环孢素A联合雷公藤红素在制备治疗肺癌药物中的应用的制作方法

本发明涉及生物制药技术领域，更具体地说是涉及一种环孢素a(cyclosporina，cysa)联合雷公藤红素在制备治疗肺癌药物中的应用。

背景技术：

肺癌是发病率与死亡率增长最快、对人类生命威胁最大的恶性肿瘤之一，已成为我国城市人口恶性肿瘤死亡原因的第一位。非小细胞型肺癌包括鳞癌、腺癌、大细胞癌，与小细胞癌相比其癌细胞生长分裂较慢，扩散转移相对较晚。非小细胞肺癌约占所有肺癌的80％，约75％的患者发现时已处于中晚期，5年生存率很低。深入了解肺癌致病因并发掘临床治疗合适药物具有重要意义。

凋亡分为内源性细胞凋亡和外源性细胞凋亡。内源性细胞凋亡途径，也称作线粒体途径，常在强烈的氧化应激和dna损伤等条件下被激活。bcl-2家族蛋白主要调节内源性细胞凋亡途径，家族成员既包括促凋亡因子(bad、bax、bid、bak等)，又包括抗凋亡因子(bcl-2、bcl-xl、bcl-w等)。这些蛋白定位于线粒体上，共同控制线粒体膜的通透性。该通路被激活后可导致细胞色素c和其他促凋亡因子从线粒体释放。在细胞质中，细胞色素c与apaf1形成复合物，随后招募并激活caspase-9与caspase-3从而启动细胞凋亡途径。外源性途径也称为死亡受体途径，信号从细胞外传导至细胞内，通过促凋亡配体与促凋亡受体的结合而促进死亡诱导信号复合物(deathinducingsignallingcomplex，disc)的形成，诱发细胞发生凋亡。

雷公藤红素(celastrol)，又被称为南蛇藤素，是提取于常见植物雷公藤、南蛇藤及独子藤等的一种醌甲基三萜类化合物。其分子式是c29h38o4，其分子量约为450.61。根据各种文献报道，雷公藤红素拥有多重显著有效的药理活性，如抑制炎症反应、抵抗肿瘤生长、抵制氧化应激、治疗肥胖及抑制不同类型神经退行性疾病(比如阿尔茨海默症、帕金森病、亨廷顿舞蹈病等)的病理进程。同时，在治疗过敏性哮喘、麻风反应、风湿性关节炎等其他自身免疫性疾病的过程中，雷公藤红素也拥有潜在的临床应用前景。

虽然雷公藤红素有着较好的药物活性，然而由于其表现在生殖系统、内分泌系统及消化系统的损害，尤其是血液系统及皮肤黏膜的损害限制了其在临床上肿瘤治疗的应用。但在低浓度下，雷公藤红素不易产生毒副作用，而其在诱导肿瘤细胞凋亡方面的显著活性正在不断得到实验的证实。因此在雷公藤红素及其制剂的使用中，应注意其剂量，提高用药安全性，降低其毒副作用，而与其他药物联合治疗便成为降低药物毒副作用、提高药效的重要手段之一。

因此，如何将其他药物与雷公藤红素联合应用，显著诱导癌细胞凋亡是本领域技术人员亟需解决的技术问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了cysa联合雷公藤红素在治疗肺癌的药物中的应用，利用非小细胞肺癌细胞为实验材料，着眼于肿瘤的死亡，深入研究不同浓度的cysa联合雷公藤红素诱导的细胞死亡的作用及分子机制，通过降低雷公藤红素的毒副作用，同时促进癌细胞死亡，从而对癌症的治疗提供理论基础及新途径。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

cysa联合雷公藤红素在制备治疗肺癌药物中的应用。

以上技术方案达到的技术效果是：cysa一般用作免疫抑制剂，抑制体内t细胞和b细胞的增殖和分化，同时，cysa具有抑制线粒体通透性转换孔的作用，通过与线粒体内部的亲环蛋白d结合，阻断亲环蛋白d与线粒体内膜的结合，从而抑制线粒体通透性转换孔的开放程度，试验证明，cysa和雷公藤红素均可以降低非小细胞肺癌细胞的活力，两者联用时，可以大大降低癌细胞的活性，具备协同增效作用，且可以消除雷公藤红素的副作用。

作为本发明优选的技术方案，在所述药物中，cysa的有效浓度为1-5μm，雷公藤红素的有效浓度为1-5μm。

作为本发明优选的技术方案，cysa联合雷公藤红素能够促进非小细胞肺癌细胞内ros的表达。

活性氧(ros)是机体代谢过程中，氧的部分还原产物。ros在生命活动中具有重要作用，低水平的ros有助于抑制炎症反应、促进细胞增殖。但高水平的ros可以促进抗肿瘤信号转导，并诱导肿瘤细胞衰老和死亡。由于肿瘤细胞需要维持较高水平的ros稳态，调控ros的抗癌疗法具有潜在的应用价值，而cysa联合雷公藤红素可以促进ros的表达，因此，二者联用，可以有效激活抗肿瘤信号的转导，以此达到抗肿瘤的作用。

作为本发明优选的技术方案，cysa联合雷公藤红素能够促进非小细胞肺癌细胞内促凋亡蛋白bax的表达。

作为本发明优选的技术方案，cysa联合雷公藤红素能够促进非小细胞肺癌细胞内cleavedcaspase-3的表达。

作为本发明优选的技术方案，cysa联合雷公藤红素能够抑制非小细胞肺癌细胞内凋亡抑制蛋白bcl-2的表达。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明达到的技术效果包括：(1)将两种药物联合使用作用于非小细胞肺癌，药物组合物使用方式简单且药效较好，随着作用时间的延长，非小细胞肺癌细胞的增殖抑制作用增强；

(2)安全性高，副作用低，能够显著诱导癌细胞发生细胞死亡，降低肺癌细胞的存活率，且不会对机体的其它机能造成任何损害；

(3)成本低廉，适合大规模生产。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中cck-8法检测不同浓度的cysa对人非小细胞肺癌细胞活力的影响图；

图2为本发明实施例2中cck-8法检测不同浓度的雷公藤红素对人非小细胞肺癌细胞活力的影响图；

图3为本发明实施例3中cck-8法检测cysa和雷公藤红素同时处理对人非小细胞肺癌细胞活力的影响图；

图4为本发明实施例4中流式细胞术检测cysa和雷公藤红素同时处理对人非小细胞肺癌细胞内ros水平的影响图；

图5为本发明实施例5中观察cysa和雷公藤红素同时处理对人非小细胞肺癌细胞形态的影响图；

图6为实施例6中流式细胞术检测cysa与雷公藤红素同时处理对非小细胞肺癌细胞凋亡率的影响图；

图7为实施例7中westernblot检测cysa和雷公藤红素同时处理对非小细胞肺癌细胞凋亡调控蛋白表达的影响图；

图8-1为实施例8中体内指标实验检测cysa和雷公藤红素同时处理裸鼠心、肾、脾、肝、肺无毒副作用示意图；图8-2为对照组和处理组对小鼠血常规影响的对比图；图8-3为不同处理为肿瘤体积大小的影响示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

cck-8法检测cysa对人hcc827细胞活力的影响

1)实验仪器与材料

细胞培养箱(thermofisher)，elx-800酶标仪(biotek)，倒置显微镜(leicadmirb)，胎牛血清(biologicalindustries)，dmem(高糖)培养基(gibco)，cck-8(mce)，dmso(sigma)，cysa(bbi)，96孔细胞培养板(nest)，非小细胞肺癌细胞(hcc827细胞，中科院上海细胞所)。

2)过程如下：

将hcc827细胞以约7000个/孔的密度接种于96孔板中，在37℃、5％co2、含10％胎牛血清的dmem高糖培养液的细胞培养箱中培养。当细胞密度达到70-80％时，在100μl的培养基中加入梯度终浓度为0、1、2.5、5、10、20、40μm的cysa，以经dmso处理的细胞为阴性对照组，每种细胞设三个复孔。分别继续培养24小时后，倒置显微镜下观察其形态；然后，配置含10％cck-8的培养基，以换液的形式加入到每孔中，培养箱内孵育30min后测定od450nm，检测不同浓度的cysa对hcc827细胞活力的影响，结果如图1所示。

3)实验原理

cck-8试剂中含有wst-8(化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2h-四唑单钠盐)，其是一种类似于mtt的化合物，它在电子耦合试剂1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-methoxypms)存在条件下，可以被线粒体内的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲瓒产物formazan，生成的formazan数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析，细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。用酶标仪在450nm波长处测定其吸光值，甲瓒产物formazan形成的量与细胞数成正比。根据测得的od值，来判断活细胞数量，od值越大，细胞活性越强。

细胞存活率按下式计算：细胞存活率＝实验组od值/空白对照组od值×100％；数据统计以均数±标准差(x±s)表示，采用t检验。

由图1可知，随着cysa浓度的增加，hcc827细胞的生存率逐渐降低。结果说明cysa可以降低人hcc827细胞的生存率，且这种生存率呈浓度依赖性降低。

实施例2

cck-8法检测雷公藤红素对人hcc827细胞活力的影响

1)实验仪器与材料

细胞培养箱(thermofisher)，elx-800酶标仪(biotek)，倒置显微镜(leicadmirb)，胎牛血清(biologicalindustries)，dmem(高糖)培养基(gibco)，cck-8(mce)，dmso(sigma)，雷公藤红素(sigma)，96孔细胞培养板(nest)，hcc827细胞(中科院上海细胞所)。

2)实验步骤

将hcc827细胞以约7000个/孔的密度接种于96孔板中，在37℃、5％co2、含10％胎牛血清的dmem高糖培养液的细胞培养箱中培养。当细胞密度达到70-80％时，加入梯度终浓度为0、0.5、1、2.5、5、10、20、40μm的雷公藤红素，以经dmso处理的细胞为阴性对照组，每种细胞设三个复孔。分别继续培养24小时后，倒置显微镜下观察其形态。然后配置含10％cck-8的培养基，以换液的形式加入到每孔中，培养箱内孵育一定时间后测定od450nm。检测不同浓度的雷公藤红素对人hcc827细胞活力的影响，结果如图2所示。

3)实验原理:同实施例1

细胞存活率按下式计算：细胞存活率＝实验组od值/空白对照组od值×100％；数据统计以均数±标准差(x±s)表示，采用t检验。

由图2可知，随着雷公藤红素浓度的增加，hcc827细胞的生存率逐渐降低。结果说明雷公藤红素可以降低hcc827细胞的生存率，且这种生存率呈浓度依赖性降低。

实施例3

cck-8法检测cysa和雷公藤红素对人hcc827细胞活力的影响

1)实验仪器与材料

细胞培养箱(thermofisher)，elx-800酶标仪(biotek)，倒置显微镜(leicadmirb)，胎牛血清(biologicalindustries)，dmem(高糖)培养基(gibco)，cck-8(mce)，dmso(sigma)，cysa(bbi)，雷公藤红素(sigma)，96孔细胞培养板(nest)，hcc827细胞(中科院上海细胞所)。

2)实验步骤

将hcc827细胞以约7000个/孔的密度接种于96孔板中，在37℃、5％co2、含10％胎牛血清的dmem高糖培养液的细胞培养箱中培养。当细胞密度达到70-80％时，加入5μm的cysa和梯度终浓度为0、1、1.5、2、2.5μm的雷公藤红素，以经dmso处理的细胞为阴性对照组，每种细胞设三个复孔。分别继续培养24小时后，倒置显微镜下观察其形态。然后配置含10％cck-8的培养基，以换液的形式加入到每孔中，培养箱内孵育一定时间后测定od450nm。检测cysa和雷公藤红素同时处理对人hcc827细胞活力的影响结果如图3所示。

3)实验原理:同实施例1

细胞存活率按下式计算：细胞存活率＝实验组od值/空白对照组od值×100％；数据统计以均数±标准差(x±s)表示，采用t检验。

由图3可知，5μm的cysa和2.5μm的雷公藤红素同时处理hcc827细胞时，细胞死亡率呈雷公藤红素浓度依赖性升高。

由图1、图2和图3可知，cysa和雷公藤红素抑制细胞活力效果最突出的浓度为40μm，而将两者联合应用，cysa的浓度仅为5μm，雷公藤红素的浓度仅为2.5μm，说明，两者的联合应用，起到了预想不到的技术效果，大大降低了药物的浓度。

实施例4

流式细胞术检测cysa和雷公藤红素对人hcc827细胞内ros水平的影响

1)实验仪器与材料

细胞培养箱(thermofisher)，dcfh-da(sigma)，流式细胞仪facscalibur(bd),胎牛血清(biologicalindustries)，dmem(高糖)培养基(gibco)，dmso(sigma)，cysa(bbi)，雷公藤红素(sigma)，10cm细胞培养板(nest)，hcc827细胞(中科院上海细胞所)。

2)实验步骤

将hcc827细胞以约2×10⁶个/板的密度接种于10cm细胞培养皿，在37℃、5％co2、含10％胎牛血清的dmem高糖培养液的细胞培养箱中培养。当细胞密度达到70-80％时，加入5μm的cysa和2.5μm的雷公藤红素处理24h，以经dmso处理的细胞为阴性对照组，每种细胞设三个重复。处理完毕后用1×pbs轻柔洗涤2-3次。弃去pbs，加入8μl终浓度为10um的dcfh-daros探针稀释液。将细胞放回37℃、5％co2培养箱避光孵育。30min后弃去上清，然后用1×pbs轻柔洗涤2次，洗去多余的ros探针。再用1ml胰酶消化细胞，4℃800rpm离心3min。收集细胞后，用1×pbs轻柔洗涤1次，然后每个离心管加入500ul的1×pbs，用移液器重悬细胞后转移到bdcalibur流式上样管后，用流式细胞仪fl1通道检测dcfh-da染色阳性细胞。每例样本至少要检测10000个细胞，获得数据后结合流式细胞仪分析软件flowjo计算分析细胞内ros水平变化，并绘制ros分布图，结果如图4所示。

3)实验原理

dcfh-da(2,7－双氯荧光素蛋白乙酸盐)是一种可渗透细胞的非标记性的氧化敏感的荧光探针。dcfh-da(2,7－双氯荧光素蛋白乙酸盐)被细胞酯酶水解成2,7－双氯四氟双烷(2,7－双氯荧光蛋白，dcfh).而dcfh不能通透细胞膜，从而使探针被装载在细胞内。然后细胞内的活性氧可以氧化无荧光的dcfh而产生有荧光的dcf，从而以荧光强度判断细胞内ros的水平。此探针广泛用于检测细胞氧化还原反应。

由图4可知，5μm的cysa和2.5μm的雷公藤红素单处理虽可稍微提高细胞内ros水平，但cysa和雷公藤红素联合处理显著增加细胞内ros的水平。

实施例5

cysa和雷公藤红素同时处理对人hcc827细胞形态的影响

1)实验仪器与材料

细胞培养箱(thermofisher)，倒置显微镜(olympus)，胎牛血清(biologicalindustries)，dmem(高糖)培养基(gibco)，cck-8(mce)，dmso(sigma)，cysa(bbi)，雷公藤红素(sigma)，10cm细胞培养皿(nest)，hcc827细胞(中科院上海细胞所)。

2)实验步骤

将hcc827细胞以约2×10⁶个/皿的密度接种于10cm细胞培养皿中，在37℃、5％co2，含10％胎牛血清的dmem高糖培养液的细胞培养箱中培养。当细胞密度达到70-80％时，加入5μm的cysa和2.5μm的雷公藤红素，以经dmso处理的细胞为阴性对照组。分别继续培养24小时后，倒置显微镜下观察其形态。

倒置显微镜观察cysa与雷公藤红素同时处理对hcc827细胞形态的影响，结果如图5所示。

由图5可知，5μmcysa和2.5μm雷公藤红素同时处理细胞时，细胞形态明显改变，诱导细胞死亡。

结果说明，低浓度的cysa与低浓度的雷公藤红素联合处理hcc827细胞后，可以显著诱导癌细胞发生细胞死亡，降低肺癌细胞的存活率，从而达到治疗肺癌的效应。

实施例6

流式细胞术检测cysa与雷公藤红素联合处理对hcc827细胞凋亡率的影响

实验仪器与材料

细胞培养箱(thermofisher)，流式细胞仪facscalibur(bd)，annexinv-fitc细胞凋亡检测试剂盒(annexinv-fitcapoptosisdetectionkit)(bd)，rnasea(solarbio)，胎牛血清(biologicalindustries)，dmem(高糖)培养基(gibco)，dmso(amresco)，cysa(bbi)，6cm细胞培养皿(nest)，hcc827细胞(中科院上海细胞所)，电热恒温水槽(dk-8d型)。

实验步骤

将hcc827细胞以约1.0×10⁶个/板的密度接种于6cm细胞培养皿，在37℃、5％co2、含10％胎牛血清的dmem高糖培养液中培养。当细胞密度达到70-80％时，加入5μm的cysa和2.5μm的雷公藤红素处理24h，以经dmso处理的细胞为阴性对照组，每种细胞设三个复孔。流式细胞仪检测细胞分布情况：收集培养皿中全部hcc827细胞，包括贴壁的活细胞及漂浮的死细胞，4℃条件下1500rpm离心5min，再将hcc827细胞用pbs轻柔洗涤2-3次，并进行细胞计数，4℃1500rpm离心5min，弃上清液后收集1-5×10⁵个细胞。加入500μlbindingbuffer重悬细胞。加入5μlannexinv-fitc混匀后，加入10μlpropidiumiodide混匀，室温避光反应5-15min。在1h内用流式细胞仪检测，annexinv-fitc荧光信号通过fl1通道检测，propidiumiodide荧光信号通过fl2或fl3通道检测。每次检测时同时设置annexinv-fitc单阳性管、propidiumiodide(pi)单阳性管，用于确定荧光补偿数值及十字象限门的位置。染色后的细胞悬液用滤网过滤并收集至流式细胞仪检测管，启动流式细胞仪进行检测时，每例标本至少要检测10000个细胞，获得数据后由系统自带的cellquest软件并结合另一流式细胞仪分析软件flowjo计算分析细胞凋亡分布情况，并绘制细胞凋亡分布图，结果如图6所示。

3)实验原理

细胞凋亡是指细胞为维持内环境的稳定，有基因控制的细胞自主、有序的死亡模式。细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，在生物体的进化、内环境的稳定及抑制肿瘤增殖、恶化等过程中起着重要作用。细胞凋亡是一件主动过程，涉及一系列基因的激活、表达及调控等作用，如bcl-2家族、caspase家族、抑癌基因p53等。

annexinv-fitc细胞凋亡检测试剂盒是用fitc标记的重组人annexinv来检测细胞凋亡时出现在细胞膜表面的磷脂酰丝氨酸的一种细胞凋亡试剂盒。annexinv是一类广泛分布于真核细胞细胞浆内钙离子依赖的磷脂结合蛋白，参与细胞内的信号转导。annexinv选择性结合磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserin,ps)。ps主要分布于细胞膜内侧，即与细胞浆相邻的一侧。在细胞发生凋亡的早期，不同类型的细胞都会把ps外翻到细胞表面，即细胞膜外侧。ps暴露到细胞表面后会促进凝血和炎症反应。而annexinv和外翻到细胞表面的ps结合后，可以阻断ps的促凝血和促炎症反应活性。用带有绿色荧光的荧光探针fitc标记的annexinv，即annexinv-fitc，就可以用流式细胞仪或荧光显微镜方便而直接地检测到ps的外翻这一细胞凋亡的重要特征。碘化丙啶(propidiumiodide，pi)是一种核酸染料。它不能透过完整的细胞膜，但可以染色坏色细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整性的细胞，呈现红色荧光。对于坏死细胞，由于细胞膜的完整性已经丧失，annexinv-fitc可以进入到细胞浆内，与位于细胞膜内测的ps结合，从而也使坏死细胞呈现绿色荧光。因此将annexinv与pi匹配使用，可将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

实施例7

westernblot检测cysa和雷公藤红素联合处理对hcc827细胞凋亡调控蛋白表达的影响

1)实验仪器与材料

细胞培养箱(thermofisher)，基础电泳仪电源(bio-rad)，电泳仪(六一)，转印槽(bio-rad)，胎牛血清(biologicalindustries)，dmem(高糖)培养基(gibco)，dmso(amresco)，cysa(bbi)，10cm细胞培养皿(nest)，hcc827细胞(中科院上海细胞所)，pvdf膜(rocheappliedscience)，bax(50599-2-ig，proteintech)，bcl-2(12789-1-ap，proteintech)，cleavedcaspase-3(9661，cst)和β-actin(20536-1-ap，proteintech)，兔二抗gtanti-rb/hrp(kirkegard&perrylaboratories)。

2)实验步骤

将hcc827细胞以约2.0×10⁶个/皿的密度接种于10cm细胞培养皿，在37℃、5％co2、含10％胎牛血清的dmem高糖培养液中培养。当细胞密度达到70-80％时，加入5μm的cysa和2.5μm的雷公藤红素处理24h，以经dmso处理的细胞为阴性对照组，每种细胞设三个复孔。收集hcc827细胞后提取总蛋白，进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺(sds-page)电泳分离，然后转印蛋白至聚偏二氟乙烯(pvdf)膜上，5％脱脂奶粉封闭1h后，4℃孵育一抗过夜，检测细胞周期调控相关蛋白bax、bcl-2和cleavedcaspase-3的变化情况，采用β-actin作为内参，以tbst漂洗后加入二抗常温孵育1h后，再经tbst洗涤3次，最后使用化学发光剂ecl发光液显色，在化学发光成像系统中显影，结果如图7。

3)实验原理

westernblot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。sds-page可对蛋白质样品进行分离，转移到固相载体——聚偏二氟乙烯膜(pvdf)上。固相载体可以吸附蛋白质，并保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。转移后的pvdf膜就称为一个印迹(blot)，用蛋白溶液(如5％脱脂奶粉溶液)处理，封闭pvdf膜上的疏水结合位点。用目标蛋白的抗体(一抗)处理pvdf膜——只有待研究的蛋白质才能与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，这样清洗除去未结合的一抗后，只有在目标蛋白的位置上结合着一抗。用一抗处理过的pvdf膜再用标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠igg的抗体。处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。

由图7可知，cysa和雷公藤红素联合处理可显著增高细胞促凋亡蛋白bax和cleavedcaspase-3的表达，并降低凋亡抑制蛋白bcl-2的表达。以上结果证明，cysa和雷公藤红素联合处理能够通过诱导凋亡相关蛋白的表达来抑制hcc827细胞的增殖。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

实施例8

从华富康(中国北京)公司购买雄性裸鼠(5-6周)，并喂以标准的动物饮食和水。将hcc827细胞与matrigel基质胶以1：1的比例混匀。在裸鼠的右后腿皮下接种细胞。每天一次通过腹腔内注射环孢素a或/和雷公藤红素治疗小鼠。测量体重和肿瘤体积。在治疗21天后对小鼠实施安乐死，并摘取肿瘤和主要脏器，利用福尔马林固定或速冻保存。将心、肝、脾、肺和肾等脏器进行he染色，由图8可知，环孢素a和雷公藤红素治疗对小鼠的主要脏器无明显毒副作用。并对裸鼠的血常规红细胞(rbc)、白细胞(wbc)、血红蛋白(hgb)、淋巴细胞(lym)等指标进行检测并未发现异常。另外，与单处理组相比，环孢素a和雷公藤红素联合治疗显著抑制了肿瘤的生长。