专利名称：一种核-壳结构的蛋白高分子微球及其制法的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白载体，可用于制备靶向控释蛋白药物，属生物医用高分子材料及靶向控释给药领域。
目前，作为微球缓释药物系统的载体主要有蛋白微球及合成高分子微球两大类。该两类微球各有其优缺点。蛋白微球的基质一般为白蛋白及胶原蛋白。由于蛋白的亲水性，因而较易接合一些亲水性药物，其载药的方法可有多种。文献报道白蛋白微球的药物携载量可达40％(U.S.Patent，4,671,954，1987)，然而蛋白微球却有着在生物体内不稳定降解速度太快，经口服易被肠胃系统条件破坏的缺点。合成高分子微球的基质现一般为聚乳酸系列的高分子，因为该类高分子可在生物体内降解，毒付作用小。在体内稳定，不易被酶作用，肠胃道系统不敏感，可经口给药。但该种材料大多为亲油性故而对一些亲水性药物接载困难(大多数抗癌药物亲水)载药量低，特别是对一些亲水性蛋白的携载更显困难。聚乳酸系列微球对白蛋白的携载量不到5％(Vaccine，1991，9(10)，768-771)，对外膜蛋白的携载为0.1％左右(Vaccine，1994，12(5)，138)对胰岛素的携载量为2IU/100mg微球，这必然要影响给药剂量及疗效。
本发明的目的在于改善高分子微球的载药量及控释效果，将蛋白微球及合成高分子微球的优点结合起来，制备出一种新型的核壳结构载蛋白微球，该微球的核为蛋白基质，壳为聚乳酸高分子，其蛋白的重量含量可高达80％，其有效活性蛋白携载量达重量的40％。该微球的合成高分子壳成为蛋白核的保护层，增强了蛋白基质及其中的活性蛋白在生物体的稳定性，不论经口或是注射皆可达到靶向给药的目的。是一种理想有效的靶向控释制剂，适用于对胰岛素类型的蛋白药物的靶向控释给药。
本发明的技术内容①采用高分子溶液为分散介质，带双醛基的五碳链烃为交联剂的乳液化学交联法制备含活性蛋白药物的白蛋白的微球；②采用聚D，L-乳酸为亮基质，溶于有机溶剂，将①得到的蛋白微球分散在聚-D，L-乳酸有机溶液中，将含有蛋白微球的聚-D，L-乳酸溶液逐滴加入水相分散介质中，连续搅拌12-14小时，缓慢蒸干溶剂，用蒸馏水洗除分散介质便得核为蛋白、壳为聚乳酸的核壳结构微球。
在制备蛋白微球为核的核壳结构高分子微球时，微为其核的蛋白微球应是无水状态，以提高蛋白微球与聚乳酸之间的亲合性，增大包裹率。包裹蛋白微球前，应将蛋白微球浸泡在聚乳酸溶液中不少于12小时。
在含蛋白微球的聚D乳酸溶液加入到水相分散介质之前，需用超声波分散仪分散该混合体系。
本发明微球的核-蛋白微球的基质材料应选用具有较好水溶性的人血清白蛋白，牛血清白蛋白、卵白蛋白等，占蛋白总含量的50～90％，其所包裹的活性蛋白占总蛋白含量的10～50％。
本发明蛋白微球制备过程中，蛋白水溶液中蛋白浓度为10～30％。
本发明中的蛋白微球的制备过程，有机分散相应为聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或聚环氧丙烷-环氧乙烷(PEO-PPD)共聚物的甲苯/氯仿(T/C)溶液。PMMA的分子量应在104～105范围，PEO～PPD应为P55E33P56型。高分子在有机溶液中的浓度应为20～25％。
本发明蛋白微球的制备过程包含蛋白水溶液在有机溶液中的分散时间应不少于15分钟，双醛五碳链烃加入后的反应时间应不少于4小时，随后应加入过量乙醇胺以封闭反应的醛基，乙醇胺加入后的反应时间应不少于1小时。
本发明中使用的双醛五碳莲烃应为戊二醛，使用其25％的水溶液商品，戊二醛水溶液与蛋白的配比应为1～2ml/300mg蛋白。
作为本发明微球的蛋白微球核，其粒径应不超过3μm。
作为本发明微球的壳基质为聚-D，L-乳酸(PLA)系列，该类材料应包含聚D，L-乳酸-乙醇酸(PLLA)、聚D，L-乳酸-聚乙二醇(PLEG)、聚D，L-乳酸-ε-己丙酯(PLLA)等共聚物及聚-D，L-乳酸匀聚物。聚合物的分子量应在104～105范围。
作为本发明微球的制备工艺，蛋白与聚乳酸的重量比应为20～60∶40～80。
作为本发明微球制备所需的水相分散介质应为聚乙烯醇(PVA)水溶液，其浓度应在4～10％之间。
作为本发明的功能输入装置采用电磁搅拌器，搅拌速度范围为600～1000转/分。
本发明所制得的核壳结构微球粒径应不大于5μm。
采用本发明可制得具有较高活性蛋白含量的高分子微球，该微球是典型的核-壳结构、生物相容，可生物降解。通过口服或静注实现对生物体网状内皮系统组织的靶向给药。动物实验表明，采用化学交联法所制得的含胰岛素的人血清白蛋白微球(6单位/100mg)微球其中胰岛素活性未受到影响。对大白兔给药(80mg微球/公斤体重)20分钟后，大白兔血糖降至2mg/ml(正常值为5mg/ml)，5小半后，血糖降至1.0左右。
本发明的积极效果是由于本发明采用了核壳结构方式构造微球，保证了载体中的活性蛋白含量。克服了单一的聚乳酸材料包裹蛋白的低包裹率，增强了蛋白微球的实用性。由于蛋白微球的粒径在一定范围内分布，其核壳结构的壳的厚度也处于一定的分布，微球的蚀破可能在不同的时间发生，从而产生逐渐的间隙的释放过程，达到缓释的目的。故而，本发明微球适用于制备胰岛素控释载体而用于糖尿病治疗。给药的间隔周期可扩展到一个月以上，从而减轻病人的痛苦。
下面为
具体实施例方式实施例1蛋白微球核的制备。准确量取胰岛素溶液(40单位/毫升)2毫升，准确称取人血清白蛋白300mg并加入到胰岛素溶液中，待其溶解。量取含PMMA20％的甲苯/氯仿溶液15ml于三颈烧瓶中，用电磁搅拌器以250转/分的转速搅拌，搅拌条件下，逐滴加入完全溶解的白蛋白-胰岛素水溶液。量取聚25％戊二醛水溶液1ml，再加入1ml甲苯，将戊二醛甲苯混合液在旋涡混合器上振荡5分钟，之后静置，待分层后，用吸管吸取上层饱和了戊二醛的甲苯溶液加入到三颈烧瓶中，此时，蛋白水溶液在有机溶液中的分散时间应不少于15分钟。加入戊二醛之后，将瓶颈磨口塞紧，搅拌速度增到400转/分，交联反应开始，持续5小时，然后加入1ml乙醇胺，封闭未反应的游离醛基。1小时后，停止反应。反应产物依次用甲苯、丙酮、蒸馏水洗涤，洗干净后，用丙酮脱水干燥，称重292mg，产率95％，光学显微镜下观察粒径＜3μm。
实施例2包裹蛋白微球成核壳结构微球。准确称量PLEG500mg，溶于10ml二氯甲烷中，待其完全溶解，将干燥的蛋白微球粉加入有机溶液中，在超声波振荡器中，分散振荡，取出保持过液。量取6％的PVA水溶液15ml，装入100ml的广口瓶中，用电磁搅拌器搅拌。在搅拌条件下，将分散有蛋白微球的PLEG溶液逐滴加入倒水相分散介质中，转速增至600转/分，维持此速度30分钟，然后速度降至250转/分，搅拌12小时，待溶剂蒸发完毕，用蒸馏水洗涤，洗涤过程在离心机中进行，离心速度10000转/分，离心时间5分钟，重复8次。收集沉淀，冻干称重，650mg，产率82.3％，显微镜下观察粒径＜5μm。
权利要求
1.一种可生物降解，生物相容的高分子微球，其特征在于其结构为核-壳型，微球粒径在5um以下，核基质为白蛋白，壳基质为聚乳酸类高分子。
2.一种根据权利要求1的微球制备方法，依次包括以下步骤①采用高分子溶液为分散介质及戊二醛为化学交联剂制备含有效活性蛋白(或药物)的蛋白微球。②以制得的蛋白微球为核在水相高分子溶液中采用乳液溶剂蒸发技术制备壳层为聚乳酸类高分子的核-壳结构高分子微球。
3.根据权利要求1的微球，其特征是作为核的蛋白基质可采用人血清白蛋白、牛血清白蛋白及卵蛋白等蛋白，在核-壳结构中的重量含量可达20％～60％。
4.根据权利要求1的微球，其特征是作为壳层的合成高分子应可采用聚乳酸(PLA)，聚(乳酸-乙醇酸)(PLGA)，聚乳酸-聚乙二醇(PLEG)及(聚乳酸-ε-己内酯)(PLA)等聚乳酸类匀聚物或共聚物，在核-壳结构中的重量含量为40～80％。
5.根据权利要求1，3或4的微球，其特征是具生物活性的蛋白，包括胰岛素或疫苗抗原的重量含量可达40％。
6.根据权利要求1，3或4的微球，其特征是水溶性药物的重量含量可达30％。
全文摘要
一种可生物降解的核壳结构的高分子微球。该微球分为以白蛋白为基质的核及以合成可生物降解高分子为基质的壳层两部分，微球的制备包括依次进行的两个步骤。即1、在水/油体系中制备白蛋白微球，粒径＜3μm；2、在油/水体系中制备以白蛋白微球为核，合成高分子为壳的高分子微球，粒径＜5μm，活性蛋白如胰岛素在步骤1中加入，活性蛋白在该微球中的重量含量可达40％，可提供一种服用方便，药效作用时间长的胰岛素剂型。
文档编号A61K47/42GK1144714SQ9511148
公开日1997年3月12日 申请日期1995年9月5日 优先权日1995年9月5日
发明者李雄伟, 肖锦, 邓先模 申请人:中国科学院成都有机化学研究所