一种地榆提取物的制备方法及其在制备抗幽门螺杆菌药物中的应用与流程

本发明涉及生物医药
技术领域：
，特别涉及一种地榆提取物的制备方法及其在制备抗幽门螺杆菌药物中的应用。
背景技术：
：幽门螺杆菌(helicobacterpylori，简称hp)是一种呈螺旋状、微量需氧且感染性很强的革兰氏阴性杆菌。世界上约有一半人口被感染，我国大约有7、8亿人被感染。研究表明，hp感染与慢性活动性胃炎，消化性胃溃疡(pepticulcer,pu)，胃粘膜相关淋巴组织(mucosa-associatedlymphoidtissue,malt)淋巴瘤及胃癌等疾病均有关系。全国第五次关于幽门螺杆菌感染管理的共识报告中指出，hp感染是一种传染病，无论是否有临床症状，一旦感染就应该进行根除治疗。目前，临床上根除hp感染的一线治疗方案主要是以抗生素为基础的标准三联疗法和铋剂四联疗法，但随着抗生素的滥用，以及治疗方案中多种抗生素的大剂量、长时间使用，hp对常用抗生素(如克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星等)的耐药率逐渐升高，导致临床上对hp的根除率降低，标准三联疗法的根除率目前已低于80％。因此，寻找可抑制或杀灭耐药hp菌株的新疗法已成为临床治疗hp感染的重要任务之一。地榆作为一种中药材，在我国已有2000多年的用药历史，现代研究表明，地榆根茎中的药理活性成分主要包括鞣质和酚酸类、皂苷及其苷元类、黄酮类、甾体及其苷类等。研究表明，地榆水提鞣质或是70％乙醇提取鞣质对hp均有良好的抑制活性，可作为一种临床治疗hp感染的候选药物。传统的地榆鞣质提取工艺，是用煎煮法将地榆粉末放入水中进行煎煮，然后将煎煮后的滤液浓缩干燥即得到地榆鞣质水提取物。虽然该法提取鞣质的效率较高，易操作，但不利于地榆鞣质中儿茶素类缩合鞣质的提取，因为此类鞣质易被氧化、脱水缩合为不溶于水的“鞣酐”沉淀，反应温度愈高、时间愈久，形成“鞣酐”的分子量愈大，故使用该法需严格控制煎煮温度及时间，这也是临床上使用地榆煎煮液治疗hp感染疗效不稳定的原因之一。因此，在传统鞣质提取工艺的基础上加以改进，得到质量稳定可靠的地榆鞣质纯化物具有重要的临床应用价值；同时，采用工艺简单、可操作性强的初步纯化方法也利于后续产品从临床向工业大生产的转化。技术实现要素：为了克服上述现有技术的不足，本发明在传统地榆鞣质提取工艺的基础上，提出了一种地榆提取物的制备方法，采用该方法制得的地榆提取物中有效成分含量较高，且质量稳定、产率适中，对幽门螺杆菌的抑制效果优于水提物，具有治疗幽门螺杆菌感染的成药潜力。为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：本发明提供了一种地榆提取物的制备方法，该方法包括以下步骤：s1、往地榆中加水进行浸泡；s2、浸泡后，加热提取至少一次；s3、收集步骤s2的提取液，经浓缩后加入乙醇沉淀，最后过滤收集所得上清即得到地榆提取物(水提醇沉提取物)。目前，临床上治疗hp感染时采用地榆提取物主要为地榆煎煮液，但由于以水煎煮方式得到的地榆提取物中地榆鞣质的质量不稳定，导致疗效也不稳定，为克服上述问题，本发明在传统地榆鞣质提取工艺的基础上增加一步乙醇沉淀，通过控制加醇比例得到溶解于乙醇中的有效抗hp活性鞣质成分，同时除去了无抗菌活性的黏液质、多糖等成分，所制备得到的水提醇沉上清提取物水溶性良好，有效成分含量较高，3种鞣质类代表成分含量较水提物高好几倍，且质量稳定、产率适中，不受水提加热温度的影响，对于保证治疗hp感染疗效具有重要的价值。优选的，为更有利于有效抗hp活性鞣质成分溶于乙醇中，步骤s3中乙醇的加入方式为慢加快搅，乙醇的终含量为70％-75％。优选的，步骤s3中的提取液浓缩至密度为0.8-1.2g/cm3，更优选的，提取液浓缩至密度ρ为1g/cm3。优选的，步骤s3中加入乙醇沉淀后先置于4℃冷藏过夜再去沉淀收集上清。4℃冷藏过夜是为了使形成的黏液质多糖沉淀得更稳固，易于过滤除去，同时也保证水提醇沉上清中的成分稳定可控、溶解度均一。优选的，步骤s2中的加热方式为煮沸煎煮或80-90℃水浴浸泡,加热时间为1h。优选的，步骤s2中提取次数的判断标准为最后一次提取液的颜色呈淡黄色或浅橘色，即明显浅于初次提取液的深棕红色时可终止提取。具体的，水加热提取时重复提取次数为2-3次，煮沸提取时因加热温度高，故重复提取次数可为2次，80-90℃水浴浸泡未煮沸提取时重复提取次数为3次，进行重复提取时，向前次所得残渣中加入蒸馏水/二级水加热提取。优选的，步骤s1中地榆和水的料液比(g/ml)为1：8-12，浸泡时间为0.5-1h。优选的，步骤s1的地榆在加水浸泡前需进行粉碎处理，具体为过40目筛粉粹成药粉。本发明还提供了采用上述制备方法得到的地榆提取物。本发明还提供了采用上述制备方法得到的地榆提取物在制备抗幽门螺杆菌药物中的应用。采用本发明方法制备得到的地榆水提醇沉上清提取物中3种鞣质类代表成分含量较水提物高好几倍，在80μg/ml时即可显著抑制幽门螺杆菌的生长，且抑制效果优于水提物，具有治疗幽门螺杆菌感染的成药潜力。且本发明的地榆提取物可与临床上治疗hp感染的多种抗生素联合使用，具有实际应用价值。本发明还提供了一种抗幽门螺杆菌药物，包括采用上述制备方法得到的地榆提取物。优选的，所述抗幽门螺杆菌药物，还包括临床上用于治疗hp感染的抗生素。所述抗生素包括但不限于克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星、阿莫西林。经试验验证发现，采用本发明方法提取得到的地榆提取物可与临床上治疗hp感染的多种方案联合使用，具有实际应用价值。此外，上述药物还可以包括治疗hp感染上可接受的辅料，所述辅料包括常规的填充剂、稀释剂、粘合剂、赋形剂、吸收促进剂、填充剂、表面活性剂和稳定剂等。与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供了一种地榆提取物的制备方法，即在传统水煎煮法提取地榆鞣质的基础上增加一步水提醇沉步骤，通过控制加醇比例得到产率和成分稳定、不受水提加热温度影响、水溶性更好的地榆水提醇沉上清提取物，制得的地榆水提醇沉上清提取物中3种鞣质类代表成分含量较水提物高好几倍，在80μg/ml时即可显著抑制幽门螺杆菌的生长，且抑制效果优于水提物，具有治疗幽门螺杆菌感染的成药潜力，可以保证治疗hp感染疗效的稳定性；而且本发明方法提取得到的地榆提取物可与临床上治疗hp感染的多种方案联合使用，具有实际应用价值。附图说明图1为实施例1与对比例1的地榆提取物的高效液相色谱(hplc)图；图2为地榆水提醇沉提取物和水提物对hp菌株的体外抑菌-时间曲线(纵坐标od600为细菌吸光度值；横坐标为测量时间点；a代表地榆水提醇沉提取物；b代表地榆水提物)；图3为地榆水提醇沉提取物与4种临床治疗hp感染的常用抗生素的联合抑菌作用折线图(a代表地榆水提醇沉提取物；amo代表阿莫西林；clr代表克拉霉素；mtz代表甲硝唑；lef代表左氧氟沙星；fici为联合抑菌指数)。具体实施方式下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。实施例1一种地榆提取物的制备方法本实施例为本发明中所述地榆提取物的制备方法，具体实施步骤为：(1)先将地榆药材粉碎，过40目筛得到粒度均一的药材细粉，称取80g药材粉末，按照1：10的料液比(g/ml)加入800ml去离子水浸泡半小时；(2)使用电热套加热煮沸，煎煮1小时，重复提取2次；(3)合并提取液，将提取液的体积浓缩至290ml左右(ρ＝1g/cm3)；(4)取90ml提取液，经冷冻干燥得到地榆水提物，用于后续对比试验；(5)往剩余200ml提取液中加入600ml无水乙醇/95％乙醇，慢加快搅，室温静置半小时后放入4℃冰箱冷藏过夜；(6)次日，取出提取液室温放置半小时，过滤，弃去滤渣，得到水提醇沉上清，浓缩，冷冻干燥后得到地榆水提醇沉提取物，即地榆提取物。如表1的结果所示，本实施例中的地榆水提物的产率为36.0％，水提醇沉提取物的产率为16.6％；如表2的结果所示，采用上述方法制得的地榆水提醇沉提取物中，3个主要的鞣质类代表成分含量相较水提物均有所提高。其中，儿茶素含量提高了2.49倍，鞣花酸含量提高了2.03倍。此外，与水提物相比较，地榆水提醇沉提取物的水溶解性更优，提取物溶于水后所得溶液澄清透明，利于后续口服液等多种制剂的生产与再加工。实施例2一种地榆提取物的制备方法本实施例为本发明中所述地榆提取物的制备方法，具体实施步骤为：(1)先将地榆药材粉碎，过40目筛得到粒度均一的药材细粉，称取50g药材粉末，按照1：10的料液比(g/ml)加入500ml去离子水浸泡半小时；(2)使用80-90℃水浴浸泡提取1小时，重复提取3次；(3)合并提取液，将提取液的体积浓缩至80ml左右(ρ＝1g/cm3)；(4)取30ml提取液，经冷冻干燥得到地榆水提物，用于后续对比试验；(5)往剩余50ml提取液中加入150ml无水乙醇/95％乙醇，慢加快搅，室温静置半小时后放入4℃冰箱冷藏过夜；(6)次日，取出提取液室温放置半小时，过滤，弃去滤渣，得到水提醇沉上清，浓缩，冷冻干燥后得到地榆水提醇沉提取物，即地榆提取物。如表1的结果所示，本实施例中的地榆水提物的产率为21.6％，水提醇沉提取物的产率为16.8％。通过实施例1和实施例2可以看出，采用本发明方法所提取得到的地榆提取物的产率不受水提加热方式、温度的影响，产率稳定在16％左右。表1地榆水提醇沉上清提取物的产率组别水提加热方式水提物产率(％)水提醇沉上清产率(％)实施例1电热套加热煮沸提取36.016.6实施例280-90℃水浴浸泡未煮沸提取21.616.8表2实施例1的地榆提取物中3个主要鞣质类代表成分的含量成分名称水提物含量(％)水提醇沉上清含量(％)没食子酸(gallicacid)0.821.27儿茶素(catechinicacid)2.656.60鞣花酸(ellagicacid)1.763.58对比例1一种地榆提取物的制备方法本对比例采用申请号为201810505138.5，名称为“一种地榆提取物及其制备方法与应用”的专利方法提取得到地榆提取物。对比例中的方法先利用一定浓度的乙醇对地榆药材进行提取，然后加入适量水进行沉淀，所得沉淀即为地榆提取物，产率较低。而本专利方法先对地榆药材进行水提取，然后加入适量乙醇进行沉淀，所得上清浓缩干燥后即为地榆提取物，该法是在临床使用的基础上进行改进，产率适中，水溶性好。为验证本专利方法与对比例的专利方法有明显区别，以实施例1的地榆提取物和对比例1的地榆提取物为检测样品进行高效液相色谱(hplc)，并对三种鞣质类成分的含量进行测定，分析本专利方法和对比例专利方法所得地榆提取物的成分差别。如图1的结果所示，实施例1所得的地榆提取物与按对比例1方法所得的地榆提取物的hplc图谱存在很大不同(两者进样浓度和进样体积均保持一致，图中每个小峰都代表一个或多个成分，相同保留时间下，色谱峰面积与成分含量呈正相关)，0-60min时，实施例1中极性较大的成分种类和含量都明显高于对比例1；而100min后，实施例1中极性较小的成分种类和含量都低于对比例1。同时，结合上述二者中的三种鞣质类成分的含量测定结果可知(表3)，由于鞣质类成分的极性较大，故实施例1中三种鞣质类成分的含量均高于对比例1。综上所述，与对比例1相比，采用本方法制备所得的地榆提取物的水溶性更好，鞣质类成分的含量更高，虽然二者都是对同一药材的提取方法进行优化，但因二者所用的提取方法不同，故所得提取物的成分也不同，后续产品的生产与应用也会有所不同。表3实施例1与对比例1的地榆提取物中3个主要鞣质类代表成分的含量成分名称实施例1对比例1没食子酸含量(％)1.270.11儿茶素含量(％)6.601.48鞣花酸含量(％)3.581.37实验例1地榆水提醇沉提取物和地榆水提物对幽门螺杆菌的抑制作用以实施例1制备得到的地榆水提物和水提醇沉提取物为试验样品，采用从美国模式培养物集存库(americantypeculturecollection)中购买的hp标准菌株atcc43504进行研究，将菌株复苏于含5％脱纤维绵羊血的哥伦比亚血平板上，放置于三气培养箱(esco，ccl-170/240l)，37℃、微需氧环境(5％o2、10％co2、85％n2)培养48-72h。取出传至第二代的菌株，用湿润的灭菌棉签刮下细菌至pbs中，调节菌悬液浊度为5×(105-106)cfu/ml，分别配制含160μg/ml地榆水提物和水提醇沉提取物的含药肉汤，并以不含药的肉汤作为生长对照组，按照菌悬液：含药肉汤/不含药肉汤＝1：1的体积比以每孔1ml的量接种于6孔板，然后放置于三气培养箱中，37℃、微需氧环境(5％o2、10％co2、85％n2)、150rpm下振荡培养，在0h、8h、12h、24h、28h、32h、36h、48h分别吸取100μl测量od600吸光度值，吸光度值越大代表细菌数量越多，结果如图2所示。如图2的结果所示，采用本发明方法制备得到的地榆水提醇沉提取物在80μg/ml时就能显著抑制hp菌株atcc43504的增殖，且抑制效果优于同浓度下的地榆水提物。实验例2采用本发明方法提取得到的地榆水提醇沉提取物对多个幽门螺杆菌菌株的抑制效果以实施例1制备得到的水提醇沉提取物为试验样品，采用从美国模式培养物集存库(americantypeculturecollection)中购买的hp标准菌株atcc43504、atcc700392(南京医科大学毕洪凯教授赠予)、鼠源菌株ss1和临床分离株cs01(上海理工大学刘菁教授赠予)、临床分离株lq2#(深圳伯劳特公司赠予)、临床分离株icdc11101(广州中医药大学黄萍教授赠予)。将各菌株复苏于含5％脱纤维绵羊血的哥伦比亚血平板上，放置于三气培养箱(esco，ccl-170/240l)，37℃、微需氧环境(5％o2、10％co2、85％n2)培养48-72h。取出传至第二代的菌株，用湿润的灭菌棉签刮下细菌至pbs中，调节菌悬液浊度为5×(105-106)cfu/ml，按二倍稀释法配制40-1280μg/ml药物浓度的含药肉汤(水提醇沉上清)，按照菌悬液：含药肉汤＝1：1的体积比以每孔100μl的量接种于96孔板，放置于三气培养箱中，37℃、微需氧环境(5％o2、10％co2、85％n2)、150rpm下振荡培养72h，以肉眼观察明显澄清时的药物浓度作为最小抑菌浓度(mic)，每次实验均以atcc43504作为质控菌株，克拉霉素的mic质控范围为0.0125-0.025μg/ml，mic值测定在3代内完成，结果如表3所示。如表3的结果所示，采用本发明方法制备得到的地榆水提醇沉提取物对多个hp标准菌株和临床菌株均有很好的抑制作用，mic值范围在80-320μg/ml，且对敏感株和耐药株均有相似的抑制作用，提示本发明中所述的地榆提取物有望成为治疗hp耐药菌株的候补药物之一。表3地榆水提醇沉提取物对多个hp菌株的最小抑菌浓度(mic)菌株耐药情况mic(μg/ml)atcc43504甲硝唑耐药160atcc700392/160ss1/160cso1克拉霉素耐药320lq2#左氧氟沙星/阿莫西林/克拉霉素耐药320icdc11101左氧氟沙星/甲硝唑耐药80实验例3采用本发明方法提取得到的地榆水提醇沉提取物与4种治疗hp感染的抗生素之间的相互作用以实施例1制备得到的水提醇沉提取物为试验样品，采用hp标准菌株atcc43504进行研究，将菌株复苏于含5％脱纤维绵羊血的哥伦比亚血平板上，放置于三气培养箱(esco，ccl-170/240l)，37℃、微需氧环境(5％o2、10％co2、85％n2)培养48-72h。取出传至第二代的菌株，用湿润的灭菌棉签刮下细菌至pbs中，调节菌悬液浊度为5×(105-106)cfu/ml，按二倍稀释法配制40-1280μg/ml药物浓度的地榆提取物(水提醇沉上清)，以相同方法配制不同浓度的抗生素(阿莫西林12.8-0.25μg/ml、克拉霉素0.25-0.008μg/ml、甲硝唑12.8-0.25μg/ml、左氧氟沙星12.8-0.25μg/ml)，按照微量肉汤棋盘稀释法将菌悬液：地榆水提醇沉上清：抗生素＝2：1：1的体积比以每孔120μl的量接种于96孔板，放置于三气培养箱中，37℃、微需氧环境(5％o2、10％co2、85％n2)、150rpm下振荡培养72h，以肉眼观察明显澄清时的孔为最小联合抑菌浓度，并根据以下公式计算联合抑菌指数(fici)。fici＝mic(联合给药的水提醇沉上清)/mic(单独给药的水提醇沉上清)+mic(联合给药的抗生素)/mic(单独给药的抗生素)。当fici≤0.5时提示协同效应，0.5<fici≤1时为部分协同效应，fici＝1时为相加效应，1<fici<4时为无关效应，fici≥4时为拮抗效应，结果如图3所示。如图3的结果所示，采用本发明方法制备得到的地榆水提醇沉提取物(即地榆水提醇沉上清)与克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星的联合抑菌指数(fici)值在0.5-1之间，呈现部分协同效应，与阿莫西林的fici为1，呈现相加效应；地榆水提醇沉上清与4种抗生素体外均无拮抗作用，提示本发明中所述的地榆提取物可与临床上治疗hp感染的多种方案联合使用，具有实际应用价值。以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。当前第1页12