专利名称:一种快速提取抗胃泌素释放肽肿瘤疫苗的制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于医药生物技术领域：
，具体说，涉及从原核细胞，特别是大肠杆菌中快速提取抗胃泌素释放肽肿瘤疫苗的制备工艺。
背景技术：
胃泌素释放肽(gastrin-releasing peptide，GRP)及其样肽，作为自分泌或旁分泌生长因子，能够促进肿瘤细胞的增殖。胃泌素释放肽C端的7至8个氨基酸已被证实为其抗原表位，因此针对胃泌素释放肽及其样肽表位开发多肽疫苗就成为一条肿瘤治疗的新途径，这样不但可以完全阻断胃泌素释放肽及其样肽刺激肿瘤细胞增殖的作用，还避免了反复多次给药的麻烦。基于以上研究，本单位已经开发出了一种以GRP的C端7肽为靶抗原表位的肿瘤多肽疫苗并申请了专利(名称“基于胃泌素释放肽的肿瘤多肽疫苗”专利公开号CN1830489)。
我们通过分子生物学技术将热休克蛋白65(HSP65)的基因与六段GRP的表位基因连接在一起得到重组质粒pET28a-HSP65-GRP6，并将该重组质粒导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)得到重组工程菌。该重组蛋白以可溶的形式在菌体内表达。由于蛋白HSP65自身就具有蛋白酶的催化活性，当细菌裂解后，HSP65很容易被自身蛋白酶活性所分解，从而在聚丙烯酰胺凝胶上表现为一系列梯状蛋白条带，虽然HSP65-GRP6融合蛋白的降解强度比HSP65要小，但是仍然有自身降解的特性，并且该融合蛋白一旦降解，就会给后续的分离纯化工作带来很大的麻烦。现有的纯化工艺包括硫酸铵分步沉淀、阴离子树脂分离等多步纯化过程，但是在纯化的过程中融合蛋白也在不断的降解，从而导致难以制备得到高纯度的蛋白样品。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的缺点，提供一种既能够防止该蛋白提取过程中的降解、又能获得高纯度的产物并且还能极大简化纯化过程的制备工艺。
为达到上述目的，本发明采取的技术方案是将诱导表达了目的蛋白的重组工程菌以1g/ml的比例悬浮在菌体裂解液(pH8.0，50mM Tris-HC1，0.02％溶菌酶)中，室温搅拌30分钟后，加入DNaseI将DNA消化至溶液不粘稠；用冷冻离心机在4℃以12000rpm的转速离心25分钟；收集离心后的上清液，在搅拌的条件下缓慢加入磨细的硫酸铵粉末，直到硫酸铵达到10％的饱和度，然后将该溶液在冰水混合物中静置30分钟；然后用冷冻离心机在4℃以12000rpm的转速离心25分钟；将沉淀溶解于蒸馏水中，装入14000KDa截流量的透析袋中，置于大量蒸馏水中透析24小时，每8小时换一次蒸馏水；透析去盐后的蛋白溶液冷冻干燥，保存。
本发明在菌体裂解以后选择适当的条件，用一步沉淀法从裂解上清液中获得了较高纯度的目的蛋白，避免了蛋白在多步纯化过程中的降解，又极大的简化了制备过程，节约了生产成本。
图1 SDS-PAGE电泳显示重组工程菌在诱导后目的蛋白的表达。1.标准分子量蛋白；2.乳糖诱导前的菌体全蛋白；3.乳糖诱导1小时后的菌体全蛋白；4.乳糖诱导2小时后的菌体全蛋白； 5.乳糖诱导3小时后的菌体全蛋白；6.乳糖诱导4小时后的菌体全蛋白；7.乳糖诱导5小时后的菌体全蛋白；8.乳糖诱导6小时后的菌体全蛋白；9.乳糖诱导7小时后的菌体全蛋白图2 SDS-PAGE电泳显示硫酸铵一步沉淀后获得的纯化目的蛋白。1.标准分子量蛋白；2.乳糖诱导前的菌体全蛋白；3.乳糖诱导6小时后的菌体全蛋白；4.一步沉淀法得到的纯化蛋白具体实施方式
实施例1，从平板上挑取重组工程菌单菌落接种含有50μg/ml卡那霉素的36ml LB液体培养基(蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，氯化钠10g/L)中，于37℃恒温振荡培养过夜，按2％比例转接种入新鲜的1.8L含有50μg/ml卡那霉素的玉米浆液体培养基(玉米浆25g/L，牛肉浸膏15g/L，味精10g/L)中，37℃培养4小时后，加入终浓度为0.5mmol/L的α-乳糖诱导大肠杆菌表达T7RNA聚合酶，继续培养从而表达融合蛋白HSP65-GRP6，加入诱导剂乳糖以后，每小时取样。SDS-PAGE电泳再经薄层扫描显示已经实现了HSP65-GRP6的融合表达，诱导后6小时融合蛋白占细菌总蛋白的30％左右，结果见附图1。
实施例2，诱导表达后的工程菌经离心回收菌体约10g，将菌体悬浮在100ml菌体裂解液(pH8.0，50mM Tris-HCl，0.02％溶菌酶)中，室温搅拌30分钟，加入30μl DNaseI(1mg/ml)将DNA消化至溶液不粘稠为止，离心回收上清；收集离心后的上清液，在搅拌的条件下缓慢加入磨细的硫酸铵粉末，直到硫酸铵5.3g，达到10％的饱和度，然后将该溶液在冰水混合物中静置30分钟；然后用冷冻离心机在4℃以12000rpm的转速离心25分钟；将沉淀溶解于蒸馏水中，装入14000KDa截流量的透析袋中，置于大量蒸馏水中透析24小时，每8小时换一次蒸馏水；透析去盐后的蛋白溶液冷冻干燥后称重0.11g；用SDS-PAGE电泳检查制备样品的纯度，结果见附图2。
权利要求
1.一种快速提取抗胃泌素释放肽肿瘤疫苗的制备工艺，其特征在于1)将表达目的蛋白的重组工程菌悬浮于菌体裂解液(pH8.0，50mM Tris-HCl，0.02％溶菌酶)中，室温搅拌至菌体完全裂解后加入核糖核酸酶I，继续搅拌至溶液不再粘稠；2)将溶液冷冻离心，转速12000rpm，25分钟；3)收集离心后的上清液，在搅拌的条件下缓慢加入一定的硫酸铵粉末，然后将该溶液在冰水混合物中静置30分钟；4)将溶液冷冻离心，转速12000rpm，25分钟；5)将离心所得沉淀溶解于蒸馏水，装入透析袋中，置于大量蒸馏水中透析24小时，每8小时换一次蒸馏水；6)透析去盐后的蛋白溶液冷冻干燥，即得纯化的蛋白样品。
2.根据权利要求
1所述的制备工艺，其特征是缓慢加入硫酸铵粉末，直到溶液中硫酸铵的饱和度达到5％-15％。
3.根据权利要求
2所述的制备工艺，其特征是加入的硫酸铵的量是指在0℃条件下达到5％-15％饱和度所需要的量。
专利摘要
本发明属于医药生物技术领域：
，公开了一种快速高效地从大肠杆菌中提取抗胃泌素释放肽肿瘤疫苗的制备工艺。将表达目的蛋白的重组工程菌裂解以后，用一步硫酸铵沉淀法从裂解上清液中获得了高纯度的目的蛋白，既避免了蛋白在多步纯化过程中的降解，又极大的简化了制备过程，节约了生产成本。
文档编号C12P21/02GKCN101015687SQ200610098313
公开日2007年8月15日 申请日期2006年12月11日
发明者刘景晶, 吴国君, 欧阳可栋, 谢燕飞, 过为, 李建平, 陈庆梅, 吴洁, 曹荣月 申请人:中国药科大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan