专利名称：鹿茸生长因子制剂及工艺的制作方法
鹿茸生长因子制剂是用鹿茸为原料，经渗滤分离得到的主要含有生长因子的制剂，其工艺是经粉碎浸提再除菌层析分离出生长因子制剂的方法。
已有的细胞生长因子，如1956年Liva，Montolcini从蛇毒中分离出神经生长因子NGF，后有从小鼠颌下脉分离出NGF，从牛脑身体提取出FGF等。细胞生长因子是一类肽类生物活性物质，具有极强的生物活性，对人体发挥着细胞生长分化及调控作用，可用于治疗神经系统退型性疾病，脑外伤、贫血及糖尿病等。经上述分离提取出的生长因子还只是用于实验。由于这些来源的生长因子制剂还会有异种蛋白抗元性和缺乏安全性依据，现还没有制成药品和用于临床。细胞生长因子来源是用于临床药物生产的难题。因此在90年代出现了应用基因工程技术，以人的生长因子基因植入大肠杆菌中经增菌表达再分离NGF制备方法。
本发明的目的在于提供一种易得并具有安全性、付作用较小的，能用于临床的细胞生长因子制剂及制备方法。
本发明的细胞生长因子为鹿茸生长因子制剂，其为鹿茸经渗滤分离得到的含有神经生长因子(BGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、上皮细胞生长因子(EGF)等无异种蛋白抗元性多肽类制剂。经渗滤分离得到的鹿茸生长因子制剂，其活性物质主要是以5000-50000的分子量多肽形式存在。为了使主要活性物质尽可能地发挥作用，所以本发明的鹿茸生长因子制剂最好为5000-50000分子量的多肽为主的制剂。根据鹿茸中生长因子的特性，经分离的制剂为PH值为5-9.5。也可以用鹿茸经渗滤分离得到的主要含神经生长因子(NGF)的肽制剂。而且最好为14000-15000分子量肽为主的制剂。还可以为用鹿茸经渗滤分离得到的主要含成纤维细胞生长因子(FGF)或主要含上皮细胞生长因子(EGF)肽类制剂。这些制剂都直接作为细胞生长和调控的医药制品。
鹿茸是传统药物原料，是有多种补益作用，已有上千年的药用历史，经浸提出的药物无论是口服和注射都均已经应用证明，具有很好的安全性，无副作用，无异种蛋白抗元反应。所以用鹿茸经渗滤分离出以细胞生长因为主的制剂，具有很好的安全性，无付作用，无异种蛋白抗元反应，更不会有病源的传染。特别是由鹿茸经渗滤分离得到的生长因子制剂中神经生长因子(NGF)还天然洛合有神经节苷脂，更能促进神经生长因子的药效作用。可以形成含有神经生长因子与神经节苷脂天然洛合的鹿茸生长因子制剂，这样的制剂活性更好，形成了更有效的药物制剂。
以往的鹿茸加工多是将鲜鹿茸在开水中蒸煮，干燥存放。在使用时多用酒浸渗提取，或同其他原料一同煎煮，这样就将鹿茸中的细胞生长因子损失，最后只可能会有很微量细胞生长因子。即使有的鹿茸采取冷冻干燥，但在煎煮时，绝大部分细胞生长因子，特别是神经生长因子、成纤维细胞生长因子，上皮细胞生长因子在高温度下也都损失了。有用生物技术浸提分离的，也只是针对氨基酸、神经髓鞘磷脂、前列脉素、雄雌激素，胆碱多糖等物质而进行的。提取分离出的药物也只是以这些物质为主的，可能只会有极少的细胞生长因子。
所以本发明鹿茸生长因子制剂的制备方法是将鹿茸粉碎浸提，将活性的生长因子渗出。浸提液经抽滤除菌后，经层析分离出含有神经生长因子、成纤维细胞生长因子、上皮细胞生长因子等多肽制剂。为了使鹿茸中的活性成份存活，对于鹿茸需要存放后集中加工生产制剂的，在新鲜时最好先将鲜鹿茸冷冻、也可冷冻干燥保存，而后在低温下进行粉碎，一般都在4℃以下进行粉碎。为了有效充分地浸提出活性的细胞生长因子，浸提最好采用PH值在5-9.5的缓冲液进行浸提，也可以分别用PH5-9.5范围的多种PH值缓冲液分别进行浸提。如用PH5.0的0.05MHAC-NAC缓冲液，或用PH6.8的0.25mml/l磷酸缓冲液浸提，或用PH9.0的Tris-HCl缓冲液浸提。为了获取神经生长因子、成纤维细胞生长因子及上皮细胞生长因子，浸提液经过抽滤除菌后，层析分离采用5000D和50000D滤膜或分子筛经两次过滤，分离出主要含细胞生长因子5000-50000分子量的多肽制剂。一般是先用5000D滤膜或分子筛层析过滤出大于5000D的物质。再用50000D滤膜或分子筛层析过滤掉大于50000D的物质。这样就简单方便地层析出5000-50000分子量的多肽制剂，也就是本发明的以神经生长因子、成纤维细胞生长因子及上皮细胞生长因子为主的鹿茸生长因子制剂。
为获取以神经生长因子或神经生长因子及自然洛合的神经节苷脂为主的鹿茸生长因子制剂。可将粉碎的鹿茸经过PH5-9.5的缓冲液浸提后，浸提液经5000D滤膜过滤收集浓缩液M1，收集物分子量大于5000D。将M1浓缩液上柱CM leclutose32，后用含有0.4molNaCl的0.05mol/l Tris-HCl PH9.0洗脱液洗脱，洗脱过程收集活性峰Ⅲ、Ⅳ的脱洗液，再用收集的脱洗液上柱SephadexG50。用含有0.2mol/l NaCl0.05mol/lPH9.0的Tris-HCl洗脱液洗脱。洗脱过程收集活性峰Ⅱ，得到PH9.0-9.65、分子量为14000-15000的神经生长因子。或者，将M1浓缩液上柱CM-Cellntose32，用0.05M HAC-NaAC PH5.0的洗脱液洗脱。洗脱过程收集活性ⅢⅤ的洗脱液。收集的洗脱液冻干后上柱SephadexG50，再用0.05M HAC-NaAC PH 5.0缓冲液洗脱，洗脱过程收集活性峰Ⅱ的洗脱液，即得到了分子量在15000左右，PH在5.8的神经生长因子制剂。
再用M1浸提浓缩液经盐析，上柱羟甲基-Sephadex C50。经0.05M PH9.0的磷酸缓冲液洗脱，洗脱过程收集活性峰Ⅲ的洗脱液，经冻干再上柱Sepharose-肝素亲和层析。用0.05M PH9.0磷酸缓冲液洗液，洗脱过程收集活性峰Ⅱ、Ⅲ的洗脱液，则得到βFGF为主的制剂。
本发明与已有技术相比，本发明的鹿茸生长因子制剂没有对人体的异种蛋白抗原性，没有其他的付作用，没有其他有害成份，具有较高的安全性，可以广泛用于临床。对治疗神经系统退型疾病，脑外伤、脑血管性脑损伤，贫血及糖尿病有很好的疗效。用本发明制取方法制得的鹿茸生长因子制剂，生长因子损失少，提取率高，生长因子含量高，具有很好的活性。
下面结合实例进一步说明本发明制备方法及制剂。
将鲜的鹿茸冷冻干燥后，在低温下进行粉碎。将粉碎的鹿茸浆加入到4℃双蒸无菌水浸提液中浸提24小时。浸提两次。第一次用五倍于鹿茸浆的浸提液。第二次用比第一次的滤渣多一倍的浸提液。合并两次的浸提滤液。将浸提滤液过5000D中空纤维超滤膜，收集过滤的浓缩液。此时收集的过滤浓缩液为含有分子量＞5000D的收集物。再将此滤液用50000D的中空纤维超滤膜滤过收集到了含有分子量在5000-50000的多肽鹿茸生长因子制剂M1。用这种制剂可配制成多种中药注射剂、口服剂和外用剂。这种渗滤分离得到的制剂，其总氮含量为13.6%，比传统的加热浸提法的制剂(总氮含量为7%)多得6.6%。经活性测定，活性比加热浸提法增加5倍以上。用M1制剂上柱CM-Cellulose32，再用0.4molNaCl的0.05mol/L Tris-HCl缓冲液进行冲柱洗脱，缓冲液PH为9.0。在洗脱过程收集活性峰ⅢⅣ的洗脱液。将收集的洗脱液上柱SephadesG50，再用含有0.2mol/L NaCl 0.05mol/L PH9.0的Tris-HCl缓冲液进行冲柱洗脱。洗脱过程中收集活性峰Ⅱ的洗脱液。该液脱液则为PH9.1-9.7，主要含有分子量在14000-15000的神经生长因子的鹿茸生长因子制剂。所用的活性测试仪为280mm紫外检测仪。该制剂经电泳分析系统，得到三条带。经对比，分别为PH9.15、9.45和9.65，分子量为14500左右的(NGF)神经生长因子。
用M1制剂上柱CM-Cellulose32，再用0.05M HAC-NAC PH 5.0的洗脱液冲柱洗脱。用280mm柴外控测仪控测，而收集活性峰ⅣⅤ的洗脱液。收集的洗脱液经冻干浓缩后，上柱SehadexG 50，再用0.05M HAC-NaACPH5.0缓冲液洗脱，收集活性峰Ⅱ的洗脱液。收集的洗脱液就为含NGF(神经生长因子)的鹿茸生长因子制剂。经测试分析，该制剂的NGF的分子量为15000左右，PH值为5.8，含有122个氨基酸。
用M1制剂经硫酸胺盐析，再上柱羟甲基-Sephadex C50，并用0.05M PH9.0磷酸缓冲液洗脱。收集活性峰Ⅲ的洗脱液。收集的洗脱液经冻干浓缩后，上柱Sepharose-肝素亲和层析，并用0.05M PH9.0磷酸缓冲液洗脱，收集活性峰ⅡⅢ的洗脱液。这就得到了含FGF(成纤维细胞生长因子)的鹿茸因子生长制剂。该制剂经测试分析，含有βFGF的成纤维细胞生长因子。
另一实例为将鲜鹿茸冷冻干燥再粉碎成浆状，用双蒸或PH9.0Tris-HCl缓冲液0.05mol/L进行浸提。将浸提液经G6漏斗抽滤除菌，再上柱CM-Cellulose32。用含0.4molNaCl的0.05mol/LPH9.0Tris-HCl缓冲液洗脱。收集的洗脱液经冻干浓缩或用1000D中空纤维超滤膜过滤，得到鹿茸生长因子制剂。该制剂经SDS-聚丙稀酰胺凝胶电冰测试，可见4条以上区带，经对此分析，PH9.1-9.7之间的为NGF，PH9.5-10.0之间的为bFGF。
权利要求
1.鹿茸生长因子制剂是一种细胞生长和调控的医药制品，其特征为由鹿茸经渗滤分离得到的含有神经生长因子(NGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、上皮细胞生长因子(EGF)等无异种蛋白抗元性多肽成份的制剂。
2.如权利要求1所说的鹿茸生长因子制剂，其特征为多肽成份的分子量为5000-50000。
3.如权利要求1或2所说的鹿茸生长因子制剂，其特征为PH为5-9.5。
4.鹿茸生长因子制剂是一种细胞生长和调控的医药制品，其特征为由鹿茸经渗滤分离得到的含有神经生长因子(NGF)肽的制剂。
5.如权利要求4所说的鹿茸生长因子制剂，其特征为含有与神经生长因子洛合的神经节苷脂。
6.如权利要求4或5所说的鹿茸生长因子制剂，其特征为生长因子的分子量为14000-15000。
7.鹿茸生长因子制剂是一种细胞生长和调控的医药制品，其特征为由鹿茸经渗滤分离得到的含有成纤维细胞生长因子(FGF)肽的制剂或含有上皮细胞生长因子(EGF)肽的制剂。
8.鹿茸生长因子制剂的制备方法，是将鹿茸粉碎浸提，浸提液经过滤除菌，再经层析分离出含有神经生长因子、成纤维细胞生长因子、上皮细胞生长因子等多肽的制剂。
9.如权利要求8所说的制备方法，其特征在于鹿茸先经冷冻干燥，在低温下粉碎。
10.如权利要求8或9所说的制备方法，其特征在于浸提是用PH5-9.5的缓冲液分别浸提，层析分离用5000D和50000D滤膜或分子筛两次过滤出分子量在5000-50000的多肽鹿茸生长因子制剂。
全文摘要
鹿茸生长因子制剂及工艺是一种细胞生长和调控的医药制品及生产该制品的工艺。其是由鹿茸作为原料，经粉碎浸提、抽滤除菌、层析等过滤的渗滤分离，得到主要含有神经生长因子、成纤维细胞生长因子、上皮细胞生长因子等无异种蛋白抗元性的多肽成分制剂。主要用于治疗神经系统退型性疾病、脑外伤、贫血、糖尿病等。
文档编号A61K35/12GK1104095SQ9312154
公开日1995年6月28日 申请日期1993年12月24日 优先权日1993年12月24日
发明者霍玉书 申请人:霍玉书