水接触角及表面化学成分组成的变化。

本部分实验分组如下：未处理组、处理即刻(基线组)、处理后1d组、处理后2d组、处理后3d组、处理后4d组、处理后5d组、处理后7d组、处理后10d组、处理后14d组，每组三个平行样本。各处理组均使用氦气大气压冷等离子体处理60秒后，于相应时间点进行测试。在未达到测定时间点时，各组试件均置于密闭容器中避光，放置于37℃恒温箱中保存。

到达测试时间点时，使用无水乙醇和去离子水将分别超声荡洗20分钟试件后，使用视频光学接触角测量仪进行表面水接触角的测定，并使用x射线光电子能谱仪对表面元素成分进行分析。

(四)氧化锆表面抑菌性能的维持时间

本研究关注氧化锆试件经氦气大气压冷等离子体处理获得表面抑菌性能后，该性能的维持时间。研究在经过氦气大气压冷等离子体处理后不同时间点的氧化锆表面接种细菌，并探究培养24小时后的抑菌效能。

实验分组如下：未处理组、处理即刻(基线组)、处理后1d组、处理后2d组、处理后3d组、处理后4d组、处理后5d组、处理后7d组、处理后10d组、处理后14d组，每组三个平行样本。各处理组均使用氦气大气压冷等离子体处理60秒后，于相应时间点进行测试。在未达到测定时间点时，各组试件均置于密闭容器中避光、放置于37℃恒温箱中保存。

到达测试时间点时，使用无水乙醇和去离子水将分别超声荡洗20分钟试件，干燥备用。各组试件在表面接种菌液前，均使用75％酒精浸泡20分钟，随后使用0.1mol/l的pbs溶液冲洗三次，移入生物安全柜中，并接种终浓度为1×10⁸cfu/ml的变形链球菌菌液，于二氧化碳培养箱中培养24小时后，采用mtt法定量分析各组表面细菌粘附量，同时使用结晶紫染色法定量分析材料表面生物膜形成总量。

第二部分：实验结果

(一)细菌胞内活性氧激发情况

使用活性氧检测试剂盒进行细菌胞内活性氧激发情况的检测，结果见图1。由图可见，活性氧阳性对照组可观察到被活性氧激发的绿色荧光细菌，统一调整扣减背景信号后，未处理组表面未观察到荧光细菌，而使用氦气大气压冷等离子体处理60s后的材料表面，染色细菌数量最多。以上结果意味着使用氦气大气压冷等离子体处理材料表面后再接种细菌，材料表面的活性氧基团可进入细菌胞内，引起细菌胞内活性氧水平增高。

(二)伴有活性氧清除剂的氧化锆表面细菌生长情况

使用mtt法测定的各组试件材料表面变形链球菌的粘附情况如图2所示。由图可见，经过24小时培养，氦气大气压冷等离子体处理后的氧化锆表面与加入过氧化氢溶液(阳性对照)的表面细菌粘附均较未处理组小；在加入活性氧清除剂nac后，两组对应材料表面细菌粘附量均较未加入nac组粘附量多。在48小时及72小时培养中，经氦气大气压冷等离子体处理后的氧化锆材料表面接种伴活性氧清除剂的菌液后，细菌粘附量值将与未处理组相当。这一结果表明，使用活性氧清除剂nac可减小材料表面细菌因冷等离子体处理或过氧化氢溶液带来的损伤与死亡。

使用结晶紫染色法测定各组试件材料表面变形链球菌菌斑生物膜生成情况如图3所示。由图可见，使用氦气大气压冷等离子体可减少材料表面细菌生物膜的形成，但通过加入活性氧清除剂后，细菌生成生物膜的能力大大提高，甚至在培养24小时后即超过了无处理组细菌生物膜生成量。使用过氧化氢作为阳性对照组，加入活性氧清除剂后所得到的结果与经氦气大气压冷等离子体得到结果的趋势相同。加入活性氧清除剂可增加细菌的成膜能力。

使用场发射扫描电镜观察未处理组、he-cap60s组及he-cap60s+nac组材料表面粘附细菌的形态结果见图4。培养24小时后，可见未处理组氧化锆材料表面有较多细菌，部分已形成菌斑生物膜的堆叠状态。在he-cap60s组中，细菌总量整体减少，且细菌较为分散。在he-cap60s+nac组中可观察到，材料表面的细菌较无nac组显著增多，且细菌联系紧密，相互堆叠在一起。

细菌活/死荧光染色后，使用激光共聚焦显微镜观察的结果见图5。由图可见，经过氦气大气压冷等离子体处理后，材料表面细菌总量减少、死细菌比例增加，而加入活性氧清除后，活细菌比例增加，且细菌大量生成细菌生物膜，甚至超过了未处理组，细菌总量大大增加。

(三)氧化锆材料表面理化性能随时间变化情况

图6展示了经过冷等离子体处理，氧化锆材料表面水接触角随时间的变化情况。由图可见，经过氦气大气压冷等离子体处理即刻，氧化锆表面水接触角值由80.45°±1.53°降低至43.46°±1.38°，并随着存放时间的延长，逐渐增加。至处理7天后，氧化锆表面水接触角均值升高至60.90°

±1.81°，至处理14天后，氧化锆表面水接触角升高至68.84°±3.48°，虽然随存放时间的增加，材料表面的亲水性逐渐减弱，但至14天时，表面水接触角仍小于未处理组。

使用x射线光电子能谱检测氧化锆材料表面碳、氧元素含量结果见表2。随放置时间的延长，氧化锆表面氧元素含量逐渐减少，碳元素含量逐渐增加。直至第14天时，氧化锆表面碳/氧元素比值达0.97，虽高于基线组的0.53，但明显小于未处理组的1.34。

表2氧化锆材料表面碳、氧元素含量随时间变化结果

材料表面元素o1s窄谱拟合结果见图7。由图可见，除未处理组外，其余各组均可检测到结合能为532.5±0.2ev的羟基自由基团峰值。在试件存放4天及5天时，表面元素分析o1s窄谱拟合还能检测到结合能为531.8±0.1ev的氢氧根基团峰值。7天窄谱拟合中，未能再次检出该峰值。至存放14天时，仍能在材料表面检测到羟基自由基团的峰值，意味着在存放14天后，材料表面仍有羟基自由基团。

(四)氧化锆表面抑菌性能的维持情况

本研究检测氦气大气压冷等离子体改性氧化锆表面后抑菌性能的维持时间。通过使用mtt法测定不同存放时间后氧化锆表面变形链球菌的粘附与增殖数量，及使用结晶紫染色法测定表面菌斑生物膜的生成情况，初步判断氧化锆表面抑菌效果。mtt法测定结果见图8，结晶紫染色结果见图9。由图可见，随存放时间延长，培养24小时后氧化锆表面细菌粘附量逐渐增加。存放1周后，氧化锆表面仍有有效抑菌作用。至存放14天时，虽然抑菌作用减弱，但相较未处理组表面，细菌粘附量、生物膜生成量的差异仍有统计学意义。该结果说明经氦气大气压冷等离子体处理并存放14天后，氧化锆表面仍有减少抑制变形链球菌粘附与增殖，减少生物膜形成的作用。

第三部分：实验结论

经过活性氧清除剂作用后，氧化锆表面理化性质无明显变化，但表面细菌生长及生物膜形成能力提高。活性氧介导的细菌凋亡是氦气大气压冷等离子体处理促进氧化锆表面抑菌的可能机制。氦气大气压冷等离子体处理60秒，随着时间的延长氧化锆表面抑菌能力逐渐下降，但是处理后14天，表面仍可检测到羟自由基的存在，并可保持一定抑菌作用。

综上所述，本发明提供的表面改性氧化锆材料具有良好的抑菌性能及生物相容性，且制备方法简便，利用其开发出的氧化锆种植体和氧化锆基台能够在体内形成良好的软组织结合和骨结合，可以持续发挥长效抑菌作用，从而在无需使用漱口水和口服抗生素的前提下即可大大降低种植体周围细菌感染的发生率，在降低维护成本的同时，提高了种植修复远期的成功率。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。