一种黑色素瘤相关抗原的单克隆抗体及其用途和药物组合物的制作方法

专利名称:一种黑色素瘤相关抗原的单克隆抗体及其用途和药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫学领域，具体地说，本发明涉及黑色素瘤相关抗原、黑色素瘤相关抗原的单克隆抗体及其用途。
背景技术：
恶性黑色素瘤是一种恶性程度很高的肿瘤，发生在头颈者约占全身的20％，主要发生于皮肤与腔、窦粘膜。人恶性黑色素瘤通常始于有害的黑痣，这些黑痣在辐射刺激后生长，形成破坏性的转移黑色素瘤。黑色素瘤极易向全身扩散，在临床上难以控制。化学治疗和放射性治疗通常对黑色素瘤不起作用。
目前，黑色素瘤免疫组织化学检测通常使用的抗体是HMB-45、抗S-100和NKI/C3(参见Smoller BR，PATHOLOGYState of the Art Reviews，2371-383，1994)。
HMB-45是一种已知的抗人黑色素细胞的单克隆抗体，它能识别前黑色素小体球蛋白，能够与黑色素瘤相关抗原gp-100反应。HMB-45还能作用于黑色素瘤、连接痣、纺锤状细胞和上皮细胞痣、先天痣等。然而，由于HMB-45缺乏高度的敏感性(其敏感性介于67％-93％之间)，在进行检测时会遗留一定量的黑色素瘤不易被检测出(参见Wick MR et al.，J Cutan Pathol 1988；15201-207；Ordonez NG et al.，Am.J.Clin.Pathol.1988；90385-390)。
S-100蛋白的抗体比HMB-45具有更高的敏感性(参见Nakajima T et al.，Cancer 1982；50912-918；Kindblom LG et al.，Acta.Pathol.Macrobial.Immunol.Scand.1984；92219-230)，但是它的特异性很差。抗S-100抗体可能附着到良性细胞上，如唾液腺和汗腺、骨骼肌和心肌、组织细胞、Schwann细胞、脂肪细胞、软骨细胞、星形胶质细胞、少突细胞(参见Stefansson K etal.，Nature 1982，29563-64；Stefansson K et al.，BrainRes.1982，234309-317)以及这些细胞产生的肿瘤(参见Tabuchi K et al.，Ac taNeurochir Wien 1982，65239-251)。抗S-100抗体还能附着到许多非黑色素瘤恶性肿瘤组织上(Drier JK et al.，Arch.Pathol.Lab.Med.，1987，111447-452)。
NKI/C3抗体也能作用于许多良性的或恶性的肿瘤，这种非特异性活性使NKI/C3抗体在黑色素瘤检测上的使用受到了很大的限制。
KBA.62抗体对于黑色素瘤的敏感性与HMB-45相似，但是它能够附着到鳞状细胞癌和基底细胞癌上，缺乏特异性(参见Cohen Knafo Eet al.，J Clin Pathol1984；37367-372)。
由此可见，虽然在国内外已经建立了许多针对黑色素瘤的单克隆抗体，但是这些单克隆抗体的特异性及中和能力均不够理想。因此，需要建立可以用于临床治疗的单克隆抗体以及人源化的高亲和力的单克隆抗体。

发明内容
本发明的目的在于提供一种黑色素瘤特异性的单克隆抗体SM5-1，它对应的抗原分子量为220-240KD。将石蜡包埋的黑色素瘤(初级黑色素瘤和转移瘤)和皮肤痣试样进行免疫组织化学染色，结果显示SM5-1能够作用于所有的痣和恶性黑色素瘤。另一方面，SM5-1不与非活化的表皮黑素细胞、非黑素肿瘤细胞、角化细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和外周神经细胞作用。这些结果表明SM5-1对于黑色素瘤是高度敏感和特异性的。
本发明的单克隆抗体已经在美国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏号为ATCC No.HB-12588。
本发明还涉及一种分离的、纯化的或合成的抗原，能够特异性结合SM5-1的抗体。本发明所述的抗原存在于所有人黑色素瘤细胞的细胞膜和细胞质中，包括但不限于痣、初级黑色素瘤细胞和转移黑色素瘤细胞。另外，用SM5-1检测发现，该抗原在正常非活化的人黑色素细胞中是不存在的，在其它肿瘤细胞中也不存在。
本发明的抗原可用于制备一种黑色素瘤疫苗，能够引起黑色素瘤的特异性免疫应答，从而预防和治疗黑色素瘤。可将黑色素瘤抗原加入到一种佐剂形成药物组合物。使用的佐剂包括但不限于弗罗依德氏完全和不完全佐剂、矿物胶、表面活化底物。
如本发明所用，“分离的”限定的是一种从天然状态(如细胞，胞外物质)分离的或合成的多肽(抗原或抗体)，已经从正常的天然环境中脱离开来。该分离的多肽是独特的，区别于纯化的、天然分离的多肽。“纯化的”限定的是一种不是完全纯的多肽，比天然状态相对纯。
本发明还涉及一种能够识别SM5-1抗体识别抗原的亲合分子。这些亲合分子包括但不限于抗体、肽和其它能够特异性结合抗原的聚合物，其中优选的亲合分子是单克隆抗体。本发明中不同的单克隆抗体可以识别不同的抗原决定簇。本发明中优选的单克隆抗体是纯化的、分离的。
作为本发明的一种优选的单克隆抗体具备的条件是(1)能够识别痣、初级黑色素瘤细胞和转移黑色素瘤细胞抗原；(2)不能识别正常的非活化黑色素瘤细胞抗原(即不能与其任何一种抗原结合)；(3)不能识别其它的任何肿瘤细胞(即不能与其任何一种抗原结合)。
本发明所述的抗体可以是任何一种免疫球蛋白，比如IgA、IgG、IgD、IgE、IgM及其亚类，此外也可以是完整的抗体或抗体片段，包括但不限于FAB、F(ab)2’、Fv。
另外本发明还涉及与本发明的抗体具有相同结合特异性的抗体衍生物，这些衍生物在其抗原结合非关键区域上有所变更。
本发明的单克隆抗体也可以与其他的分子连接，特别是标记物和毒素，包括但不限于酶(如过氧化物酶)、毒素(如蓖麻蛋白或霍乱毒素)、荧光素和放射性标记物。
单克隆抗体可以由本技术领域：
常规的细胞融合技术获得。抗体分泌细胞系也可以由融合技术以外的其它技术获得，比如用致癌的DNA、病毒直接转化B淋巴细胞。不同来源的抗原被用于激发正常的B淋巴细胞系，之后转变为无限增殖细胞系。比如，与SM5-1抗体发生免疫沉淀的抗原可作为免疫原刺激哺乳动物(如小鼠、大鼠、仓鼠等)。收集被抗原刺激的淋巴细胞，应用本技术领域：
公知的技术融合到无限增殖细胞，或者转化入无限增殖细胞系。可以通过选择能够与抗原发生强反应的克隆筛选抗黑色素瘤细胞抗体产物；也可以通过选择与SM5-1竞争性结合黑色素瘤细胞和/或其分离的或纯化的抗原的克隆来筛选抗黑色素瘤细胞抗体产物。
本发明涉及的细胞系优选的是杂交瘤细胞系，另一种优选方式是无限增殖细胞系。
本发明中的单克隆抗体和其他亲和分子可用于分离黑色素瘤抗原(参见Harlow and Lane，“免疫纯化”，第511-552页)。
本发明中的单克隆抗体和其他亲和分子还可用于分离黑色素瘤细胞。因而本发明还提供一种大量生产富含人黑色素瘤细胞的细胞群的方法，包括选择一种预计包含黑色素瘤细胞的组织细胞悬浮液，将细胞悬浮液与能够识别SM5-1抗体识别抗原的单克隆抗体(或其它亲和分子)共悬浮，然后从细胞悬浮液中分离结合了抗体的细胞。
人的黑色素瘤细胞和表达其它SM5-1识别抗原的细胞可以使用本发明的抗体，通过间接免疫技术从其它细胞中分离，所用的技术包括荧光激活细胞分离(FACS)技术和其它本技术领域：
公知的技术，比如将结合到细胞的抗体进行标记，用细胞分离设备分离带有标记的细胞。
另外，抗黑色素瘤抗体或其它亲和分子可以附着到固体支持物上，这些固体支持物是本技术领域：
公知的，包括但不限于琼脂糖珠、磁化珠、多聚苯乙烯、中空纤维膜和塑料有盖培养皿。可以结合到抗体上的细胞附着到固体支持物，因而从上清中得以分离出来。
本发明的单克隆抗体和其它亲和分子可用于筛选病人组织中的黑色素瘤样品，包括活组织检查样品、血液和其它体液样品。可使用免疫组织化学染色技术进行活组织样品的黑色素瘤检测。组织样品可保存于福尔马林或其它标准的防腐剂中，脱水并且包埋于石蜡，可将样品进行切片，固定在玻片上。切片试样也可以直接用冰冻组织制备。
除了活组织检查样品，本发明的单克隆抗体特异性黑色素瘤抗原也可以在组织样品中进行检测，采用的方法是本技术领域：
熟知的免疫学方法，根据生物样品的不同来源制备不同的待测试样。采用的分析技术可参见Harlowand Lane，免疫测定(471-510)和免疫印迹(552-612)。
本发明可用的标记物包括但不限于放射核素、酶、荧光素-猝灭剂复合物、化学发光素、磁性微粒、辐射不透性染料。这些标记物可通过许多共价结合连接基团或功能基团直接结合到单克隆抗体上。使用一些已知技术将抗原-抗体复合物固定到固体支持物(如微粒或容器壁)上，另外还采用ELISA、RIA、EIA(参见Frye et al.，1987)等技术进行测定。
本发明还涉及测定试剂盒，可以使用测定试剂盒进行包含单克隆抗体或其它亲和分子的黑色素瘤相关抗原的定量和定性分析。
在外科手术、化疗、放疗之前、之中和之后，可使用本发明的抗体和/或其他亲和分子检测体液(如血清)中黑色素瘤抗原水平，以测定出体内出现的肿瘤迹象及位置。
身患黑色素瘤的病人患次级肿瘤(比如肺癌)的可能性是非常高的(参见Swerdlow AJ et al.Int.J.Cancer 1995；61773-779)，因此对于黑色素瘤的分析和鉴定非常重要。由于SM5-1能够识别转移黑色素瘤，其对于黑色素瘤及转移瘤的分析和鉴定是非常有用的。并且通过使用SM5-1可以正确地检测黑色素瘤的起源。
本发明还涉及SM5-1单克隆抗体的重组蛋白，它们含有经过人源化改造的氨基酸序列，适合于在人体中高表达。
本发明的重组SM5-1可用多种方法制备而得，既可以如本发明所述由重组SM5-1编码核酸表达而得，也可以通过全化学合成获得。有关蛋白质或肽的制备在现有文献中多有记载，这些方法都适用于本发明重组SM5-1的制备。此外，蛋白质的鉴定也是本领域的常规技术，在现有文献中多有记载。因此，根据本发明给定的氨基酸序列，本领域技术人员不难结合现有技术获得本发明的重组SM5-1。
编码SM5-1重组蛋白的重组核酸可用多种方法获得，其中包括，以公开的天然序列为模板进行定点诱变；或根据本发明给定的序列进行全合成。这些都已是本领域的常规技术。而且，核苷酸序列的鉴定也是本领域的常规技术，在现有文献中多有记载。因此，根据本发明给定的核苷酸序列，本领域技术人员不难结合现有技术制备得到本发明的编码SM5-1的重组核酸。
本发明还提供一种载体，其中含有本发明的重组核酸。在本领域中，通过适当的克隆技术，将目的核酸片段插入合适的载体以实现保存、扩增和/或表达等目的，已是一般常规技术。合适载体的选择取决于克隆目的，载体容留，与宿主细胞的相容性，酶切位点等多种因素，本领域技术人员不难根据具体情况做出适当选择。可用以本发明的载体例如但不限于pUC18、pUC19、pUC57、pBluescript sk+/sk-。
本发明还提供含有重组SM5-1编码核酸的宿主细胞，例如大肠杆菌。对于大肠杆菌的基因工程操作在本领域内已相当成熟。例如，按照标准技术，通过常规转染、转化、微注射等多种方法都可将目的核酸导入宿主细胞，并结合常规筛检方法，可获得良好的再现性。
基于SM5-1对黑色素瘤细胞系的致死作用，本发明的单克隆抗体和其它亲和分子或重组蛋白可用于被动免疫黑色素瘤病人。因此，本发明还提供了一种包含一个或多个本发明的抗体或亲和分子的药物组合物。将药物组合物选择性地与药物载体、佐剂等结合，通过适当的给药途径施加于黑色素瘤患者。
如本发明所用，“药物载体”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。本发明所指的“药学上可接受的载体”应当与本发明的单克隆抗体相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物的效果。可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。
本发明的药物组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式例如可以采用灌注和其它治疗方式。
作为一种优选的方式是，被动免疫的抗体的单位剂量介于1-200mg范围，该单位剂量也可以多次地施加给黑色素瘤患者。单克隆抗体可以直接施加于黑色素瘤位置(参见Irie et al.，1986 Proc.Natl.Acad.Sci.USA，838694-8698)，也可以整体施加给患者(尤其是发生了转移的)。本发明的抗体可以单独施用于患者，也可以与毒素、放射剂或其它治疗手段共同使用。
黑色素瘤抗原可以包被在抗原递呈细胞(APC)上，也可以转染或脉冲进入APC，制备能刺激抗黑色素瘤细胞免疫应答或能预防黑色素瘤的细胞疫苗。这里的APC包括但不限于树突细胞、B细胞和巨噬细胞。也可将分离的黑色素瘤细胞与APC细胞融合来制备细胞疫苗。可以用细胞因子进行处理，以扩增细胞疫苗，该技术可参见PCT公开号为WO 97/16238的专利。
黑色素瘤抗原的抗体可以自身作为抗原产生单克隆个体遗传型特异性的抗体，抗个体遗传型多克隆或单克隆抗体可用于检测黑色素瘤抗原宿主上黑色素瘤抗体的存在与否，其中黑色素瘤抗原的抗体和被分析的体液(如血液、血清、尿液)必须来源于同一个体。抗个体遗传型单克隆抗体可用于测定人体液中黑色素瘤抗原水平。抗个体遗传型单克隆抗体可以由任何宿主，比如啮齿动物生产，优选的是大鼠或小鼠。抗个体遗传型单克隆抗体也可以是人源化的或人类抗体。
本发明的单克隆抗体还可用于筛选黑色素瘤抗原。可以使用哺乳动物细胞瞬时表达载体构建黑色素瘤A2058细胞株的cDNA文库并转染COS细胞，以黑色素瘤单抗SM5-1为探针对上述表达文库进行多轮筛选，并对筛选得到的阳性克隆进行序列分析和鉴定，获得相应的黑色素瘤抗原。



图1为结合了单克隆抗体SM5-1的黑色素瘤免疫组织化学染色图。其中图1A为痣细胞同源染色图，非活化的基础黑素细胞没有被染色。
图1B为黑色素瘤原位染色图。
图1C为黑色素瘤的表面分布染色图。
图1D为黑色素瘤转移到淋巴结的染色图。
具体实施方式
1.SM5-1抗体的制备从患者的初级黑色素瘤中采集黑色素瘤细胞系SMMU-1(参见Guo et al.，1994，Cancer Res.54561-1565)，将之免疫小鼠。接着小鼠用环磷酰胺处理去除活化的B细胞。将小鼠免疫从同一病人体内采集的转移黑色素瘤细胞系SMMU-2，用小鼠的脾细胞制备杂交瘤，杂交瘤的制备所涉及的技术是本技术领域：
的常规技术(参见Kohler G et al.，Eur.J.Immunol.1976；6511-519)。
2.组织标本的免疫组织染色SM5-1试样可以是冰冻的或包埋于石蜡的。收集SM5-1杂交瘤的上清，使用链酶抗生物素-生物素标记(LSAB)的方法进行免疫组织化学染色。简要地说，将样品与主要抗体共培养10分钟，接着与生物素化的连接抗体、过氧化物酶标记的链酶抗生物素和底物色原体溶液共培养。所有步骤中使用的SM5-1上清是经过稀释(1∶50)的。
黑色素瘤样品也用HMB-45(1∶50稀释)和S-100蛋白的单克隆抗体(1∶20稀释)染色。还选择了许多人黑色素瘤的样品进行试验，包括初级黑色素瘤和黑色素瘤转移瘤(皮肤、淋巴结等)。
准备相关组织，用缓冲的10％甲醛固定后，用石蜡包埋，然后用常规的组织学技术进行研究。
SM5-1对于非黑色素瘤样品和良性组织的反应活性列在表2和表3中。
HMB-45的染色方式是细胞质颗粒染色，而SM5-1的染色可以是细胞质，也可以是细胞膜，因此两种抗体识别的是细胞上不同的抗原。结果显示，对于黑色素瘤的反应，SM5-1比HMB-45具有更高的敏感性，比抗S-100抗体具有更高的特异性。
3.SM5-1能够识别恶性黑色素瘤和痣的抗原表1中显示了226个黑色素瘤和16个痣针对于SM5-1、HMB-45和抗S-100的免疫组织化学分析。不管是什么组织类型，所有的被试初级黑色素瘤和痣对于SM5-1的反应是阳性的，染色效果很强，并且涉及绝大多数的肿瘤细胞。采用细胞质和细胞膜的染色方式。初级黑色素瘤和转移瘤的染色强度和染色方式是相同的。
HMB-45能够检测到所有的初级黑色素瘤和痣，然而，83％的转移黑色素瘤HMB-45不能被染色。所有的HMB-45阴性黑色素瘤能被SM5-1染色。另外还发现，在被SM5-1和HMB-45共同染色的组织样品中，SM5-1和HMB-45的抗原决定簇存在于不同类型的肿瘤中，这表明SM5-1和HMB-45的抗原决定簇是不同的，而且它们表达在黑色素瘤组织样品的不同群体中。
4.SM5-1对黑色素瘤细胞系的致死作用在PRIM1640培养基中培养黑色素瘤A2058细胞株至106细胞/毫升。在96孔板的每个孔中加入20ul上述细胞悬浮液和不同量的SM5-1单抗(0，1，5，10，20，50，100ul；单抗溶于FCS PRIM1640培养基，浓度为1ug/ul)，每孔加入PRIM1640培养基至500ul。每个处理3次重复。在37度5％CO2培养箱中培养24小时后进行MTT反应，然后在显微镜下检查存活细胞数或者经过MTT反应后在酶标仪上读取570nm处的光吸收。
(1)细胞计数。从上述样品中取出0.2毫升进行细胞计数，结果以存活细胞百分数表示，具体数据如下SM5-1加入量 0 1 5 10 20 50 100(ul)细胞存活数 100.0 87.8 68.8 53.2 42.6 32.6 22.6
上述结果说明，SM5-1具有明显的杀伤黑色素瘤细胞的作用。(2)MTT检测取经过SM5-1处理的细胞0.2毫升，加入1/10体积浓度为5mg/ml的MTT溶液，37度培养30分钟后在酶标仪上读取570nm处的光吸收。结果发现，经过SM5-1处理的细胞比未经处理的对照光吸收明显降低。这说明SM5-1处理可导致黑色素瘤细胞的大量死亡。SM5-1加入量 0 1 5 10 20 50 100(ul)光吸收 100.0 96.3 84.9 66.2 47.7 33.6 20.1从上述两个检测结果可以看出，SM5-1具有明显的杀伤黑色素瘤细胞的作用，因此有可能在临床上用于治疗黑色素瘤。
5.SM5-1与黑色素瘤冰冻切片的作用36个黑色素瘤样品(包括17个初级黑色素瘤和19个转移瘤)分成2组，一组用石蜡包埋，另一组进行瞬间包埋(组织放于液氮中，用显微镜用薄片切片机(5μm)切割)，然后在低温下用SM5-1(1∶51稀释)染色。结果显示，所有的冰冻切片与石蜡包埋的方式取得的SM5-1染色效果是相似的。
6.SM5-1不能染色于非黑色素恶性肿瘤和人的正常组织为了检测SM5-1是否与其它恶性黑色素瘤发生交叉反应，本发明还对许多非黑色素瘤样品进行石蜡包埋，检测它们对于SM5-1的染色情况。被测试的肿瘤组织包括皮肤、脑、胃肠等，结果见表2，所有的待测样品染色结果都呈阴性。
在人正常组织中，除了能够与血浆细胞、外分泌腺分泌物、一些肌成纤维细胞和血管周围树突细胞发生微弱反应以外，大多数的正常细胞并不能与SM5-1反应。
7.SM5-1重组蛋白的制备1)从抗体库中筛选SM5-1的抗体可变区基因按照Marks等人J.Mol.Biol.，222，581-597；Hoogenboom和Winte，J.Mol.Biol.，227，381-388；Haidaris CG等，J Immunol Methods.2001 Nov1；257(1-2)185-202；Griffiths，A.D.等EMBO J.，13，3245-3260(1994)；Nissim，A.等EMBO J.，13，692-698(1994)中描述的方法构建人源抗体库。
将复苏的抗体库菌株1毫升加入新鲜LB培养基14毫升，于50毫升三角瓶中37℃培养16小时。
12000rpm高速离心10分钟，转移上清至一个无菌的50毫升离心管中，保存备用。其滴度应在2×1011以上。以纯化的黑色素瘤抗原为抗原，包被2 5毫升细胞培养瓶。在包被后的细胞瓶中加入不少于3×1010噬菌体颗粒，37℃温育1小时。然后，倒掉瓶中的液体，用10毫升加入了1％Tween-20的PBS洗涤培养瓶10次。在培养瓶中加入1毫升对数期的TG1细胞，37℃温育震荡培养16小时。
重复上段所述步骤共4次。
将上述获得的细胞稀释至100000细胞/毫升，然后在加入0.1％氨苄青霉素的1.5％琼脂平板上进行培养以获得单克隆。取上述平板上的克隆在96孔深孔板上进行培养，每孔一个克隆，共作960个克隆(10块96孔板)。将上述深孔板在96孔板离心机上5000RPM离心20分钟，将上清转移到新的无菌深孔板，封口后保藏于4度备用。
取96孔板10块，每孔中加入SM5-1(10微克/毫升)10微升常规包被后，分别加入上述保存的上清10微升，37℃温育1小时后用含有1％Tween-20的PBS洗涤20次。加入1微升HRP标记的羊抗M13单抗，37℃温育30分钟后用1％Tween-20的PBS洗涤10次。
加入含有0.025％DAB显色剂的PBS 200微升和1微升1％的H2O2，37℃温育显色20分钟后在读板机上读取595纳米处的光吸收。根据光吸收读数确定显色反应强的孔，这些孔相对应的克隆即为亲和力较强的抗体可变区克隆。
通过上述过程共筛选出415个阳性克隆，根据读数确定其中5个亲和力最强的克隆。将这5个克隆分别接种在100毫升LB培养基中，在37℃260rpm条件下震荡培养9小时后加入终浓度为1mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养10小时。然后分离纯化重组SM5-1抗体蛋白。抽提纯化的重组SM5-1蛋白质用于亲和力研究，找出具有最高表达量和最高亲和力的阳性克隆，用于后续的研究。
将上述阳性克隆的菌株在100毫升LB培养基中扩增，用Promega公司的质粒DNA抽提纯化试剂盒纯化质粒DNA。
用XbaI和NheI酶切上述质粒DNA后在1.5％琼脂糖凝胶电泳上分离酶切片段，取350bp左右的带进行胶回收，所得片段即为重链可变区编码序列。
用HindIII和Bsi WI酶切上述质粒DNA后在1.5％琼脂糖凝胶电泳上分离酶切片段，取320bp左右的带进行胶回收，所得片段即为轻链可变区编码序列。
然后首先将上述重链可变区编码序列插入到表达载体pMG18-3K(参见DEVELOPMENT OF TOOLS FOR ENVIRONMENTAL MONITORING BASED ON INCP-9PLASMIDS SEQUENCES.A.Greated，R.Krasowiak，M.Titok，C.M.ThomasSchool of Biological Sciences，University of Birmingham，Edgbaston，Birmingham B15 2TT，UK and Faculty of Biology，Dept of Microbiology，Belarus State University Scorina Av.4，Minsk 220080 Belarus)的Xba I/NheI位点中，再用Hind III和Bsi WI将上述抗体轻链可变区编码序列插入到插入有重链可变区编码序列的pMG18-3K的HindIII/Bsi WI位点中，构建成人源化抗SM5-1抗体基因的表达载体。
2)CHO细胞的转染与重组克隆的筛选上述步骤3)中构建的带有抗体基因的表达载体在大肠杆菌DH5α菌株接种于100毫升LB培养基中进行扩增，用Qiagen公司的超纯质粒DNA纯化试剂盒(Ultrapure Plasmid DNA Purification Kit)抽提纯化质粒DNA。将上述纯化的质粒DNA采用Invitrogen公司的脂质体法试剂盒转染CHO细胞，操作参照厂家的说明书进行。
转化的CHO细胞在选择培养基上进行连续9周的选择，最后在96孔板上进行极度稀释培养，连续进行3次，进行单克隆化。
挑出的单克隆细胞系在RPMI 1641培养基上进行培养，对上清进行Western印迹实验，根据染色反应判断表达强度，挑选出10个表达较强的克隆作为候选细胞株(见表1)。
上述单抗的纯化采用Protein A(Pharmacia公司)亲和层析柱从细胞培养上清中直接分离纯化，并用SDA-PAGE电泳证明，所得产物纯度大于90％。以上亲和层析的产物再次经过分子筛层析，获得了纯度＞98％的样品。将这些样品用于以下的进一步分析与研究。
3)抗体基因在CHO细胞中表达强度的研究将上述筛选得到的高表达候选克隆培养于10cm的组织培养皿中，采用ELISA法测量抗体的表达量羊抗人IgG(Fc)包被于ELISA板，4℃过夜，经2％BSA于37℃封闭2小时，加入待测的培养上清和标准品(人IgG1)，37℃孵育2小时，加入HRP-羊抗人IgG(κ)进行结合反应，37℃孵育1小时，加入TMB于37℃作用10分钟，最后用H2SO4终止反应，测A450值。测得上述10个候选克隆的表达量如下表1抗体基因在CHO细胞中表达强度细胞株编 3 5 4 5 6 3 4 4 5 6号 E9 D7 C6 H8 A6 B4 D8 F6 G7 G2表达量 1 1 3 3 4 3 3 1 2 1(ug/毫升) 16.7 28.9 66.7 43.2 08.6 72.1 32.1 76.4 31.4 46.9从上表可以看出，编号为4C6、5H8、6A6和3B4的细胞株的表达水平具有很高的表达水平(340-410毫克/毫升)，已经远远超出了国内外单抗类的表达水平(50-100mg/毫升)。
8.黑色素瘤抗原的筛选(1)构建黑色素瘤细胞株A2058的cDNA文库。
黑色素瘤A2058细胞用Trizol试剂提取总RNA，用Oligo(T)纤维柱层析法分离mRNA，用随机引物将提取的mRNA反转录为cDNA，补平后与BstXI酶切位点的接头相连，经BstXI酶切后克隆到哺乳动物瞬时表达载体pCDM8(Invitrogen)中，转化大肠杆菌MC1061/P3，构成cDNA文库。
(2)文库的表达和筛选。
将COS-7细胞铺到20个10cm的培养皿中，用以上构建的cDNA文库按lipofectin法进行转染，12小时后细胞用胰酶消化后重新铺于新的培养皿中，转染72小时，收集细胞重悬于含单抗SM5-1的PBS/10mM EDTA/5％FBS液中，冰浴1小时，细胞经洗涤后重悬于PBS/EDTA/0.5％FBS液中，将细胞分别铺到10个用羊抗鼠IgG二抗包被的分筛皿中，室温静置2小时后用PBS/EDTA/5％FBS液轻轻洗涤(将未与抗体结合的细胞去掉)，然后收集吸附在分筛皿上的细胞，采用Hirt法回收细胞中的质粒DNA，转化大肠杆菌MC1061/p3进行扩增重新构成一个新的cDNA文库。
将COS-7细胞铺到6个10cm的塑料培养皿中，用以上构建的新cDNA库lipofectin法进行转染，按照第一轮中的方法进行第二轮筛选，然后又得到一个新cDNA库。
经过4轮转染、表达、分筛和质粒回收，将最后一次用Hirt法回收的质粒转化大肠杆菌MC1061/P3后铺板，随机挑取多个单克隆扩增、抽提质粒，并分别用Lipofectin法转染COS-7细胞，转染进行12小时，细胞用胰酶消化后重新铺于新的塑料皿中，转染72小时后加入单抗SM5-1，并用FITC标记的羊抗人IgG二抗染色，最后在荧光显微镜下观察，鉴定出阳性克隆，同时用空载体转染的COS-7细胞作对照。(3)序列分析和阳性克隆的鉴定将得到的阳性克隆进行测序，并与国际基因库资料比较，确定为新基因。以cDNA序列推导出抗原的氨基酸序列分析其功能区域。
用Western Blot法进行阳性克隆的鉴定。将COS-7细胞、不表达抗原基因的COS-7细胞(经空载体质粒转染获得)、表达抗原基因的COS-7细胞(经阳性克隆质粒转染获得)和黑色素瘤细胞株A2058用高浓度SDS分别提取以上细胞膜蛋白，进行SDS-PAGE电泳，然后将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，硝酸纤维素膜经BSA封闭后依次加入SM5-1单抗、HRP标记的羊抗鼠IgG，最后用DAB显色，分析抗原基因的表达及抗原分子量大小。
用流式细胞仪分析抗原基因在哺乳动物细胞中的表达。将COS-7细胞铺到塑料皿中，用含10μg质粒按Lipofectin法进行转染，同时用空载体转染细胞作为对照。转染12小时时，用胰酶消化COS-7细胞并将其转移到一个新的塑料皿中，转染进行72小时时，收集细胞，洗涤后分别重悬于含黑色素瘤单抗SM5-1、A103和T311的PBS/EDTA/5％FBS液中，冰浴1小时。收集细胞，洗涤后重悬于含FITC-羊抗鼠IgG二抗的PBS/EDTA/5％FBS液中，冰浴1小时，PBS/EDTA洗涤转染细胞后用流式细胞仪进行分析。表1SM5-1、HMB-45和抗S-100与良性和恶性黑色素瘤的反应免疫组织化学染色黑色素瘤 SM5-1 NMB-45 抗S-100(阳性/待测样品) (阳性/待测样品) (阳性/待测样品)痣


黑色素瘤


表2SM5-1与非黑色素瘤(石蜡包埋切片)的反应活性肿瘤型 SM5-1免疫组织化学染色(阳性/待测样品)皮肤降突性皮肤纤维肉瘤 0/2梅克尔细胞瘤 0/1汗腺瘤 0/3sqnamous细胞瘤 0/4脑神经胶质瘤 0/1星细胞瘤 0/4少突细胞瘤 0/1脑膜瘤 0/3成胶质细胞瘤 0/2神经膜瘤 0/1胃肠道食道癌 0/2胃癌 0/2结肠癌 0/2胰腺癌 0/2其它支器官癌 0/1甲状腺癌 0/1胸腺癌 0/1前列腺癌 0/1卵巢癌 0/1肾癌 0/1平滑肌肉瘤 0/2M.paget 0/1血管平滑肌瘤 0/1血管肉瘤 0/3porocarcinoma 0/1膀胱上皮癌 0/1骨肉瘤 0/2总合 0/46表3SM5-1与正常组织、正常细胞、良性瘤的反应活性组织或瘤 SM5-1免疫化学染色阴性肾小球 -----纤毛上皮组织 -----Beaker细胞 -----Sebacious腺 -----肝组织 -----正常黑素细胞 -----角化细胞 -----胰岛细胞 -----外周神经 -----嗜中性粒细胞 -----平滑肌细胞 -----胃黏膜 -----室管膜细胞瘤 -----瘢痕瘤 -----活化的黑素细胞 -----微弱阳性活化的巨噬细胞 +肌成纤维细胞 +血浆细胞 +外分泌腺汗腺分泌物 +甲状腺分泌物 +
权利要求
1.一种能够特异性结合人黑色素瘤细胞抗原的单克隆抗体，其中抗原(a)能够被ATCC保藏号HB-12588的杂交瘤产生的抗体结合；(b)存在于人黑素细胞的膜和细胞质中；(c)不存在于正常非活化的人黑色素细胞和非黑色素细胞肿瘤细胞。
2.如权利要求
1的单克隆抗体，该抗体与ATCC保藏号HB-12588的杂交瘤产生的单克隆抗体相似。
3.如权利要求
1的单克隆抗体，该抗体是由ATCC保藏号HB-12588的杂交瘤产生的。
4.一种杂交瘤，能够生产权利要求
1的单克隆抗体。
5.一种杂交瘤，能够生产权利要求
2的单克隆抗体。
6.一种杂交瘤，能够生产权利要求
3的单克隆抗体。
7.一种分离的、纯化的抗原，其特征在于(a)能够特异性结合到ATCC保藏号HB-12588的杂交瘤产生的单克隆抗体上，(b)存在于人黑色素瘤细胞的细胞膜和细胞质中，(c)不存在于正常非活化的人黑素细胞和非黑素细胞肿瘤细胞。
8.一种检测黑色素瘤存在与否的方法，涉及(1)将样品与抗原特异性抗体结合，其中的抗原(a)能够被ATCC保藏号HB-12588杂交瘤产生的单克隆抗体结合，(b)存在于人黑素细胞的膜和细胞质，(c)不存在于正常非活化的人黑素细胞和非黑素细胞肿瘤细胞；(2)检测形成的免疫化合物，判断黑色素瘤细胞存在与否。
9.根据权利要求
8的方法，其中的组织样品是石蜡包埋的或冰冻的样品。
10.根据权利要求
9的方法，其中的单克隆抗体或单克隆抗体的第二抗体结合到一个可检测信号标记物上。
11.一种利用权利要求
1或2或3的单克隆抗体筛选抗原基因的方法，其特征在于，用哺乳动物细胞瞬时表达载体构建黑色素瘤细胞株的cDNA文库并转染宿主细胞，以黑色素瘤单克隆抗体为探针对表达文库进行筛选，获得阳性克隆。
12.如权利要求
11的方法，其特征在于，用哺乳动物细胞瞬时表达载体构建黑色素瘤A2058细胞株的cDNA文库并转染COS-7细胞。
13.一种权利要求
1的单克隆抗体的重组蛋白，其特征在于，含有经过人源化改造的氨基酸序列，能够在人体内高表达。
14.一种治疗黑色素瘤的药物组合物，其特征在于，它含有药学上有效量的权利要求
1或2或3所述的人单克隆抗体或权利要求
13所述的重组蛋白以及药学上可接受的载体。
专利摘要
本发明公开了一种新发现的能够识别黑色素瘤的特异性抗原的单克隆抗体，本发明还公开了该单克隆抗体在黑色素瘤细胞的分离、黑色素瘤的检测中的作用，本发明还涉及包含该单克隆抗体的药物组合物，其对于黑色素瘤的免疫治疗也是非常有用的，本发明还涉及该单克隆抗体的重组蛋白。
文档编号C12P21/02GKCN1443778SQ02111030
公开日2003年9月24日 申请日期2002年3月13日
发明者马菁, 王皓, 刘庆法 申请人:上海中信国健药业有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan