人工胰岛素类似物的制作方法

专利名称:人工胰岛素类似物的制作方法
本发明是关于一种以皮下注射后立即产生作用为特征的新型人类胰岛素类似物，含有这种胰岛素类似物的胰岛素注射液和制备这种胰岛素类似物的方法。
在治疗糖尿病中，技术人员已提出许多种胰岛素配制品，其中一些是速效的，而另外一些或多或少有延迟作用。
在急症情况下，像高血糖昏迷，外科手术、怀孕期间和严重感染时可以使用速效胰岛素制剂。此外，每天多次注射速效胰岛素制剂可改进那些已表明是难以用长效胰岛素控制的糖尿病人的病情控制。
最近几年，对一个用胰岛素治疗方法产生了愈来愈大的兴趣，该方法研究了健康组织的β细胞中胰岛素的分泌，即，与餐食相联系地补充胰岛素，並维持一个基本的胰岛素水平。临床观察表明糖尿病患者借助于每天一次注射长效胰岛素以满足基本的需要，並在主餐之前补充注射少量的速效胰岛素就能够获得接近于正常的胰岛素和葡萄糖浓度。
在治疗既需要中效和长效胰岛素的推迟作用，又需要较强的起始效应的糖尿病患者时，还可以将速效胰岛素与中效和长效胰岛素混合使用。
最后，速效胰岛素可应用在连续的胰岛素输送系统中。
皮下注射速效胰岛素溶液，已观察到吸收时有一个初始延迟(Binder，Diabetes Care 7.NO.2(1984)，188-199)，然而，当目标是严格的代谢控制时，这种由较慢开始作用引起的延迟吸收是不希望的。将速效胰岛素溶液与长效胰岛素制剂混合还会进一步使速效胰岛素的吸收速率降低。
因此，需要有一种皮下注射后较快发生作用的、並且改进与长效胰岛素制剂的混溶性的速效胰岛素溶液。
已知的速效胰岛素溶液的另一个缺点是在用于连续输注胰岛素的胰岛素溶液中，胰岛素有形成微纤维並从该溶液中沉淀出来的趋势，因而阻塞了机械部件和输送导管。
最后，还需要另一种治疗对正常胰岛素具有耐受性的病人用的胰岛素制剂。
本发明的目的是提供一种具有以下一种或多种改进特性的新型速效胰岛素溶液。
1)通过皮下注射或其他给药途径，能较快发生作用。
2)改进了与延迟胰岛素配制品的混溶性。
3)降低了在用于可植入的输送系统时产生微纤微的趋势。
4)适用于耐药性病人的治疗(对先前存在的抗体具有低的亲和性)。
用下文描述的新型可注射的人胰岛素类似物的水溶液可达到本发明的目的。
过去已介绍过大量的胰岛素类似物，Marki等人(Hoppe-Seyler′s Z.Physiol.Chem，360(1979)，1619-1632)介绍了人胰岛素类似物的合成，这些胰岛素类似物在A链的2，5，6，7，8和11位，和B链的5，7，13和16位中单氨基酸的取代上不同于人胰岛素。从而对颇感兴趣的胰岛素的结构与活性的关系有了深入了解。其他研究改进了胰岛素(B(22)-β(26))内主要受体的结合区域，以了解这种变异对受体结合活性的影响。然而，已知的人胰岛素类似物不能呈现出本发明人所要求的这些性质。
众所周知，硫酸盐化的胰岛素形成微纤维的趋势较低(Albisser等人，用于输注泵的胰岛素的理想特性，InGueriguian J.L等人，eds.US Pharmacopeial Convention，Rockwille，Maryland，Pp.84-95)並呈现一种抵抗原性。然而硫酸盐化的胰岛素是一种至少有几种不同的、平均每个分子含有4.5个硫酸盐酯基团的胰岛素衍生物的非均匀混合物。此外，硫酸盐化的胰岛素具有一个低的胰岛素活性，大约是原来胰岛素活性的20%，与原胰岛素比较，硫酸盐化胰岛素的另一个缺点是它们不需要含有通过化学方法改进的氨基酸残基，即不是自然存在的氨基酸。
本发明的另一个目的是提供同类的胰岛素类似物，生物活性要高于硫酸盐胰岛素，最好只含有天然存在的氨基酸。
这里所用的“胰岛素类似物”意思是指一种具有与人胰岛素分子结构类似的化合物，包括在A(7)Cys和B(7)Cys之间、A(20)Cys和B(19)Cys之间含有二硫化物桥，在A(6)Cys和A(11)Cys之间含有一个内二硫化物桥，並具有胰岛素活性。
本发明基于一个意外的情况，就是在某些胰岛素类似物中至少有一个氨基酸残基已被天然存在的氨基酸基所取代，而呈现出令人希望的速效活性。
广义讲，本发明通过用天然存在的氨基酸残基取代人胰岛素的一个或多个氨基酸基，提供了一种新型的速效人胰岛素类似物，它降低了自身联合成二聚物、四聚物、六聚物或多聚物的趋势，並在中性pH值将具有与人胰岛素相同的或更大的负电荷。
为了降低自身联合成二聚物、四聚物、六聚物或多聚物的趋势，最好在分子的相应位置上用比天然氨基酸基亲水性更强的其他氨基酸基取代人胰岛素的某些残基。也可以在胰岛素分子的某些位置上用更庞大的氨基酸基取代，从而降低胰岛素分子联合成二聚物、四聚物、六聚物或多聚物的趋势。
更具体地说，本发明提供了一种具有如下通式Ⅰ的新型胰岛素衍生物A链
其中X′是人胰岛素的氨基酸残基，它们的网格功能使分子在中性pH值时具有与人胰岛素相同的电荷，或比人胰岛素的电荷更大的负电荷，但条件是在胰岛素分子中相应的位置上至少有一个X与人胰岛素的氨基酸残基不同，並且在A(8)位的X是His或Phe，在A(21)位的X是Asp，在B(5)位的X是Ala，在B(9)位的X是Leu，在B(10)位的X是是Asn或Leu，在B(12)位的X是Asn或者在B(26)位的X是Ala，並在胰岛素分子中相应位置上至少一个剩余的X与人胰岛素的氨基酸基不同。此外还需要一个或多个氨基酸残基可以从A链和/或B链的N终端和/或C终端去除。
至少大部份的氨基酸残基取代物的亲水性要比人胰岛素中相应部位上氨基酸基强，最好所有氨基酸残基取代物的亲水性强于相应的人胰岛素的氨基酸残基。
关于亲水性，可参考C.Froemmel，J.Theor.Biol.111(1984)，247-260(表1)。
参照以上式Ⅰ，与人胰岛素分子中相应位置上的氨基酸基不同的X最好不要多于7个，最佳为2-4个取代物。
最好从Asp、Glu、Ser、Thr、His和Ile中选择氨基酸取代基，特别是选择带有负电荷的氨基酸基，即Asp或/和Glu。
该新型人胰岛素类似物最好含有Asp和/或Glu，而不是人胰岛素的一个或多个羟基氨基酸，也不是人胰岛素的一个或多个Glu和Asn。
该新型人胰岛素类似物进而最好含有Ser和/或Thr，或者Asp和/或Glu，而不是一个或多个具有脂肪性和/或芳香性侧链的人胰岛素氨基酸残基。
该新型人胰岛素类似物最好还含有His，而不是一个或多个具有脂肪性和/或芳香性侧链的人胰岛素氨基酸基，也不是一个或多个人胰岛素的羟基氨基酸。
取代的最佳部位是在B9、B10、B12、B26和B27、尤其是B9、B12和B27，在这些位置上一个取代就足以能降低自身联合的趋势，並在给药后可产生快速作用。
在B9位上的取代氨基酸残基可以从下组中选择Asp、pro、Glu、Ile、Leu、Val、His、Thr、Gln、Asn、Met、Tyr、Trp和Phe，从Asp、Glu、Gln、Asn和His中选取更好。
在B12位上的取代氨基酸基可以从Ile和Thr中选择。B10位上的氨基酸取代基可由Asp、Arg、Glu、Asn和Gln中选取，B26位取代和B27位上的氨基酸取代基最好是Asp或Glu。
为了获得改善的特性，在胰岛素分子的剩余位置中，看来至少需要有两个取代基(最好与以上所提位置结合起来)。在这些位置可进行如下取代位置 最佳氨基酸取代基A8 His，Gly，Gln，Glu，Ser，Asn，Asp，ProA9 Gly，Asp，Glu，Thr，His，Gln，Asn，Ala，ProA10 Leu，Pro，Val，His，Ala，Glu，Asp，Thr，Glu，AsnA13 Pro，Val，Arg，His，Ala，Glu，Asp，Thr，Gly，Gln，Asn，AspA21 Asp，Glu，B1 Glu，Asp，Thr，Ser。
位置 最佳氨基酸取代基B2 Arg，His，Ala，Glu，Asp，Thr，Pro，Gly，Gln，Ser，AsnB5 Glu，Asp，Thr，Ser，Gln，AsnB14 Glu，Asp，Asn，Gln，Ser，Thr，GlyB16 Asp，Glu，Gln，Asn，Ser，Thr，His，ArgB17 Ser，Thr，Asn，Gln，Glu，Asp，HisB18 Ser，Thr，Asn，Gln，HisB20 Gln，Ser，Asn，Asp，Glu，ArgB28 Glu，Asp本发明的另一些最佳化合物是在如下位置上具有取代基的胰岛素类似物B27，B12，B9，(B27+B9)，(B27+A21)，(B27+B12)，(B12+A21)，(B27+B17)，(B27+A13)，(B27+B16)，(B27+A10)，(B27+B28)，(B27+B26)，(B27+B10)，(B27+B1)，(B27+B2)，(B27+B5)，(B27+B14)，(B27+B18)，(B27+B20)，(B12+B17)，(B12+A10)，(B12+A13)，(B12+B16)，(B12+B1)，(B12+B2)，(B12+B5)，(B12+B10)，(B12+B26)，(B12+B28)，(B9+B17)，(B9+A13)，(B9+B16)，(B9+A8)，(B9+A9)，(B9+A10)，(B9+B1)，(B9+B2)，(B9+B5)，(B9+B10)，(B9+B12)，
(B9+B14)，(B9+B28)，(B9+B18)，(B9+B20)，(B9+B26)，(B27+B9+A21)，(B9+B27+A8)，(B27+B12+A21)，(B27+B12+B9)，(B9+B12+B27+B17)，(B9+B12，+B27+A13)，(B9+B12+B27+B16)、以及(B12+B16+B17+B27+A10+A13)。
以上式Ⅰ的最佳实施如下
其中X与上叙定义相同。
参照式Ⅰ，本发明的另一种最佳胰岛素类似物是这样的在B27位的X为Glu，B12位的X为Ile或Tyr，在A21位的X为Asp和B27位的X为Glu，B9位的Y是Asp，A21位和B9位的X是Asp和B27位的X是Glu，A8位的X是His，B9位的X是Asp和B27位的X是Glu，B10位的X是Asp，或B9位的X是Asp和B27位的X是Glu。
根据本发明的第二个方面，提供了具有胰岛素活性的可注射溶液，本发明可注射的胰岛素溶液含有以上描述的人胰岛素类似物或者它的药物学上可接受的盐，最好是在中性pH值的水溶液中。含水介质可以添加如氯化钠和葡萄糖制成等渗的。也可以添加缓冲液，如醋酸盐或柠檬酸盐和防腐剂，如m-甲酚，酚或甲基4-羟基苯甲酸盐。该胰岛素溶液还可以含有锌离子。
本发明的人胰岛素类似物可以代替本领域中迄今已知的速效胰岛素溶液中的人或猪的胰岛素。
在重组DNA技术到来后，蛋白工程已变得很发达了。利用通常所谓的部位特异诱变技术，有可能用别的天然存在的氨基酸密码子取代天然基因中的任何一个或多个密码子从而改变天然蛋白的基因编码。或者可以利用公知技术通过化学合成总DNA序列来改进基因。这种对天然蛋白基因控制的目的主要是在一个或另一个已确定的方向上改变天然蛋白的性质。
可通过用具有所需氨基酸残基取代基编码的编码子或者用合成具有所需人胰岛素类似物编码的整个DNA序列来取代天然人胰岛素原基因中的适当部位的编码子而改变胰岛素原的基因，来制备该新型胰岛素类似物。然后将具有所需胰岛素类似物编码的新的被改进了的或合成的基因插入到一个适宜的表达载体中，这种载体在转移到一个适宜的宿主有机体，例如大肠杆菌或酵母中时，就生成所需要的产品，然后根据表达产品是否存在于细胞之中将表达产品从细胞或培养荡中提取出来。
还可以利用类似于Marki等人(Hoppe-Seyler′s Z Physiol，Chem，360(1979)，1619-1632)所描述的方法，通过化学合成制备该新型胰岛素类似物，也可以分别在玻璃试管中制备含有适当氨基酸基取代的A链和B链，然后按照已知方法(e.g.Chance等人，In.Rick DH.Gross E(eds)peptides合成-结构-功能，第七集美国多肽论文集，伊利诺斯pp 721-728)建立二硫化物桥，将这种修改过的A链和B链连接在一起的制得。
制备该新型胰岛素类似物最好通过使式Ⅱ的生物合成的前体在有胰蛋白酶或胰蛋白酶衍生物存在下与L-苏氨酸酯反应，随后用已知方法将所获得的人胰岛素类似物的苏氨酸酯转变成人胰岛素类似物。
式中Qn是一个具有n个天然存在的氨基酸残基的肽链，R是Lys或Arg，n是一个0-33的整数，m是0或1，X定义与前相同，其条件是肽链-Qn-R-不含有两个邻近的碱性氨基酸残基。在US4343898中描述了这种所谓的“转肽作用”反应(该专利的公开内容通过这里的引用被结合到本申请中)。
根据转肽反应，将B链中氨基酸29和A链中氨基酸1之间的桥-(Qn-R)m-切除，並且将苏氨酸酯基团联接到B29Lys的C终端。
用类似于欧洲专利NO.0163529A中所描述的方法可以制备上面式Ⅱ的前体(该专利的内容通过这里的引用被结合到本申请中)，利用这种方法，将具有有前体编码的DNA序列插入到一个适宜的表达载体中，该载体在转移到酵母中后，能够表达和分泌具有正确定位的二硫化物桥的所要求的化合物，然后从培养汤中提取出该表达的产品。
本发明的胰岛素类似物也可以通过把式Ⅲ的生物合成前体在水溶液中与胰蛋白酶和羧肽酶B反应，並从反应液中回收人胰岛素类似物来制取。
其中S和T分别是Lys或Arg，X定义如前。
利用类似于欧洲专利NO86302133.3中所描述的方法可以制备式Ⅲ的前体，该专利的公开内容通过这里的引用被结合到本申请中。利用这种方法将一个具有前体编码的DNA序列插到适宜的酵母表达载体中，该载体在转移到酵母中去时，能够表达並在培养介质中分泌这种具有正确定位的二硫化物桥的表达产品。
本发明的第三个方面，提供了一种生产该新型胰岛素类似物的方法，根据这种方法，将含有一个可复制的表达载体的酵母菌株在适宜的营养介质中培育，这种表达载体包含具有胰岛素类似物前体编码的DNA序列，从培养介质中回收前体，並在玻璃试管中，利用酶和化学转换转变成新型胰岛素类似物。
本发明也涉及到该新型胰岛素类似物的新型前体，具有这种新型前体编码的DNA序列，含有这种DNA序列的表达载体和用这种表达载体转化了的酵母菌株。
改进的胰岛素类似物本发明打算包括胰岛素类似物的某些衍生物或者其他取代物，只要这些衍生物或其他取代物对上面所描述的发明目标没有显著的影响。因此可以相应地在氨基酸残基中衍生出一个或多个官能团，这种衍生物的例子本身只是已知的变换。如把胰岛素分子中的酸基转变成酯或酰胺基团，醇基团转变成烷氧基团或反之，以及选择性地脱去氨基。作为一个例子，A21ASn可以在酸性介质中水解脱去氨基成为A21Asp，或使B3Asn在中性介质中脱去氨基成为B3Asp。
在N-终端或C-终端，添加或去除氨基酸基也能够修正本发明胰岛素类似物，本发明的胰岛素类似物可以在B链的N-端至多缺少4个氨基酸基，在B链的C一端可至多缺少5个氨基酸基，而对胰岛素类似物的总体特性没有明显的影响。这种修正的胰岛素类似物是缺少B1 Phe或B30 Thr氨基酸残基的胰岛素类似物。
也可以把天然的氨基酸基添加到多肽链的一个或几个终端上，只要这样做对以上所述的目标没有明显的影响。
本发明胰岛素类似物的多肽链终端上的这种删除或添加，可根据本发明在玻璃试管中，在具有氨基酸取代物的胰岛素类似物上进行。或者，本发明新型胰岛素类似物的基团，可以分别通过在多肽链终端上添加或去除相应的多余或缺少氨基酸残基的密码子被修正。
术语用于氨基酸的缩写是如在J.Biol.Chem.243(1968)3558中所表示的那些。这些氨基酸呈现L构形。
下文所用的B(1-29)是指人胰岛素B1 Phe到B29 Lys缩短的B链，A(1-21)是指人胰岛素的A链。
根据本发明的实际，在人胰岛素分子中的取代物是用参照于人胰岛素的词头表示的。例如，B27 Glu人胰岛素指一个在B链27位上Thr被Glu所取代的人胰岛素类似物。B27 Glu，B9 Asp人胰岛素指一个在B链27位上的Thr被Glu所取代和B链9位上的Ser被Asp所取代的人胰岛素类似物。B27Glu，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰岛素是指缩短B链(参看上文)27位上的Thr被Glu所取代，並由肽片段Ala-Ala-Lys将B(1-29)链和A链〔A(1-21)〕联在一起的胰岛素类似物的前体(参看式Ⅱ)，除非另外加以说明。要明白，与人胰岛素一样，B(1-29)链和A(1-21)链是由A(7)Cys和B(7)Cys之间的二硫代物桥和A(20)Cys和B(19)Cys之间的二硫化物桥联结起来的。同时还必须理解为A链含有A(6)Cys和A(11)Cys间的内二硫化物桥。
正如已指出的那样，本发明的目的是提供速效可注射的胰岛素溶液。在努力达到这个目的中，发明人首先认识到在贮存中的或大丸剂中的胰岛素和在循环中的胰岛素之间存在着很大差别，尤其是在胰岛素浓度上存在着完全不可避免的差别。具体地讲，血流中的胰岛素相当稀，为10-11-10-18M，是单体形式，可能具有一些二聚物形式的胰岛素，贮存在胰腺的β-细肥颗粒中的，以及在通常施用人体的溶液中的浓度大得多的胰岛素大多(即使不是大体上)是非活性六聚物形式，例如众所周知的二锌六聚物。
大家都知道溶液中的人胰岛素以多种分子形式存在，即单聚物、二聚物、四聚物和六聚物(Blundell等人，蛋白质化学的进度，Academic Press，New York and London，Vol.26，PP 279-330，1972)，在高浓度胰岛素时，寡聚物形式有利，而单聚体是胰岛素的活性形式。四聚物和六聚物是非活性形式，甚至二聚物也不是活性的，本发明的基本概念是发明人相信技术人员所承认的延迟吸收现象(Binder，Diabetes Care7.Na2(1984)188-199)主要是由于胰岛素从六聚物、四聚物和二聚物离解成单体(活性的)需要时间的缘故。
本发明的人胰岛素类似物是通过不容易形成二聚物、四聚物、六聚物或多聚物的分子结构而得到速效作用。即，不管锌离子是否存在，都会降低自身联合成二聚物、四聚物、六聚物或多聚物的趋势。
根据胰岛素中的氨基酸序列，有相当不同类型的差别。长期以来就认识到，並不是胰岛素分子中的所有氨基酸残基都对胰岛素的活性是关键的，並认识到，对胰岛素活性不起关键作用的某些氨基酸基对于胰岛素分子的物理性质都是重要的。事实上，人们都知道豚鼠胰岛素是不能二聚的，硫酸盐化的胰岛素和四硝基酪氨酸胰岛素不能二聚。因此，人胰岛素分子中的很多氨基酸基可被改变而基本上並不降低胰岛素活性。这里所考虑的人胰岛素分子中的氨基酸取代是为了在不破坏胰岛素活性情况下，防止二聚物、四聚物、六聚物或多聚物的形成。
在式Ⅰ的A链和B链中，可以进行替代的那些位置的氨基酸基，对于胰岛素活性不是关键，但对于人类胰岛素聚集成二聚物、四聚物、六聚物或多聚物的能力，或者对人胰岛素的溶解性都是很重要的。现在这些氨基酸取代基干扰了促使聚合成二聚物、四聚物、六聚物或多聚物的相信胰岛素分子之间的原子与原子的接触。
对于取代来说，正如能预料到的那样，人胰岛素分子中的某些位置上的变化比其他地方更为有效。一般说来，在B链中进行单独一个取代可以有效地降低自联的趋势，同时，至少需要改变两个其他残基。A链中的取代主要起改进游离分子溶解性的作用。氨基酸残基取代的最佳位置是B9、B12、B10、B26和B27，可以单独地，彼此组合地或与胰岛素分子中如式Ⅰ所指出的其他位一起取代。
很明显，用一个或多个带有负电荷的氨基酸基取代不带电荷或带有正电荷的氨基酸残基是为了在中性pH值下，使人胰岛素类似物的电荷更加负性，並且，与人胰岛素相比较降低其等电点。就其特征而言，本发明的人胰岛素类似物与人胰岛素相比，具有相同或更负的电荷(在中性pH值)和更低的等电点。
一般来讲，本发明直接的目标是获得从1至3个的取代，即，提供一个更快速作用的胰岛素，这样确定构成了本发明的最佳模式。用2-3个取代可改进与被保护的胰岛素制剂的混溶性。然而，我们相信。还能通过数目大于3的取代更有效地完成本发明的直接目标，因为所希望的一些辅助目标也会因此而实现。
具体地说，一个额外的取代程度，如有4或5个取代的氨基酸取代时，可产生这样一种人胰岛素类似物，这种类似物不易形成微纤微或内聚，这是一个想把胰岛素溶液制成连续输注剂时特别需要的特性。一般讲，对于本发明的人胰岛素类似物，设想在胰岛素分子中的取代不多于7，最好是2-4个取代。
具有本发明胰岛素类似物前体编码的基因可通过修饰具有式Ⅱ(或式Ⅲ)的上述胰岛素前体编码的基因而制备;式中所有的X是人胰岛素的氨基酸残基。修饰借助于用具有所希望的突变编码的密码子插入或取代产生的部位特异突变而完成的。具有该胰岛素类似物前体编码的DNA序列也可以由全部或部份与该胰岛素类似物前体的基因相对应的寡聚核苷酸通过酶合成来制造。
然后，把包含具有所需要的胰岛素基因突变的基因的DNA序列与具有TpI促进子(IPIp)(T.Alber和G.Kawasasi，酒酵母丙糖磷酸盐同分异构酶的核苷酸序列，J.Mol.Applied Genet(1982)419-434)、MFα1先导序列(J.Kurzan和I.Herskowitz，酵母信息素基团MFα1的结构一种公认的α-因子前体含有4个串联的成熟α因子的复制体。Cell 30(1982)933-943)、和从酒酵母(TPIT)来的TPI转录终止序列编码的片段相结合。这些片段提供了一些能保证具有基因编码的前体高速度转录的序列，並且还提供一个能影响前体在分泌途径中的位置及其它向培养介质最终分泌的预序列。此外，表达单位具备复制的酵母2u源以及可选择的标示，LEU2。
在酵母α-因子体内成熟期，MFα1先导肽(Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala)的最后(C终端)六个氨基酸，通过一个识别Lys-Arg序列的肽链内切酶和能去除Glu-Ala残基(Julius，D.等人，Cell32(1983)839-852)的氨基二肽酶的依次作用而从α-因子先体上除去。为了消除对酵母氨基二肽酶的需要，具有MFα1先导物的C终端Glu-Ala-Glu-Ala编码的序列通过体外突变而从MFα1先导序列上被除去。下文中，“MFα1先导物”(MFα1 leader)是指整个先导物序列。而MFα1先导物(负Glu-Ala-Glu-Ala)是指已除去C终端Glu-Ala-Glu-Ala序列的先导序列。
例1具有B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)
人胰岛素编码的基因之构建B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰岛素的酵母密码子最佳结构基因如下构建可以在可控制的微孔玻璃载体上利用氨基磷酸酯化学的自动DNA合成器里合成以下10种寡聚核苷酸(B.L.Beaucage和M.H.Caruthers(1981)Tetrahydron Letters 22，1859-1869)ⅠAAAGATTCGTTAACCAACACTTGTGCGGTTCCCAC35-merⅡAACCAAGTGGGAACCGCACAAGTGTTGGTTAACGAA36-merⅢTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGGTTTCT43-merⅣGTAGAAGAAACCTCTTTCACCGCAAACCAAGTACAAAGCTTC42-merⅤTCTACACTCCTAAGGCTGCTAAGGGTATTGTC32-merⅥATTGTTCGACAATACCCTTAGCAGCCTTACCAGT34-merⅦGAACAATGCTGTACCTCCATCTGCTCCTTGTACCAAT37-merⅧTTTTCCAATTGGTACAAGGAGCAGATGGAGGTACAGC37-merⅨTGGAAAACTACTGCAACTAGACGCAGCCCGCAGGCT36-merⅩCTAGAGCCTGCGGGCTGCGTCTAGTTGCAGTAG33-mer
由上述10个寡聚核苷酸制成如图1所示的5个双股螺旋A-E。
将相应的5′-磷酸化低聚核苷酸Ⅰ-X在90℃下加热5分钟，再冷却到室温並保持75分钟，每个双股螺旋A-E形成20个Pmole。为了避免连结时围绕自互补的XbaI单链末端发生二聚作用。双股螺旋的33聚物不被5′-磷酸化。将这5个双股螺旋混合，並用T4连结酶处理。这种连结混合物于2%琼脂糖胶上进行电泳后，在182/183bp带处分离该合成基因。
所获得的合成基因示于图1。
把该合成基因连结到4kb Kpn1-EcoR1段、PMT644的8kb Kbal-Kpn1段和pKFN9的0.3kb EcoR1-Hga1段上，从而得到下列结构的IPIp-MFα1先导物-13(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-TPIT。
质粒pMT644含有DNA-序列TPIp-MFα1先导物-B(1-29)-A(1-21)-TPIT，其构建在丹麦书1293/85号中有说明。质粒pKFN9的构建于以下进行说明。
这种连结混合物用来转化适宜的大肠杆菌株(r-，m+)(MT172)。30个抗氨苄青霉素克隆被转移到能产生8Leu+克隆的含有基本培养基M9的培养板上(T.Maniatis等人，分子营养系，Cold Spring Harbor室验室，1982，P.68)。32P-Xba1-ECoR1片段的Maxan-Gilbert定序显示出三个质粒含有所需序列的基因。为进一步的使用，选择了一质粒pKFN27。
于图2举例说明3pKFN27的构建。
质粒pKFN9的构建构建质粒pKFN9的目的是为了获得一个紧接着MFα1先导序列后有一Hga1部位的质粒。用Xba1切割质粒pMT544，(其构建于丹麦书278/85号中有说明)，再用ExoⅢ核酸酶处理，从3′末端除去大约250个碱基，把含有Hga1序列的合成32聚物插入引物GGATAAAAGAGAGGCGCGTCTGAAGCTCACTC退火成为部份单股DNA。双股环形DNA的制造是通过Klenow聚合酶的填补和T4连结酶的连结，在大肠杆菌(r-，m+)(MT172)转化以后，通过用5′-32P-标记的32聚插入引物的克隆杂化来检验含有突变质粒的克隆。新的Hga1部位的出现用限制性酶切割(EcoR1+Hga1，Hind3+Hga1)来证明。在再转化之后挑选出一个“纯”的突变种pKFN9作进一步使用。
pKFN9的构建于图3举例说明。
例2B27Glu人胰岛素的制备用Thr-OBut进行B27Glu，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰岛素的转肽作用，再用三氟乙酸酸解得到的苏氨酸酯来制备B27 Glu人胰岛素。制备包括以下步骤Ⅰ.具有B27 Glu，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)胰岛素编码的基因的构建在合成的胰岛素前体基因下游、唯一Xba1部位上质粒pKFN27被线性化。为了不因填补步骤而引起对Xba1位置的破坏，把下述19-聚物Hind3-Xba1双股链。
Xba1 Hind3CTAGAAGAGCCCAAGACTATTCTCGGGTTCTGATTCGA连结到被线性化质粒的每一末端。该链是在Xba1单股末端被5′-磷酸化的，而在Hind3末端保持未磷酸化，因而能避免在连结步骤期间链的聚合和DNA的环化，见图4。
借助用ExoⅢ核酸酶处理，将5′-单核苷酸从所获得的线性双链DNA的3′-末端上除去。ExoⅢ核酸酶的处理是在23℃下进行的，大约有250个核苷酸从DNA的每个3′-末端被除去(L.Guo和R.Wu(1983)酶学方法100，60-96)。
5′-磷酸化的25-聚突变引物d(GTTTCTTCTACGAACC TAAGGCTGC)退火到突变部位。在T4连结酶存在下，用Klenow聚合酶填补后，双链DNA因Xba1而溶解。借助T4连结酶在单链中形成具有突变作用的异源双螺旋环状DNA。
把该连结混合物转化到精选抗氨苄青霉素的大肠杆菌(r-，m+)(MT172)。
通过用5′-32P-标记的25-聚突变引物的克隆杂交来鉴定突变体。在再转化以后，来自于所得到的一个克隆的质粒pKFN37通过0.5kb Xba1-EcoR1片段的DNA定序被证明含有所需的突变(A.Maxam和W.Gilbert(1980)酶学方法65，499-560)。
Ⅱ.转化在YPGaL培养基(1% Bacto酵母膏，2% Bacto蛋白胨，2%半乳糖，1%乳酸)上培养酒酵母株MT663(E2-7B×E11-3C 2/α，△tpi/△tpi，Pep 4-3/Pep4-3)至OD600nm为0.6。
通过离心采集100ml的培养物，用10ml水洗涤，再离心並重新悬浮于10ml的1.2M山梨醇、pH＝8.0的25mM Na2EDTA、6.7mg/ml二硫苏糖醇的溶液中。悬浮液置于30℃下保温15分钟，离心后再将细胞悬浮于10ml的1.2M山梨醇、10mM Na2EDTA、pH＝5.8的0.1M柠檬酸钠、2mg Novozym
234溶液中。悬浮物置于30℃下保温30分钟，通过离心收集细胞，用10ml的1.2M山梨醇和10ml的CAS〔1.2M山梨醇、10mM CaCl2、10mM Tris(Tris＝三(羟甲基)-氨基甲烷)pH＝7.5〕的溶液洗涤，並再悬浮于2ml的CAS溶液内。为了转化，使0.1ml CAS-悬浮的细胞与近1μg的pKEN37质粒混合，在室温下保持15分钟。加入1ml20%聚乙醇4000，10mM CaCl2，pH＝7.5的10mM Tris溶液，将该混合物置室温下保持30分钟。该混合物被离心，所得到的小片物再悬浮于0.1ml的SOS(1.2M山梨醇、33%V/V YPGaL，6.7mM Cacl2，14ug/ml亮氨酸)中，並于30℃下保温2小时。悬浮液然后再离心，所得小片物重悬浮于0.5ml的1.2M山梨醇中。于52℃下加入6ml的顶琼脂〔Sherman等人的SC培养基，(酵母属方法，Cold Spring Harbor实验室，1981)，省略亮氨酸而含1.2M山梨醇，加2.5%的琼脂〕，悬浮液倾倒于含相同琼脂一固化的，含培养基的山梨醇培养板的顶端。转化的克隆于30℃下3天后挑出，再分离並用作为起始液培养物。挑选这样一个转化株KFN40(＝MT663/pKFN37)以便进一步说明。
Ⅲ.B27 Glu，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)胰岛素前体的表达酵母株KFN40在YPD培养基(1%酵母膏，2%蛋白胨(两者均来自Difco实验室)，和2%葡萄糖)上培养生长。10ml的这种菌株培养物于30℃下摇荡至OD600为26。离心之后上清液用反相HPLC分析，得到13.5mg/L前体。
上清液中的这种类似物于低pH值下在阳离子交换柱上浓缩，继之用合适的缓冲溶液解吸。用醇化的柠檬酸盐缓冲液进行结晶。
Ⅳ.转肽作用把0.2mole(47.1g)Thr-OBut，HOAC溶解于DMF，得到100ml溶液，加入50ml 76.5%V/V的DMF水溶液，並将10克B27Glu，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰岛素粗制品溶解于该混合溶液中，並于12℃下保温。然后加入含1克胰蛋白酶的25ml 0.05M醋酸钙溶液，于12℃下经24小时后，将该混合物加到2升丙酮中，然后将沉淀的肽通过离心分离再真空干燥。用硅胶-C18作柱填料的制备HPLL柱上提纯B27 Glu，B30 Thr-OBut人胰岛素。
Ⅴ.转变成B27人胰岛素将B27Glu，B30Thr-OBut人胰岛素溶解于100ml的三氟乙酸中，室温下2小时后该溶液被冷冻干燥。将冷冻干燥后的粉末溶解于400ml pH为7的47.5mM柠檬酸钠中。肽在加入2.4ml 1MZnCl2后，pH5.5的条件下沉淀，通过离心分离再真空干燥，产品用阴离子交换层析提纯，再用凝胶过滤脱盐。产率B27Glu人胰岛素1.7克。
例3B9Asp人胰岛素的制备用Thr-OBut对B9Asp，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰岛素进行转肽，然后用三氟乙酸酸解所获得的苏氨酸酯而制得B9Asp人胰岛素。
Ⅰ.具有B9Asp，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰岛素编码基因的构建构建这种基因的方法与对具有B27Glu，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰岛素编码的基因所述的通过用23-聚突变引物d(CTTGTGCGGTGACCACTTGGTTG)引导的pKFN27部位特异突变的方法相同。质粒pKFN38被证明含有要求的突变。
Ⅱ.转化采用与例2，Ⅱ相同的步骤将质粒pKFN38转化到酒酵母株MT663中，並分离出转化株KFN41。
Ⅲ.B9Asp，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰岛素的表达用与例2、Ⅲ相同的方法，在YPO培养基上培养酵母株KFN41。在上清液中得到2.5mg/l的胰岛素类似物的前体。
Ⅳ.转肽作用按例2，Ⅳ所述那样将7.4克B9 Asp，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰岛素粗制品进行转肽作用而得到B9Asp，B30Thr-OBut人胰岛素。
Ⅴ.转变按例2，Ⅴ所述那样将B9Asp，B30Thr-OBut人胰岛素转变成B9Asp人胰岛素。产率B9Asp人胰岛素0.83克。
例4B9Asp，B27Glu人胰岛素的制备是用Thr-OBut对B9Asp，B27Glu B(1-21)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰岛素进行转肽作用，再用三氟乙酸酸解所获得的苏氨酸酯。
Ⅰ.具有B9Asp，B27Glu，B(1-29)Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰岛素编码基菌的构建pKFN38(见例3)的一个367bp EcoR1-Hind 3片段和pKFN37(见例2)的一个140bp Hind3-Xba1片段被连结到质粒PUC13的大Xba1-EcoR1片段上(质粒PUC13是根据Vieira等人(1982)对pUC8和pUC9所述那样构建的，Gene19，259-268)。该连结混合物被转化到选择抗氨苄青霉素的大肠杆菌(MT172)上。质粒是由一些转化来制备的，並通过用Pst1和Hind3的溶解加以分析。显示出正确抑制酶图形的一种质粒的0.5kb Xba1-EocR1片段，被连结到都由pMT644得到的7.8kb Xba1-Kpn1和4.3kb Kpn1-EcoR1两种片段上(申请号为1293/84的丹麦专利已述)。该连结混合物被转化到选择到的抗氨苄青霉素的大肠杆菌(MT172)上。由所得到的一个克隆而来的质粒pKFN43通过0.5kb Xba1-EcoR1片段的DNA定序被证明含有所要求的胰岛素衍生物前体的基因。图5举例说明了pKFN43的构建。
Ⅱ.转化用与例2、Ⅱ相同的工艺将质粒pKFN38转化成酒酵母株MT633，並分离出转化株KFN44。
Ⅲ.B9Asp，B27Glu，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰岛素的表达像例2，Ⅲ所述那样，在YPD培养基上培养酵母株KFN44。在上清液中得到7.3mg/l的这种胰岛素类似物前体。
Ⅳ.转肽作用按例2，Ⅳ所述，对12.7克B9Asp，B27Glu，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰岛素粗制品进行转肽作用，得到B9Asp，B27Glu，B30Thr-OBut人胰岛素。
Ⅴ.转变按例2、Ⅴ所述那样，把B9Asp，B27Glu，B30 Thr-OBut人胰岛素转变成B9Asp，B27Glu，B30Thr人胰岛素並提纯。产率1.0克的B9Asp，B27Glu人胰岛素。
例5A8His，B9Asp，B27Glu人胰岛素的制备通过用Thr-OBut将A8His，B9Asp，B27Glu，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰岛素进行转肽作用，並按例2所述用三氟乙酸酸解所获得的苏氨酸酯来制备A8His，B9Asp，B27Glu人胰岛素。
Ⅰ.具有A8His，B9Asp，B27Glu，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰岛素编码的基因的构建这种基因是通过用有缺口的双螺旋方法(Y.Morinaga，T.Franceschini，S.Inouye，和Inouye(1984)，Biotechnology2，636-638)进行寡聚核苷酸的引导突变而构成的。具有MFα1先导序列编码的pUC13衍生质粒和B9Asp，B27Glu人胰岛素前体(图5)用HpaI和Xba1切割，其大片段和用NdeI线性化的质粒混合。在加热变性和冷却后该混合物含有在相应于胰岛素前体基因(HpaI-XbaI)的范围内有一个单链“孔”的带缺口的双螺旋。37-聚突变失配引物d(GAACAATGCTGTCACTCCATCTGCTCCTTGTACCAAT)借助于填充Klenow聚合酶和连结，被杂交到带缺口的双螺旋上。该混合物用于转化抗氨苄青霉素的大肠杆菌(MT172)。突变体用18-聚物5′-32P-标记的探查物d(AATGCTGTCACTCCATCT)来检验。在再转化之后，来自所得到的一个菌落中的质粒通过0.5kb XbaI-EcoR1片段的DNA定序被证明含有所需的突变。按例4中对pKFN43所述的那样，这种质粒用于构建酵母质粒pKFN102。
Ⅱ.转化按例2、Ⅱ相同的方法将质粒pKFN102转化到酒酵母株MT663上，並分离出转化株KFN109。
Ⅲ.A8His，B9Asp，B27Glu，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰岛素的表达按例2、Ⅲ，所述，在YPD培养基上培养酵母株KFN109。在上清液中发现了21.5mg/l的胰岛素类似物的前体。
Ⅳ.-Ⅴ.转肽作用和转变按例2、Ⅳ-Ⅴ所述，将22.0克的A8His，B9Asp，B29Glu，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰岛素进行转肽、转变和纯化。产率4.0克的A8His B29AspB27Glu人胰岛素。
例6B12Ile人胰岛素的制备B12Ile人胰岛素是通过如例2所述，用Thr-OBut对B12 Ile，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰岛素进行转肽作用，再用三氟乙酸酸解所获得的苏氨酸酯而制得的。
Ⅰ.具有B12Ile，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰岛素编码的基因的构建具有MFα1引物(负Glu-Ala-Glu-Ala)-B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)编码的pMT598(申请号为0163529A的欧洲专利中说明了质粒pMT5 98的构建)的0.5kb EcoR1-Xba1片段被插入到用Xba1-EcoR1切割的M13mp10RF噬菌体中，并从M13mp10重组噬菌体中提纯相应的单股DNA，这种单股模板DNA被杂交到一个突变的27-聚引物NOR-92d(GTAGAGAGCTTCGATCAGGTGTGAGCC)和一个M13全定序引物d(TCCCAGTCACGACGT)上。这些引物用dNTps和Klenow聚合酶延伸並用T4DNA连接酶连结。突变引物KFN92被选得破坏了BstN1部位(在Xba1-EcoR1片段中唯一的)。因此，为了在未突变的EcoR1-Xba1片段中进行选择，先用BstN1，接着用EcoR1和Xba1切割该混合物，再连结到切割了pUC13媒介的EcoR1和Xba1上。从所获得的一株转化株中，挑选胰岛素编码顺序中缺少BstN1部位的质粒，pMT760。所需的突变序列除了在B12(Val-Ile)处的突变外，含有相当于pMT598(见上)同一片段的0.5kb EcoR1-Xba1序列。该突变序列再通过将pMT760的0.5kb EcoR1-Xba1片段连结到pMT644的7.8kb Xba1-Kpn1和4.3kb Kpn1-EcoR1片段上面被转移到酵母表达质粒以得到pMTA。
Ⅱ-Ⅴ.转化、表达、转肽、转变按例2、Ⅱ所述，将质粒pMTA转化成酵母株MT663，按例2、Ⅲ所述培养转化株MTA。在上清液中发现有10.4mg/l的胰岛素类似物的前体。将10克这种类似物前体的粗制品按例2，W-V所述进行转肽、转变和提纯。产率B12 Ile人胰岛素1.3克。
例7B12Tyr人胰岛素的制备B12Tyr人胰岛素能通过如例2所述一样，用Thr-OBut对B12Tyr，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰岛素进行转肽，再用三氯乙酸酸解所得到的苏氨酸酯来制备。
Ⅰ.具有B12Tyr，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰岛素编码基因的构建除了以引物KFN93d(GTAGAGAGCTTCGTACAGGTGTGAGCC)代替KFN92外，其余均采用与制备具有B12Ile，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰岛素编码的基因相类似方法构建基因。
Ⅱ-Ⅳ.转化、表达、转肽、转变如例2所述那样执行步骤Ⅱ-Ⅲ，在上清液中得到1.7毫克/升的胰岛素类似物前体。将该类似物前体粗品，如实施例2Ⅵ-Ⅴ所述那样，可被转肽、转变和纯化，给出B12酪氨酸人胰岛素。
实施例8B10Asp人胰岛素的制备如实施例2所述的方法，将B10Asp，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰岛素，通过用苏氨酸OBut转肽，然后用三氟乙酸酸解所得到的苏氨酸酯来制备B10Asp人胰岛素。
Ⅰ.具有B10Asp，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰岛素编码的基因之构建该基因通过类似于用以制备具有B12Ile，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰岛素编码基因的方法来构建，不同之处仅在于用引物KFN94 d(AGCTTCCACCAGATCTGAGCCGCACAG)来代替引物KFN92。
Ⅱ-Ⅴ.转化、表达、转肽、转变如例2所述的那样执行步骤Ⅱ-Ⅲ，在上清液中得到36毫克/升的人胰岛素类似物前体。如例2Ⅳ-Ⅴ中所述的那样，对该类似物前体粗品进行转肽、转变和纯化。产率B10Asp人胰岛素7.6克。
实施例9B28Asp人胰岛素的制备将B28Asp，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰岛素，通过用Thr-OMe基转肽，然后在pH值大约为8至12时水解所得的苏氨酸酯来制备B28Asp人胰岛素。
Ⅰ.具有B28Asp，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰岛素编码的基因之构建具有MFα1前导物(负Glu-Ala-Glu-Ala)-B-C-A编码的PMT462(质粒PMT462的构建在丹麦专利申请号No 1257/86中已被描述)的0.5kb EcoR1-Xba1片段，即修饰过的Mbα1前导物之前的人胰岛素原的基因，插入到用Xba1-EcoR1切割的M13mp10RF噬菌体中，然后从M13mp10重组噬菌体中纯化相应的单股DNA。把该单股模板DNA杂交到突变的41聚引物NOR205d(TTCCACAATGCCCTTAGCGGCCTTGTCTGTGTAGAAGAAGC)和M13通用定序引物d(TCCCAGTCACGACGT)上，这些引物通过dNTPs和Klenow聚合酶伸展，再由T4DNA连接酶连接。
在酚提取，乙醇沉淀和再悬浮之后，用限制性内切酶Apa1，Xba1和EcoR1切割该DNA，再一次的酚提取，乙醇沉淀和再悬浮之后，将DNA与EcoR1-Xba1切割的pUC13连接。将该连接混合物转化到一种大肠杆菌(r-，m+)株中，然后由一些转化株来制备质粒。用EcoR1和Xba1切割质粒制品，同时在0.5和0.6千碱基显示区带的制品转化到大肠杆菌中。从再转化中只选择具有0.5插入物的PU13的转化株。
从所得的转化株之一中选择一个在B28(Pro→Asp)处具有所需突变的质粒pMT881。该突变序列由Maxam-Gilbert DNA定序来鉴定。然后通过将pMT881的0.5千碱基的EcoR1-Xba1片段连接到由pMT644得到的7.8千碱基和4.3千碱基的片段上，把该突变序列转移到酵母表达质粒上，以得到PMTAI。
Ⅱ.转化从例2、Ⅱ相同的工艺，将质粒PMTAI转化到酒酵母株MT663中，然后分离转化株MTAI。
Ⅲ.B28Asp，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰岛素的表达如例2、Ⅲ所述的方法那样，把酵母株MTAI在YPD培养基上培养生长，在上清液中得到7.2毫克/升的胰岛素类似物前体。
Ⅳ.转肽如例2、Ⅳ所述的方法，通过用Thre-OMe代替Thr-OBut将B28Asp，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)的粗品转肽，给出B28Asp，B30Thr-OMe胰岛素。
Ⅴ.转变将B28Asp，B30Thr-OMe人胰岛素在水中分散到1%(W/V)，再加入1当量NeoH到pH值为10.0而被溶解。在25℃下将该pH值保持恒定24小时。所形成的B28Asp人胰岛素，通过加入氯化钠至大约8%(W/V)，加乙酸盐三水合物至大约1.4%(W/V)，以及加乙酸锌二水合物至大约0.01%(W/V)再加上1当量的盐酸调节pH值为5.5之后使之沉淀。通过离心法分离该沉淀物，並通过阴离子交换层折纯化，用凝胶过滤法脱盐。产率B28Asp人胰岛素0.2克。
例10A21Asp，B9Asp，B27Glu人胰岛素的制备从B9Asp，B27Glu人胰岛素，通过选择性脱酰氨基作用(在37℃，pH2.5下水解5%的溶液14天)制备A21Asp，B9Asp，B27Glu人胰岛素。通过阴离子交换层析分离出此脱酰氨基的产物。
例11B27Glu，A21Asp人胰岛素的制备用例2所述的方法，将B27，A21Asp，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)通过用苏氨酸OBut转肽，然后用三氟乙酸酸解所得的苏氨酸酯来制备B27Glu，A21Asp人胰岛素。
如例10所述方法那样，通过脱酰氨基作用，由B27Glu，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)(见例2)制备B27Glu，A21AspB(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)本发明的人胰岛素类似物的特性分子量的确定(GutfreundH·生物化学杂志，42(544)1948)方法Knauer膜渗压计型号1.00膜Schleicher和Schull膜膜型号R52溶剂0.05M Nacl pH7.5湿度21℃结果所有类型的胰岛素在4毫克/毫升的浓度下被测定。
表1胰岛素的类型 分子量千道尔顿人的2锌胰岛素 36±2人的无锌胰岛素 29±1无锌B27Glu人胰岛素 22±1″″B12Ile人胰岛素 17±1″″B27Glu，A21Asp人胰岛素 8±1″″B9Asp，B27Glu人胰岛素 6±1″″B9Asp人胰岛素 6±1″″B9Asp，B27Glu，A21Asp人胰岛素 6±1″″B9Asp，B27Glu，A8His人胰岛素 9±3由表1可见，人胰岛素类似物的分子量与人胰岛素比较显著的降低。这表明其自身联结形成二聚物、四聚物和六聚物很少，或者在一些场合下甚至没有。
半衰期和生物效力人胰岛素类似物 T1/2＊人胰岛素的生物效力＊＊(人胰岛素的%) (95%Conf.间隔)B27Glu人胰岛素 78 101(83-123)B9Asp，B27Glu 54 110(90-139)人胰岛素B12Ile人胰岛素 78 91(80-103)B27Glu，A21Asp 56 64(58-71)人胰岛素B9Asp人胰岛素 52 80(72-90)A21Asp，B9Asp 56 75(66-85)B27Glu人胰岛素A8His，B9Asp， 68 116(101-135)B27Glu人胰岛素＊从猪的注射部位(皮下)消失50%的时间。根据Binder 1969(Acta pharmacol.Toxiccl(Suppl 2)27∶1-87)的方法。
＊＊根据欧洲药典中小鼠血液葡萄糖测定法。
从表2可见，与人胰岛素相比，胰岛素类似物从注射部位消失50%的时间显著下降。
该胰岛素类似物的生物效应类似于人胰岛素，或者只低一些。
权利要求
1.速效的人胰岛素类似物，其特征在于它们具有这样的形式(式1)
其中X是人胰岛素的氨基酸残基或者是相同或不同的氨基酸残基取代基，其基本作用是使该分子在PH值为中性的时候，具有与人胰岛素相同或者更大的负电荷，但须在胰岛素分子的相应位置上，至少要有一个X与人胰岛素的氨基酸残基不同，並且在A(8)位上的X是His，或Phe；在A(21)位上的X为Asp，在B(5)位上的X为Ala，在B(9)位上的X为Leu，在B(10)位上的X为Asu或Leu，在B(12)位上的X为Asn或者在B(26)位上的X为Ala，此外，其余的X中至少有一个X不同于胰岛素分子相应位置上的人胰岛素的氨基酸残基，并且还须有一个或多个氨基酸残基可以从A和/或B链的N和/或C端上除去。
2.根据权利要求
1的胰岛素类似物，其中的氨基酸残基取代基比胰岛素分子中相应位置上的人胰岛素氨基酸残基更加亲水。
3.根据权利要求
1的人胰岛素类似物，其中大约少于7个的X不同于人胰岛素中相应位置的氨基酸残基。
4.根据权利要求
1的人胰岛素类似物，其中的氨基酸取代基从Asp、Glu、Sen、Thr、His、Ile组成的组中选择。
5.根据权利要求
1的人胰岛素类似物，其中的氨基酸残基取代基是Asp和/或Glu。
6.根据权利要求
1的胰岛素类似物，其中在B(9)，B(12)或B(27)位上的X至少有一个不同于人胰岛素分子中相应位置上的氨基酸残基。
7.根据权利要求
1的人胰岛素类似物，其中B27位上的X为Glu，B12位上的X为Ile或Tyr，A21位上的X为Asp和B27位上的X为Glu，B9位上的X为Asp，A21位和B9位上的X为Asp而B27位上的X为Glu，A8位上的X为His，B9位上的X为Asp和B27位上的X为Glu，B10位上的X为Asp或B9位上的X是为Asp而B27位上的X是Glu，或B28位的X为Asp。
8.根据权利要求
1的人胰岛素类似物，其特征在于在B链和N末端缺少直至4个氨基酸残基和/或在B链的C末端缺少直至5个氨基酸残基。
9.根据权利要求
9的人胰岛素类似物，其特征在于它们缺少B(1)-氨基酸残基和/或B(30)氨基酸残基。
10.一种制备权利要求
1的人胰岛素的方法其中的酵母株包含一种可复制的表达载体，该载体含有一个具有胰岛素类似物前体编码的DNA序列，将该酵母株在一个稳定的营养培养基中培养，从培养介质中回收此前体，然后在试管内通过酶和化学变换转变成新的胰岛素类似物。
11.制备权利要求
1的人胰岛素类似物的一种方法，其中生物合成的凝胶体为通式Ⅱ
其中Qn为具有n个天然存在的氨基酸残基的肽链，R为Lys或Arg，n为从0到33的一个整数，m为0或者1，而X与前面规定的一样，但以该肽链-Qn-R-不含有二个邻接的基本氨基酸残基为条件，该生物合成前体在胰蛋白酶或者胰蛋白酶衍生物存在下，与L-苏氨酸酯反应，然后用已知的方法将所得的人胰岛素类似物的苏氨酸酯转变成人胰岛素类似物。
12.一个生产权利要求
1的人胰岛素类似物的方法，其中生物合成前体的通式为Ⅲ
其中S和T各为Lys或Arg，X为前面规定的一样，该生物合成前体在水溶液中与肽和羧肽酶反应，然后从该反应混合物中回收人胰岛素类似物。
13.一个制备权利要求
1的人胰岛素类似物的方法，其中含有所需的氨基酸取代基的胰岛素类似物是根据已知方法化学合成的，或者根据已知的方法化学合成含有所需的氨基酸取代基的A链和B链，然后建立二硫桥，把该修饰过的A链和B链，在A(7)Cys和B(7)Cys之间，与A(20)Cys和B(19)Cys之间，A链内的A(6)Cys和A(11)Cys之间连接起来。
14.具有胰岛素活性的注射液，其特征在于它们含有权利要求
1的人胰岛素类似物或最好在PH中性时在亲水溶液中它的药学上可接受的盐。
专利摘要
本发明提供了新的速效人胰岛素类似物，其自身结合成二聚物、四聚物、六聚物或多聚物的倾向较小。该新的人胰岛素类似物是通过用天然存在的氨基酸残基取代人胰岛素中的一个或多个氨基酸残基的方法得到的。氨基酸残基取代基最好比分子的相应位置上的天然氨基酸残基更亲水。另外，该胰岛素类似物在中性pH值时与人胰岛素相比，具有相同或更大的负电性。氨基酸取代基以天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、组氨酸和异亮氨酸为好，向更好的取代基是天冬氨酸和谷氨酸。该新的胰岛素类似物可以用于速效胰岛素溶液的制备。
文档编号C12N15/81GK86106574SQ86106574
公开日1988年8月3日 申请日期1986年8月28日
发明者杰斯·约根·维尔加德·布朗格, 克杰德·诺里斯, 莫根斯·特里尔·翰森 申请人:诺沃工业联合股票公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan