专利名称:T细胞免疫反应抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫学领域中ー种抑制剂，特别涉及ー种T细胞免疫反应抑制剂。
背景技术：
机体的免疫系统始终处在ー种复杂的调节过程中。免疫调节是指免疫应答过程中免疫系统内部各细胞之间、免疫细胞与免疫分子之间以及免疫系统与其他系统之间的相互作用，构成ー个相互协调、相互制约的网络结构，使免疫应答维持合适的强度，从而保证机体内环境的稳定。在外来病原物入侵后，免疫系统可以根据病原物的特点激活需要的免疫反应来抵御和清除病原物。免疫反应又分为体液免疫反应和细胞免疫反应。其中体液免疫反应是产生特异性抗体的反应，而细胞免疫反应是激活T细胞为主的免疫反应。提高机体 免疫カ的最主要的手段是接种疫苗。目前已有多种方法用来生产抗传染性病原体的疫苗，如灭活疫苗，减毒活疫苗、重组疫苗，亚单位疫苗和DNA疫苗等，它们的基本作用原理是相同的，即借助病原体的抗原物质在体内被免疫细胞识别而激发免疫反应，达到免疫个体不被传染性病原体感染的目的。但是，机体免疫力过强，也会产生副作用，如自身免疫疾病等。所以在外来抗原物质入侵时，机体会利用一整套免疫调节机制平衡免疫反应。人为的抑制免疫反应是用于治疗自身免疫疾病的手段之一。
T细胞免疫抑制是机体免疫功能的ー个重要环节，比如限制自身免疫疾病发生和机能性下调免疫反应。T细胞可以通过无共刺激分子存在情况下、通过T细胞为APC细胞刺激下或最近证明的胸腺来源的CD4+CD25+细胞与新生T细胞相互作用来实现其免疫抑制功能。多数自身免疫疾病均存在特异性的抗原受体，如系统红斑狼疮患者血液中，临床检查发现存在着抗DNA抗体，这种抗体与抗原形成了免疫复合物，沉淀在组织中引起周期性的炎症。又如在类风湿病(RA)患者的关节组织中，含有自身免疫反应性T-细胞，它能与某种未知抗原发生反应，这类T细胞通过T细胞抗原受体(TCRs)不仅可识别特定的抗原，也可识别主要组织相溶性分子(MHC)。因此，自身免疫反应的抗原受体通过早期识别，引发炎症，导致临床上系统红斑狼疮，类风湿关节炎等严重的自身免疫性疾病。
实验研究已确定了某些自身免疫疾病的抗原受体，如小鼠和大鼠动物模型中发生的NEB/NEW小鼠的红斑狼疮，实验性接种髓磷脂碱性蛋白(MBP)，过敏性脑脊髄炎(EAE)。
在小鼠红班狼疮中，采用抗特异性抗体(anti-ids)去除产生自身免疫反应的B细胞，达到治疗的目的，部分临床病例表明抗特异性抗体能明显缓解病症，但有些病例表明抗特异性抗体使病情恶化。同样在脑脊髄炎的治疗中，利用免疫TCR-衍生肽类对抗自身免疫反应的TCRs，结果有些病情得到了缓解，有些病情则进ー步恶化。
因此，利用免疫接种来治疗某些自身免疫疾病时，病人的免疫反应直接影响治疗的临床效果。若免疫接种导致产生抗体反应并形成抗Ids抗体，这些抗Ids可能会结合自身免疫反应中的B细胞或T细胞，引起体外调节性的溶解反应，达到临床上病情缓解的效果，相反，如果免疫反应导致体内清除抗-Ids,免疫反应物就会和自身免疫反应中的B-细胞或T-细胞结合，同时又交叉性地与它们的抗原受体结合，进ー步激发免疫细胞产生更多的自身免疫反应抗体(Abs)或T-细胞，使临床病情恶化。免疫接种激发和激活的大多数T-细胞，会同时引起不同类型的辅助T-细胞，如THl或TH2反应，可能会使原潜在自身免疫疾病病情恶化，或使病情缓解。因此，有效地治疗自身免疫疾病的免疫学方法尚需深入研究。
目前，在临床上通常使用的免疫抑制剂包括化学药品和抗体，其中，化学药品有普乐可复(FK506),环孢素A (CsA),骑悉(MMF),硫唑嘌呤(Aza),强的松(Pred),早基强的松龙(MP)等；抗体有抗淋巴细胞球蛋白(ALG)，抗CD4单克隆抗体(0KT4)等。但以上的免疫抑制剂都有其毒副作用，若使用不当，一方面可因过度抑制机体免疫反应性而引发多种并发症，另ー方面也可因其自身的毒副作用导致器官功能衰竭。
发明公开
本发明的目的是提供一种有选择性地抑制T细胞免疫反应的抑制剂。
本发明所提供的T细胞免疫反应抑制剂，包括针对病原体的核酸疫苗和该核酸疫苗所表达的蛋白质抗原；或包括针对病原体的核酸疫苗和该核酸疫苗所表达的蛋白质抗原的活性多肽；或包括灭活病原体和针对该病原体的核酸疫苗。
当所述T细胞免疫反应抑制剂包括独立包装或混合的针对病原体的核酸疫苗和该核酸疫苗所表达的蛋白质抗原时，所述T细胞免疫反应抑制剂中针对病原体的核酸疫苗和该核酸疫苗所表达的蛋白质抗原的质量比值可为2 I至10 1，优选为5 I。
当所述T细胞免疫反应抑制剂包括独立包装或混合的针对病原体的核酸疫苗和该核酸疫苗所表达的蛋白质抗原的活性多肽时，所述T细胞免疫反应抑制剂中针对病原体的核酸疫苗和该核酸疫苗所表达的蛋白质抗原的活性多肽的质量比值为I : 5至5 : I。
当所述T细胞免疫反应抑制剂包括独立包装或混合的灭活病原体和针对该病原体的核酸疫苗时，所述T细胞免疫反应抑制剂中灭活病原体和针对该病原体的核酸疫苗的质量比值为I : 2至I : 10。
所述T细胞免疫反应抑制剂还可包括免疫佐剂，如矿物油(注射用白油)。
所述核酸疫苗为含有蛋白质抗原编码基因的真核细胞表达载体。
所述真核细胞表达载体中，调控蛋白质抗原编码基因表达的启动子可为RSV(肉瘤病毒)、CMV(巨细胞病毒)和SV40病毒的启动子。
所述真核细胞表达载体可为质粒表达载体、病毒或噬菌体表达载体、质粒DNA与病毒或噬菌体DNA组成的表达载体、质粒DNA与染色体DNA片段组成的表达载体等基因エ程领域中常用的表达载体。
所述蛋白质抗原编码基因的DNA可以是人工合成的或者通过从微生物、真核及植物细胞或组织提取而来的双链DNA。
所述蛋白质抗原为人工合成的或者通过生物体生产的蛋白质。
所述蛋白质抗原的活性多肽为人工合成的或者通过生物体生产的。
所述生物体为在人工培养条件下可用于生产放大的大肠杆菌或芽孢杆菌或酵母菌或其它真核细胞生物。
所述灭活病原体是通过生物体分离和生产的病毒、病原菌、寄生虫及过敏物质经公知的方法灭活后而得到的无感染性病原体。
所述灭活病原体可直接与核酸疫苗混合或灭活病原体经与矿物油(注射用白油)乳化后再与核酸疫苗混合。[0024]所述T细胞免疫反应抑制剂可通过注射、喷射、ロ服、滴鼻、滴眼、滲透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。
图I为PCR扩增的FMDV VPI基因的I %琼脂糖凝胶电泳图谱
图2为对重组表达载体SuperY/VPl进行酶切鉴定的电泳图谱
图3为VPl基因表达产物的SDS-PAGE图谱
图4为Western-blot实验检测VPl蛋白的表达图谱
图5为检测pcD-VPl与146S抗原混合后性质变化情况
图6为T细胞免疫反应抑制剂免疫小鼠后产生抗体情况的ELISA检测结果
图7a为针对病原体的核酸疫苗和该核酸疫苗所表达的蛋白质抗原组成的T细胞免疫反应抑制剂对免疫小鼠T细胞特异性扩增的影响。
图7b为灭活病原体疫苗和针对该病原体的核酸疫苗组成的T细胞免疫反应抑制剂对免疫小鼠T细胞特异性扩增的影响
图8为灭活病原体疫苗和针对该病原体的核酸疫苗组成的T细胞免疫反应抑制剂共同免疫同一部位或単独免疫不同部位对免疫小鼠T细胞特异性扩增的影响
图9为pcD-S2和重组こ肝表面抗原S蛋白T细胞免疫反应抑制剂对免疫小鼠T细胞特异性扩增的影响
图10为T细胞活性抑制的量效关系柱状图
图11为比较T细胞免疫反应抑制剂对免疫小鼠白细胞介素水平的影响
实施发明的最佳方式
下述实施例中所提到的实验方法如无特别说明，均为常规方法；所提到的百分含量如无特别说明均为质量百分含量。
DNA的制备
ー种方法是将动物组织低温后粉碎，在苯酚氯仿溶液中去掉蛋白质，双链DNA经こ醇沉淀而分离出来。
另ー种方法是从植物组织中采用CTAB法提取DNA，在苯酚氯仿溶液中去掉蛋白质，双链DNA经こ醇沉淀而分离出来。
另ー种方法是从大肠杆菌中提取质粒DNA，在苯酚氯仿溶液中去掉蛋白质，双链DNA经こ醇沉淀而分离出来。
以上提取方法和技术的详细描叙可在Sambrook等人的"MolecularCloning"(第二版 1998, Cold Spring Harbor Laboratory Press,纽约)和厉朝龙等編，《生物化学与分子生物学实验技木》浙江大学出版社查寻。
蛋白质和多肽的制备
蛋白质和多肽可以通过标准的自动多肽合成仪(如ABI，433A等)合成，合成方法按仪器制造商使用方法；或从动物组织和细胞、植物组织和细胞或微生物中，按常规的蛋白质化学方法进行提取，也可以从基因工程表达菌或细胞中提取。这些多肽提取方法都是公知的，在 Doonan 的"Protein Purification Protocols" (1996,Humana Press,NJ)中有详细描叙。
病原物的制备及灭活
病原体通过生物体分离和生产的病毒、菌、支原体、寄生虫及过敏物质经公知的灭活方法和试剂如甲醛或福尔马林、丙内酷、N-こ酰こ烯亚胺以及ニこ烯亚胺等，灭活后而得到的无感染性病原体，再经分离纯化后而制成。
实施例I、牛ロ蹄疫(FMDV)VPl蛋白质抗原的制备
一、牛ロ蹄疫VPI的cDNA克隆
感染牛ロ蹄疫病毒的口腔病变组织，利用RNA提取试剂盒(购自上海生物工程公司)采用异硫氰酸胍ー步法按照试剂盒的说明提取病毒总RNA，具体步骤如下取病变组织破碎分离细胞，加入O. 5mL异硫氰酸胍溶液,O. 5mL的苯酹/氯仿/异戍醇(25 : 24 : I) 溶液，4°C 12000rpm离心5分钟，将上清液移至一新的I. 5毫升塑料离心管中，加等量的异丙醇，-20°C放置30分钟，12000rpm离心10分钟，弃去上清液，沉淀用70%こ醇清洗，沉淀干燥后溶于30 μ L DEPC处理水中，变性琼脂糖凝胶电泳检测结果表明得到病毒RNA。
在如下反应条件下合成第一链cDNA :2yg牛ロ蹄疫病毒RNA, 50mmol/LTris-HCl(ρΗ8· 3)，75mmol/L KCl，10mmol/L DTT，3mmol/L MgCl2,500 μ mol/L dNTPs,100 μ g随机六聚体引物，500单位MMLV反转录酶，总体积20 μ L，37°C保温lh。以第一链cDNA 产物为模板，在引物 I :5’ -AAGAATTCGGAGGTACCACCTCTGCGGGTGAG-3’ 和引物 2 :5’ -AATCTAGACCTCCGGAACCCAGAAGCTGTTTTGCGGG-3 ’，(在引物 I 和引物 2，分别引入 EcoRI 识别位点和XbaI识别位点)的引导下PCR扩增牛ロ蹄疫病毒VPl的cDNA。反应体系5 μ L第一链 cDNA产物，引物 I 和引物 2 各 10pmol，500mM KCl, IOOmM Tris-HCl (pH8. 4), I. 5mM MgCl2,100 μ g/mLBSA, ImM dNTPs, 2. 5U Taq DNA聚合酶，总体积为50 μし反应条件为94°C变性30秒，54V复性30秒，72°C延伸I分钟，共30个循环。PCR扩增的FMDV VPI基因的I %琼脂糖凝胶电泳检测结果如图I所示(泳道M为DNA Marker ;泳道I为PCR产物)，图中箭头所指为目的条带的位置，表明目的片段的大小为639bp，与VPl基因片段大小一致，用低熔点胶回收该扩增片段。
ニ、表达载体SuperY/VPl的构建与鉴定
用限制性内切酶EcoRI和XbaI酶切步骤ー获得的ロ蹄疫VPl cDNA片段，电泳，回收后，将VPl基因片段克隆入穿梭质粒SuperY(在购自美国Invitrogen公司的质粒pGAPZa的SphI和HpaI位点上加入卡那霉素抗性基因(Kanlr)得到SuperY)的EcoRI和XbaI酶切位点之间，再用EcoRI和XbaI限制性内切酶对重组载体进行酶切鉴定，将酶切产物进行I %琼脂糖凝胶电泳，检测结果如图2所示(泳道M为DNA Marker;泳道I为酶切产物)，其中的小片段大小为639bp，与VPl基因片段大小一致，表明VPl已正确克隆至SuperY上，并将该重组载体命名为SuperY/VPl，然后将SuperY/VPl转化大肠杆菌ToplO F'感受态细胞，筛选鉴定阳性克隆，对阳性克隆进行序列分析，结果表明扩增产物的核苷酸序列与VPl基因一致，并已成功克隆至SuperY质粒中。
三、VPl基因在酵母中的表达及其表达产物的检测
将步骤ニ构建的重组表达载体SuperY/VPl采用电击法转化酵母SMD1168，筛选鉴定阳性克隆，挑取单菌落30°C摇瓶培养48-96小时后(同时设酵母SMD1168和转化有SuperY的酵母SMD1168为对照)，取上清变性后进行SDS-PAGE电泳，经考马斯亮蓝G250染色后，用凝胶成像系统照相，结果如图3所示(泳道I :酵母SMD1168上清；泳道2 :转化有SuperY的酵母SMD1168的表达上清；泳道3 :转化有SuperY/VPl的酵母SMD1168表达上清；泳道M :低分子量蛋白标准)，由泳道3可知VPl的表达产物为两种，分子量分别为66kD和43kD，表明SuperY/VPl中的VPl基因在酵母细胞中获得表达。再将该重组表达载体SuperY/VPl的表达产物进行Western blotting分析,具体方法为将表达的蛋白变性后，用SDS-PAGE分离蛋白质，再将其电转移至NC膜，用5%脱脂牛奶作封闭剂，然后依次用牛抗ロ蹄疫病毒高免血清(购于新疆建设兵团兽医总站)、羊抗牛IgG-HRP酶标抗体(美国Sigma公司购买处)孵育，最后在DAB/H202下显色，结果如图4所示(泳道M :低分子量蛋白标准；泳道I :转化有SuperY/VPl的酵母SMDl 168表达上清；泳道3 :酵母SMDl 168上清；泳道4 :转化有SuperY的酵母SMDl 168的表达上清)，泳道I在66kD和43kD附近出现了特异性的显色帯，而泳道2和3均未出现条帯，表明表达的蛋白能与抗FMDV血清反应产生特异性反应带，表达的蛋白产物具有FMDV的免疫原性。表达的上清经脱盐纯化后保存在_20°C，可作为牛ロ蹄疫VPl蛋白疫苗，用于以下实施例。
实施例2、測定针对病原体的核酸疫苗和该核酸疫苗所表达的蛋白质抗原组合物 性质实验
用限制性内切酶EcoRI和XbaI酶切实施例I中的步骤ー获得的ロ蹄疫VPl cDNA片段，回收VPl基因，将真核表达质粒PCDNA3同样以EcoRI和XbaI酶切，用T4 DNA连接酶将VPl基因片段连接到pcDNA3 (购自Invitrogen公司)上，转化至大肠杆菌DH5 α感受态细胞，在平板上筛选具有氨苄青霉素(50yg/mL)抗性的菌落，提取质粒，酶切筛选鉴定正确克隆，得到含有VPl基因的重组质粒pcD-VPl。
为证明针对病原体的核酸疫苗和该核酸疫苗所表达的蛋白质抗原在混合后各自无性质上的改变，将等质量的pcD-VPl与146S抗原(去除牛ロ蹄疫O型灭活疫苗(购自兰州兽医研究所)中的矿物油，得到146S抗原)混合后置于37°C孵育24小时，经I %琼脂糖电泳，比较变化情況。结果如图5所示，表明pcD-VPl与146S抗原混合前后性质无变化。图中，泳道I和2是混合前的pcD-VPl，3和4是混合的pcD-VPl与146s的样品电泳后的情况，泳道5、6是混合的pcD-VPl和146s的样品经37°C孵育24小时后的情況，泳道7、8是混合的pcD-VPl和146s的样品并加入10单位DNA酶I (Sigma公司)经37°C孵育24小时后的情况，9是DNA Marker。
实施例3、T细胞免疫反应抑制剂免疫小鼠后产生抗体情况的ELISA检测
为验证由针对病原体的核酸疫苗和该核酸疫苗所表达的蛋白质抗原组成的T细胞免疫反应抑制剂、由灭活病原体和针对该病原体的核酸疫苗组成的T细胞免疫反应抑制剂免疫小鼠后对免疫系统中抗体免疫水平的影响，进行以下动物实验
将54只6-8周龄BALB/c (H_2d)雌性小鼠分为9组，每组6只。第一组肌肉注射含20微克牛ロ蹄疫O型灭活疫苗(购自兰州兽医研究所)100微升，第14天再以相同注射剂量加强免疫一次；第二组肌肉注射含20微克VPl蛋白的O. 9% NaCl水溶液100微升，第14天再以相同注射剂量加强免疫一次；第三组肌肉注射含100微克pcD-VPl的O. 9% NaCl水溶液100微升，第14天再以相同注射剂量加强免疫一次；第四组第一次肌肉注射含100微克pcD-VPl的O. 9% NaCl水溶液100微升，在第一次免疫后第14天注射含20微克牛ロ蹄疫O型灭活疫苗100微升；第五组第一次肌肉注射含20微克牛ロ蹄疫O型灭活疫苗100微升，在第一次免疫后第14天注射含100微克pcD-VPl的O. 9% NaCl水溶液100微升；第六组第一次肌肉注射含100微克pcD-VPl的O. 9% NaCl水溶液100微升，在第一次免疫后第14天注射含20微克VPl蛋白的O. 9% NaCl水溶液100微升；第七组第一次肌肉注射含20微克VPl蛋白的O. 9% NaCl水溶液100微升，在第一次免疫后第14天注射含100微克pcD-VPl的O. 9% NaCl水溶液100微升；第八组第一次肌肉注射含100微克pcD-VPl和20微克VPl蛋白的O. 9% NaCl水溶液100微升，第14天再以相同注射剂量加强免疫一次；第九组第一次肌肉注射含100微克pcD-VPl和含20微克牛ロ蹄疫O型灭活疫苗的混合溶液100微升，第14天再以相同注射剂量加强免疫一次。在第二次免疫后第15、35、50和72天取血清用ELISA法测定其抗体滴度，检测方法为将96孔酶标板用8ug/ml抗原包被，4°C过夜，3%小牛血清37°C封闭Ih ；PBST (O. 05% Tween20溶于PBS)洗涤3次，每次5分钟；加入不低于系列稀释的免疫动物(小鼠)血清，以未免疫的小鼠血清作对照，37°C孵育2小时；PBST洗板三次后，每孔辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG(ニ抗，Sigma, St. Louis) 100μ 1，37°C孵育I小时后弃去，PBST洗涤3次，每次5分钟；PBST洗三次，加入底物TMB液100 μ 1，室温显色反应30分钟，2Μ硫酸中止反应，用酶标仪测定OD45cia52ci光密度值，实验孔的OD值达到对照孔OD值的两倍时认为是阳性。结果如图6所示，表明由核酸疫苗pcD-VPl和pcD-VPl所表 达的蛋白质抗原VPl组成的T细胞免疫反应抑制剂、由牛ロ蹄疫O型灭活疫苗和pcD-VPl组成的T细胞免疫反应抑制剂免疫小鼠时，特异性抗体水平与其它组比较无明显变化。说明针对病原体的核酸疫苗和该核酸疫苗所表达的蛋白质抗原组成的T细胞免疫反应抑制剂、由灭活病原体和针对该病原体的核酸疫苗组成的T细胞免疫反应抑制剂免疫动物，在激活特异性抗体水平是无特别变化。图6中，每组从左至右依次为第二次免疫后第15、35、50和72天血清的ELISA結果。(图6中的横坐标具体表示免疫组)
实施例4、针对病原体的核酸疫苗和该核酸疫苗所表达的蛋白质抗原组成的T细胞免疫反应抑制剂对免疫小鼠T细胞特异性扩增的影响
将30只6-8周龄BALB/c (H_2d)雌性小鼠均分三組，第一组肌肉注射含20微克VPl蛋白的O. 9% NaCl水溶液100微升；第二组肌肉注射含100微克核酸疫苗pcD-VPl的0.9% NaCl水溶液100微升；第三组肌肉注射含100微克核酸疫苗pcD-VPl和20微克VPl蛋白的O. 9% NaCl水溶液100微升。第一次免疫后第14天再以同等剂量加强免疫一次，并于第二次免疫后第14天取脾脏T细胞測定其T细胞扩增活性，具体方法为在无菌条件下，取脾制成单个细胞悬液，用红细胞裂解液去除红细胞，然后用PBS液洗三次，离心并进行细胞计数，调整细胞浓度到I X IO6个/ml，将每组细胞悬液分4份加入96孔培养板中。其中ー份加入100 μ I Con A (有丝分裂原)至终浓度为5 μ g/ml，ー份加入相应的特异性抗原(VPl)作为刺激物至终浓度为2 μ g/ml，一份不加刺激物，ー份加入100 μ I BSA至终浓度为2 μ g/ml作为无关抗原，24小时后，每孔加入100 μ I MTT至终浓度为5mg/ml，48h后，姆孔加入100 μ I SDS-DMSO (20 % SDS溶于50 % DMSO, ρΗ2. O)，使其完全溶解，孵育4h后，在酶标仪上读取570nm处的OD值，计算刺激指数(SI =实验刺激数+非刺激数)。结果如图7a所示，表明含有核酸疫苗pcD-VPl和VPl的T细胞免疫反应抑制剂免疫动物，其T细胞扩增活性明显低于核酸疫苗组和VPl组，说明含有核酸疫苗pcD-VPl和VPl的T细胞免疫反应抑制剂可以特异性的降低T细胞免疫水平。图7a中，ConA表示阳性对照；BSA表示阴性对照，VPl表示第一组，pcD-VPl表示第二组；VPl+pcD-VPl表示第三组。[0064]实施例5、灭活病原体疫苗和针对该病原体的核酸疫苗组成的T细胞免疫反应抑制剂对免疫小鼠T细胞特异性扩增的影响
将50只6-8周龄BALB/c (H_2d)雌性小鼠均分五组，第一组肌肉注射含100微克核酸疫苗pcD-VPl和20微克146S抗原(去油的牛ロ蹄疫O型灭活疫苗，购自兰州兽医研究所)的O. 9% NaCl水溶液100微升；第二组肌肉注射含100微克核酸疫苗pcD-VPl和20微克牛ロ蹄疫O型灭活疫苗(购自兰州兽医研究所)的混合溶液100微升；第三组肌肉注射含20微克牛ロ蹄疫O型灭活疫苗100微升；第四组肌肉注射含100微克核酸疫苗pcD-VPl的O. 9% NaCl水溶液100微升；第五组肌肉注射含100微克核酸疫苗pcD-VPl和含20微克猪生殖呼吸综合症病毒(PRRSV)灭活病毒疫苗(购自哈尔滨兽医研究所)的混合溶液100微升。第一次免疫后第14天再以同等剂量加强免疫一次，并于第二次免疫后第14天取脾脏T细胞測定其T细胞扩增活性，具体方法为在无菌条件下，取脾制成单个细胞悬液，用红细胞裂解液去除红细胞，然后用PBS液洗三次，离心并进行细胞计数，调整细胞浓度到I X IO6个/ml，将每组细胞悬液分4份加入96孔培养板中。其中ー份加入IOOyl ConA(有丝分裂原)至终浓度为5 μ g/ml，ー份加入相应的特异性抗原(146S抗原)作为刺激物至终浓度 为2 μ g/ml，一份不加刺激物，ー份加入100 μ I BSA至终浓度为2 μ g/ml作为无关抗原，24小时后，每孔加入100μ I ] 1'1'至终浓度为511^/1111，4811后，每孔加入10(^1 SDS-DMSO(20%SDS溶于50% DMS0，pH2. O)，使其完全溶解，孵育4h后，在酶标仪上读取570nm处的OD值，计算刺激指数(SI =实验刺激数+非刺激数)。结果如图7b所示，表明含有核酸疫苗PcD-VPl和20微克牛ロ蹄疫O型灭活疫苗的T细胞免疫反应抑制剂和含有pcD-VPl核酸疫苗和146S抗原的T细胞免疫反应抑制剂免疫动物，其T细胞扩增活性明显低于核酸疫苗组或牛ロ蹄疫O型灭活疫苗组以及核酸疫苗pcD-VPl和灭活猪生殖呼吸综合症病毒疫苗组。说明其抑制T细胞扩增活性是抗原专ー性的。图7b中，1，为ConA表示阳性对照；2，为BSA非特异性抗原组；3，为pcD-VPl核酸疫苗和146S抗原疫苗共同免疫组；4，为pcD-VPl核酸疫苗和牛ロ蹄疫O型灭活疫苗共同免疫组；5，为牛ロ蹄疫O型灭活疫苗组；6，为核酸疫苗PcD-VPl免疫组；7，为pcD-VPl核酸疫苗和灭活猪生殖呼吸综合症病毒疫苗共同免疫组。
实施例6、灭活病原体疫苗和针对该病原体的核酸疫苗组成的T细胞免疫反应抑制剂共同免疫同一部位或単独免疫不同部位对免疫小鼠T细胞特异性扩增的影响
灭活病原体疫苗和针对该病原体的核酸疫苗组成的T细胞免疫反应抑制剂对免疫小鼠T细胞特异性扩增的影响
将60只6-8周龄BALB/c (H_2d)雌性小鼠均分为六组，第一组肌肉注射含100微克核酸疫苗pcD-VPl和20微克146S抗原(除去油的牛ロ蹄疫O型灭活疫苗抗原)的O. 9%NaCl水溶液组合物100微升；第二组在左腿肌肉注射含20微克牛ロ蹄疫O型灭活疫苗的0.9% NaCl水溶液50微升，右腿肌肉注射含100微克核酸疫苗pcD-VPl的O. 9% NaCl水溶液50微升；第三组肌肉注射含100微克核酸疫苗pcD-VPl和20微克牛ロ蹄疫O型灭活疫苗的O. 9% NaCl水溶液100微升；第四组肌肉注射含20微克牛ロ蹄疫O型灭活疫苗100微升；第五组肌肉注射含100微克核酸疫苗pcD-VPl的O. 9% NaCl水溶液100微升 ’第六组肌肉注射含100微克核酸疫苗pcD-VPl和含20微克猪生殖呼吸综合症病毒(PRRSV)灭活病毒疫苗(购自哈尔滨兽医研究所)的O. 9% NaCl水溶液100微升。第一次免疫后第14天再以同等剂量加强免疫一次，并于第二次免疫后第14天取脾脏T细胞測定其T细胞扩增活性，具体方法同实施例5。结果如图8所示，表明不管T细胞免疫反应抑制中是否有油佐剂，含有核酸疫苗pcD-VPl和ロ蹄疫146S抗原的T细胞免疫反应抑制剂免疫动物，其T细胞扩增活性明显低于核酸疫苗组或牛ロ蹄疫O型灭活疫苗组以及核酸疫苗pcD-VPl和灭活猪生殖呼吸综合症病毒疫苗组。说明此抑制T细胞扩增活性是抗原专ー性的，同时还证明，不管是核酸疫苗pcD-VPl和ロ蹄疫146S抗原共同免疫同一部位，还是单独免疫不同部位，都能抑制T细胞活性。图8中，1，为ConA表示阳性对照；2，为BSA非特异性抗原组；3，为pcD-VPl核酸疫苗和146S抗原共同免疫组；4，为左腿肌肉注射146S抗原，右腿肌肉注射pcD-VPl核酸疫苗组；5，为pcD-VPl核酸疫苗和牛ロ蹄疫O型灭活疫苗共同免疫组；6，为牛ロ蹄疫O型灭活疫苗免疫组；7，为核酸疫苗pcD-VPl免疫组；8，为pcD-VPl核酸疫苗和灭活猪生殖呼吸综合症病毒疫苗共同免疫组。
实施例7、病原体抗原和针对该病原体抗原的核酸疫苗组成的T细胞免疫反应抑制剂对免疫小鼠T细胞特异性扩增的影响
pADR 质粒(Gan RB, Cu MJ, Li ZP, et al. The complete nucleotide sequence ofthe cloned DNA of hepatitis B virus subtype adr inpADR-1. Sci Sin(B),1987,30(5)507-521)中含有全长的HBV基因组。以其为樽板，在引物I :5’-CGGATCCATTAAGCCATGCAGTGGAACTCC-3’ ；和引物 2 :5’ -GTCCTTGGGTATACATTTGAACCCCGGATCCA-3，,(在引物 I 和引物 2，都引入BamHI识别位点，同时在引物I引入起始位点ATG，引物2引入终止位点TGA)的引导下PCR扩增HBV S2抗原的DNA片段。反应体系5 μ LpADR质粒(IOng)，引物I和引物2各 10pmol，500mM KCl,IOOmM Tris-HCl(pH8. 4),I. 5mM MgCl2,100 μ g/mL BSA，ImM dNTPs,
2.5U Taq DNA聚合酶，总体积为50 μし反应条件为94°C变性30秒，54°C复性30秒，72°C延伸I分钟，共30个循环。PCR扩增的DNA片段产物，用限制性内切酶BamHI进行酶切，回收HBV S2抗原的DNA片段，将真核表达质粒pcDNA3同样以BamHI酶切，用T4 DNA连接酶将S2基因片段连接到pcDNA3 (购自invitrogen公司)上，转化至大肠杆菌DH5 α感受态细胞，在平板上筛选具有氨苄青霉素(50yg/mL)抗性的菌落，提取质粒，酶切筛选鉴定正确克隆，得到含有S2基因的重组质粒pcD-S2。
将30只6-8周龄BALB/c (H_2d)雌性小鼠均分三組，第一组肌肉注射含有100微克重组こ肝表面抗原S基因的核酸疫苗pcD-S2的0. 9% NaCl水溶液100微升；第ニ组肌肉注射含有20微克重组こ肝表面抗原S蛋白(购自于北京天坛生物制品所)疫苗的0.9%NaCl水溶液100微升；第三组肌肉注射含100微克核酸疫苗pcD_S2和20微克重组こ肝表面抗原S蛋白疫苗的0.9% NaCl水溶液100微升。第一次免疫后第14天再以同等剂量加强免疫一次，并于第二次免疫后第14天取脾脏T细胞測定其T细胞扩增活性，具体方法除刺激物为重组こ肝表面抗原S蛋白外，其它与实施例5相同。结果如图9所示，表明核酸疫苗pcD-S2和20微克重组こ肝表面抗原S蛋白疫苗T细胞免疫反应抑制剂免疫动物，其T细胞扩增活性明显低于核酸疫苗组和蛋白疫苗组。图9中，I为ConA表示阳性对照；2为核酸疫苗pcD-S2免疫组；3为重组こ肝表面抗原S蛋白疫苗免疫组；4为核酸疫苗pcD-S2和重组こ肝表面抗原S蛋白疫苗免疫组；5为BSA非特异性抗原组。
实施例8、T细胞活性抑制的量效关系实验
将70只6-8周龄BALB/c (H_2d)雌性小鼠均分七组，第一组肌肉注射含100微克ロ蹄疫VPl基因的核酸疫苗PcD-VPl的0. 9% NaCl水溶液100微升；第二组肌肉注射含100微克核酸疫苗pcD-VPl和20微克牛ロ蹄疫灭活病毒疫苗(购自兰州兽医研究所，含50%注射用白油)的O. 9% NaCl水溶液100微升；第三组肌肉注射含100微克核酸疫苗pcD-VPl和20微克ロ蹄疫VPl蛋白疫苗的O. 9 % NaCl水溶液100微升；第四组肌肉注射含100微克核酸疫苗pcD-VPl和200微克ロ蹄疫VPl蛋白中的RGD小肽(序列为NH2-LRGDLQVLAQKVARTL-COOH)疫苗的的O. 9% NaCl水溶液100微升；第五组肌肉注射含100微克核酸疫苗pcD-VPl和50微克ロ蹄疫VPl蛋白中的RGD小肽疫苗的0.9% NaCl水溶液100微升；第六组肌肉注射含100微克核酸疫苗pcD-VPl和12. 5微克ロ蹄疫VPl蛋白中的RGD小肽的O. 9% NaCl水溶液100微升；第七组肌肉注射含100微克核酸疫苗pcD-VPl和20微克猪瘟病毒E2抗原中小肽疫苗(序列为NH2-CTAVSPTTLRT-COOH)的O. 9%NaCl水溶液100微升。第一次免疫后第14天再以同等剂量加强免疫一次，并于第二次免疫后第14天取脾脏T细胞測定其T细胞扩增活性，具体方法除刺激物为VPl蛋白或猪瘟E2小肽(第七组)タト，其它与实施例5相同。结果如图10所示，表明核酸疫苗pcD-VPl和重组VPl蛋白疫苗共同免疫动物，其T细胞扩增活性明显低于核酸疫苗单独免疫的第二组；同时也表明 核酸疫苗pcD-VPl和VPl蛋白中的RGD小肽疫苗在不同浓度下形成的T细胞免疫反应抑制剂共同免疫动物，其T细胞扩增活性明显低于核酸疫苗单独免疫组，并且呈现出量效关系，既RGD小肽的浓度越高，T细胞扩增活性抑制越明显。图10中，1，为ConA表示阳性对照；2，为核酸疫苗pcD-VPl免疫组；3，pcD-VPl和ロ蹄疫灭活病毒疫苗免疫组；4，pcD-VPl和ロ蹄疫VPl蛋白疫苗免疫组；5，为pcD-VPl和200微克ロ蹄疫VPl蛋白中的RGD小肽疫苗组合物免疫组；6，为pcD-VPl和50微克RGD小肽疫苗组合物免疫组；7，为pcD-VPl和12. 5微克RGD小肽疫苗组合物免疫组；8，pcD-VPl和20微克猪瘟E2抗原小肽疫苗的组合物；9，为BSA非特异性抗原组。
实施例9、细胞因子水平测定
将60只6-8周龄BALB/c (H_2d)雌性小鼠分为10组，每组6只。第一组肌肉注射含100微克pcD-VPl的O. 9% NaCl水溶液100微升两次，两次之间间隔14天；第二组肌肉注射含20微克牛ロ蹄疫O型灭活疫苗(购自兰州兽医研究所)100微升两次，两次之间间隔14天；第三组第一次肌肉注射含100微克pcD-VPl的O. 9% NaCl水溶液100微升，间隔14天后第二次注射含20微克牛ロ蹄疫O型灭活疫苗100微升；第四组第一次肌肉注射含20微克牛ロ蹄疫O型灭活疫苗100微升，间隔14天后第二次注射含100微克pcD-VPl的0.9% NaCl水溶液100微升；第五组肌肉注射含100微克pcD-VPl和20微克牛ロ蹄疫O型灭活疫苗的混合溶液100微升两次，两次之间间隔14天；第六组肌肉注射含20微克VPl蛋白的O. 9% NaCl水溶液100微升两次，两次之间间隔14天；第七组第一次肌肉注射含20微克VPl蛋白的O. 9% NaCl水溶液100微升，间隔14天后第二次注射含100微克pcD-VPl的O. 9% NaCl水溶液100微升；第八组第一次肌肉注射含100微克pcD-VPl的O. 9% NaCl水溶液100微升，间隔14天后第二次注射含20微克VPl蛋白的O. 9% NaCl水溶液100微升；第九组肌肉注射含100微克pcD-VPl和20微克VPl的O. 9% NaCl水溶液100微升两次，两次之间间隔14天；第十组肌肉注射O. 9% NaCl水溶液100微升为对照。
利用竞争定量PCR进行检测细胞因子mRNA的水平，其关键在于引入ー个内标模板PQRS，它含有IL-2，IL-4，IL-10, IFN-Y，HRPT等基因的部分序列(pQRS质粒在每个基因中加入一段50-60bp的核苷酸，使其基因比野生型的IL-2，IL-4，IL-10, IFN- y , HRPT等基因大。在使用同样引物扩增后，从大小上可以判断出内标模板与野生模板的区別，同时由于是竞争的关系，所以可以判断出野生模板与内标模板量的关系。其具体制备方法见參考3CSKjournal of Immunological Methods，1993，165 :37，“Constructing polycompetitorcDNAs for quantitativePCR”)，因此以pQRS为内标模板可以检测免疫动物中相应细胞因子的含量(金华利等在2004年Vaccine杂志第22卷，第2925页发表的文章Effect ofChemical Adjuvants on DNA vaccinationノ。
取免疫后的小鼠断颈处死后取出脾脏，提取总RNA(TRIZ0L，鼎国生物公司)，反转录为cDNA，反转录依照大连宝生物公司RNA RT-PCR操作指南，取纯化的I μ g总RNA置250 μ L离心管中，然后依次加入相关试剂4 μ I MgCl2,2y I 10X缓冲液，8·5μ1 DEPC水，2 μ I dNTP 混合物，0. 5 μ I RNase inhibitor, 0. 5 μ I M-MLV 反转录酶(Promage 公司)，0. 5yL 01igo(dT)12 引物;反应条件为 42°C 30min,99°C 5min，5°C 5min。用看家基因次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)为内源表达标准，将各组cDNA浓度调为一致，然后在IOOng 恒定量的PQRS管中加入2μ I的cDNA进行PCR扩增。由于有pQRS的竞争，以下四种细胞因子IL-2基因，IFN- Y基因，IL-4基因和IL-10基因扩增的量将相对于pQRS扩增的量表现出相对不同而反映在电泳胶中的浓度差別。其中，反应所需引物和PCR反应条件如表I所示。
表I. HPRT, IL-2，IFN- y，IL-4和IL-10的引物序列及PCR反应參数
目的基因~Flm反应条件
HPRT5' GTTGGATACAGGCCAGACTTTGTTG94°C 30sec,60°C 30sec and
3' GAGGGTAGGCTGGCCTATGGCT72°C 40sec
IL-25' TCCACTTCMGCTCTACAG94°C 30sec,55°C 30sec and
3' GAGTCAAATCCAGAACATGCC72°C 40sec
IFN-y5' CATTGAAAGCCTAGAAAGTCTG94°C 30sec,58°C 30sec and
3' CTCATGGAATGCATCCTTTTTCG72°C 40sec
IL-45' GAAAGAGACCTTGACACAGCTG94°C 30sec,54°C 30sec and
3' GAACTCTTGCAGGTAATCCAGG72°C 40sec
IL-105' CCAGTTTTACCTGGTAGMGTGATG94°C 30sec,56°C 30sec and
3' TGTCTAGGTCCTGGAGTCCAGCAGACTCAA72°C 40sec
电泳检测PCR产物结果如图11所示，表明由核酸疫苗pcD-VPl和pcD_VPl所表达的蛋白质抗原VPl组成的T细胞免疫反应抑制剂，或由牛ロ蹄疫O型灭活疫苗(购自兰州兽医研究所)和pcD-VPl组成的T细胞免疫反应抑制剂免疫小鼠时(第三，第四，第五，第七，第八和第九组)，其动物体内的IL-4和IL-10上升,而IL-2和IFN-Y下降。说明针对病原体的核酸疫苗和该核酸疫苗所表达的蛋白质抗原组成的T细胞免疫反应抑制剂、由灭活病原体和针对该病原体的核酸疫苗组成的T细胞免疫反应抑制剂免疫动物，激活了起免疫抑制活性的细胞介素IL-4和IL-IO水平，由此证明其组合物抑制T细胞活性是通过IL-4和IL-10完成的。图11中，横坐标为第一至第十免疫组。
エ业应用
本发明与现有技术相比具有以下优点
I、本发明的T细胞免疫反应抑制剂比化学药品如普乐可复(FK506)，环孢素A(CsA)，骁悉(MMF)，硫唑嘌呤(Aza)，强的松(Pred)，早基强的松龙(MP)，和抗体如0KT4等更为安全，有选择性的抑制机体T细胞免疫反应，从而可以有效的应用于自身免疫疾病、器官移植、控制T细胞水平的治疗等方面。
2、本发明的T细胞免疫反应抑制剂可激发机体产生正常的特异性抗体免疫反应，抑制特异性细胞免疫反应，特别是Thl型免疫反应；该特异性细胞免疫反应是通过增强白介素10水平和抑制干扰素IFN-Y水平介导的。增强白介素10水平是机体免疫系统抑制过强的免疫反应而进行的有效调节作用，是防止机体中不必要的免疫损伤而重要手段之一。 所以本发明的T细胞免疫反应抑制剂可以特异性地用于抑制特定病原物引起的免疫损伤，能有效地克服免疫抑制方法不特异的不足。
3、本发明的T细胞免疫反应抑制剂不要求特殊的反应条件，一般生物制品药厂的设备即可生产，生产方法简单，易于ェ业化生产；
4、本发明的T细胞免疫反应抑制剂可用于治疗以下自身免疫疾病系统红斑狼疮(SLE)、类风湿关节炎(RA)、慢性淋巴性(桥本氏)甲状腺炎、毒性甲状腺肿(Grave’s病)，结节性多动脉炎、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、慢性活动性肝炎、慢性溃疡性结肠炎、恶性贫血伴慢性萎縮性胃炎、变态反应性脑脊髄膜炎、肺出血肾炎综合征、硬皮病、寻常天皰疮、类天皰疮、肾上腺皮质功能減退症、原发性胆汁性肝硬变、多发性脑脊髄硬化症、急性多发性多神经炎等严重的自身免疫性疾病；可以用于抑制器官移植中的免疫排斥反应。
5、本发明的T细胞免疫反应抑制剂可用于治疗以下由于ー些常见的过敏原如尘螨、跳蚤、蟑螂、动物皮毛、花粉、霉菌、细菌、病毒及烟草烟雾导致的皮肤、呼吸道等受损害，而出现过敏反应或免疫过激而引起的过敏性免疫疾病接触性皮炎、荨麻疹、过敏性鼻炎、哮喘、肾炎、甲状腺功能亢进、病毒性肝炎免疫超敏反应等。
权利要求
1.独立包装或混合的质量比为2: I至10 : I的针对病原体的核酸疫苗和该核酸疫苗所表达的蛋白质抗原 或独立包装或混合的质量比为I : 2至I : 10的灭活病原体和针对该病原体的核酸疫苗 在制备T细胞免疫反应抑制剂中的应用。
2.根据权利要求
I所述的应用，其特征在于所述T细胞免疫反应抑制剂中针对病原体的核酸疫苗和该核酸疫苗所表达的蛋白质抗原的质量比值为5 I。
3.根据权利要求
I或2所述的应用，其特征在于所述T细胞免疫反应抑制剂还包括免疫佐剂。
4.根据权利要求
I或2所述的应用，其特征在于所述核酸疫苗为含有蛋白质抗原编码基因的真核细胞表达载体。
5.根据权利要求
4所述的应用，其特征在于所述真核细胞表达载体中，调控蛋白质抗原编码基因表达的启动子为RSV、CMV或SV40病毒的启动子。
6.根据权利要求
4所述的应用，其特征在于所述真核细胞表达载体为质粒表达载体、病毒或噬菌体表达载体、质粒DNA与病毒或噬菌体DNA组成的表达载体或质粒DNA与染色体DNA片段组成的表达载体。
7.根据权利要求
4所述的应用，其特征在于所述蛋白质抗原编码基因的DNA是人工合成的或者通过从微生物、真核及植物细胞或组织提取而来的双链DNA。
8.根据权利要求
4所述的应用，其特征在于所述蛋白质抗原为人工合成的或者通过生物体生产的蛋白质。
9.根据权利要求
I或2所述的应用，其特征在于所述蛋白质抗原的活性多肽为人工合成的或者通过生物体生产的。
10.根据权利要求
9所述的应用，其特征在于所述生物体为在人工培养条件下可用于生产放大的大肠杆菌、芽孢杆菌或酵母菌。
11.根据权利要求
I或2所述的应用，其特征在于所述灭活病原体是通过生物体分离和生产的病毒、病原菌、寄生虫及过敏物质经公知的方法灭活后而得到的无感染性病原体。
12.根据权利要求
11所述的应用，其特征在于所述灭活病原体直接与核酸疫苗混合或经与矿物油乳化后再与核酸疫苗混合。
专利摘要
本发明公开了一种T细胞免疫反应抑制剂。本发明所提供的T细胞免疫反应抑制剂包括针对病原体的核酸疫苗和该核酸疫苗所表达的蛋白质抗原；或包括针对病原体的核酸疫苗和该核酸疫苗所表达的蛋白质抗原的活性多肽；或包括灭活病原体和针对该病原体的核酸疫苗。本发明的T细胞免疫反应抑制剂可激发机体产生正常的特异性抗体免疫反应，抑制特异性细胞免疫反应，特别是Th1型免疫反应，从而可以有效的应用于自身免疫疾病、器官移植、过敏、控制T细胞水平的治疗等方面。
文档编号A61P37/02GKCN1909918 B发布类型授权 专利申请号CN 200580002701
公开日2012年8月22日 申请日期2005年1月31日
发明者俞庆龄, 康友敏, 王宾, 金华利 申请人:中国农业大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (1),