专利名称：土贝母苷甲制备治疗白血病的药物用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及土贝母苷甲在机体中抗癌的新用途。
众所周知，白血病是一种死亡率很高的血液疾病，临床上尚无很有效的治疗手段和药物，一般采用输血的办法来延长患者的生命。目前在临床上用于治疗白血病的化疗药物主要有强的松、长春新碱、6-巯嘌呤、环胞苷、柔红霉素、环磷酰胺、苯丁酸氮芥等，这些药物的主要副作用是抑制骨髓，疗效也不理想。骨髓移植疗法虽有较好的疗效，但价格昂贵，技术条件要求较高，且不易找到合适的供体，使得这种疗法难以得到推广使用。
本发明的目的在于克服上述药物在治疗白血病用途中的缺点，为用土贝母苷甲制备的药物提供一种新用途。
为达到上述目的，本发明采用的解决方案是有效成份用土贝母苷甲制备治疗白血病的药物用途。
土贝母苷甲是从中药土贝母中提取出来的一种有效成份，它的分子式为C63H98O29、分子量为1318，分子结构式见下页。
土贝母苷甲的提取工艺已在《中国药理学报》1994年15卷103～106页公开。
有效成份用土贝母苷甲制备治疗白血病的药物以常规药用制剂的形式来使用；所述的常规药用制剂含作为活性成分的土贝母苷甲，该活性成份在制剂中与药学上可接受的载体如适宜于胃肠内和胃肠外给药的有机或无机的固体或液体赋形剂混合。该药用制剂可以是固体形式如片剂、颗粒剂、粉剂、胶囊剂或液体形式如针剂、悬浮剂、糖浆剂、乳剂等。 (土贝母苷甲分子结构式)上述制剂中可含有辅助物质、稳定剂、润湿剂和其它常用的添加剂，如乳糖、柠檬酸、酒石酸、硬脂酸、硬脂酸镁、石膏粉、蔗糖、玉米淀粉、滑石粉、明胶、琼脂、果胶、花生油、橄榄油、可可脂、乙二醇、葡萄糖、盐酸普鲁卡因、盐酸利多卡因、抗坏血酸等。
上述制剂可按照各种制剂常规的制备工艺制成。
本发明所述有效成份土贝母苷甲作为治疗白血病药物的用途，所制成各种剂型的口服药物，成人口服，药物中土贝母苷甲的含量应为每天30～120mg，10～30天为一个疗程，用药3～5个疗程。所制成各种剂型的注射用药物，成人肌肉注射，药物中土贝母苷甲的含量为10～40mg，10～30天为一个疗程，用药3～5个疗程；静脉点滴，成人用量，药物中土贝母苷甲的含量为10～40mg，10～30天为一个疗程，用药3～5个疗程。儿童酌情减量。
本发明中的有效成份土贝苷甲经药效、毒理、作用机理和药代动力学试验，证明它具有杀伤白血病细胞和诱导白血病细胞分化作用，治疗量对动物骨髓无明显抑制作用，毒副作用很低。若用于临床试验，预期将会有较好的治疗效果。
例举下列实验内容及其试验结果，证明用土贝母苷甲制备的药物治疗白血病的有效性。
一、药效试验1.土贝母苷甲对人早幼粒白血病细胞(HL-60细胞)生长抑制试验试验药物土贝母苷甲。
试验方法将HL-60细胞接种于直径为35mm的塑料小碟内，用含10％胎牛血清的DMEM(Dulbeco′s Modified Eagle′s minimum es.sential medium)培养基，置于37℃、湿度饱和、95％空气、5％二氧化碳的孵箱中培养。用不同浓度的土贝母苷甲水溶液加入培养基内观察其对HL-60细胞生长的抑制效果，并用加入相同体积无菌蒸馏水的培养物作对照试验。加入土贝母苷甲后1～3天内，每天用台盼兰排斥法计活细胞数。
试验结果如
图1所示，土贝母苷甲对HL-60细胞有明显的抑制效果。
2.土贝母苷甲对HL-60细胞的诱导分化作用试验试验药物土贝母苷甲。
试验方法在HL-60细胞中加入2.4μmol/L的土贝母苷甲，按1所述的条件培养5天，观察其形态变化，并对HL-60细胞进行氮蓝四唑(NBT)还原试验、酵母多糖吞噬试验、以及非特异性酯酶染色试验。对照组分为阴性对照和阳性对照。在HL-60细胞中加入1mmol/L维甲酸按实验组的方法进行试验，即为阳性对照。
试验结果与土贝母苷甲共同培养5天的HL-60细胞中有62％的细胞被诱导分化，分化后的细胞形态类似于正常晚幼粒细胞，NBT阳性率为57％，酵母多糖的吞噬率为44％，非特异性酯酶染色阴性，而阴性对照组被诱导分化的细胞不超过6％。试验结果见表1。
二、毒理试验1.急性毒性试验选用ICR小鼠用肌肉注射和灌胃给药法进行试验。
试验结果肌肉注射的LD50为40.28mg/kg，灌胃给药的LD50为315.gmg/kg。
2.亚急性毒性试验选取12只健康狗，分为对照和土贝母苷甲不同剂量实验组，即剂量分别为1.6mg/kg、0.8mg/kg、0.4mg/kg的三组狗。
实验组每周给药5次，共用药20次，对照组同时注射同体积的生理盐水。
给药前、给药结束时和停药一个月后称狗的体重，每周测定血清蛋白、血象、红细胞脆性、肝肾功能。末次给药后24小时各组分别处死1只狗进行大体解剖，并取各种组织进行病理组织学检查。其余狗停药后继续观察，每月做一次上述化验检查，为期二个月。最后处死所有的狗进行病理组织学检查，即检查其心、肝、脾、胃、胰腺、甲状腺、胸腺、肾上腺、淋巴结、睾丸(卵巢)、前列腺、膀胱、肾、脑和骨髓等。
试验结果剂量为0.4mg/kg和0.8mg/kg的两组狗，在整个试验过程中，未出现不良反应。剂量为1.6mg/kg的一组狗，在用药期间出现流涎、食量减少、体重明显减轻，停药后体重逐渐恢复并有所增加。剂量为0.8mg/kg和1.6mg/kg的两组狗，用药后谷丙转氨酶有所上升，但上升的幅度不大，停药后逐渐恢复，对肝肾功能无明显影响。
3.致畸试验试验分剂量为0.15mg/kg、1.25mg/kg、2.5mg/kg、的土贝母苷甲实验组和对照组。每组选用30只受精雌性ICR小鼠，在器官形成期，即受孕后6～15天给药，每天肌肉注射土贝母苷甲一次，对照组注射相同体积的生理盐水，孕后18天，每组各解剖10只孕鼠，其余孕鼠任其自然产仔(第一代)。为了观察土贝母苷甲对小鼠第二代胎鼠生长发育的影响，将对照组和土贝母苷甲2.5mg/kg组在出生后8周龄第一代鼠进行同组内不同窝间的交配，将各组查到的受精阳性的雌鼠分笼饲养，每组10只孕鼠。土贝母苷甲组在孕后6～15天每天肌肉注射一次土贝母苷甲(2.5mg/kg)，对照组注射同体积的生理盐水，孕后第18天解剖孕鼠。
试验结果剂量为0.5mg/kg和1.25mg/kg的两组小鼠，其活胚胎的数量、体重、身长、发育与对照组比较未发现差异。当剂量为2.5mg/kg时，其活胚胎的体重、身长及出生后25天仔鼠的体重有一定的影响，但统计学上无显著差异。
4.土贝母苷甲对正常培养细胞的毒性作用采用比色法测试了土贝母苷甲对培养的T-淋巴母细胞样细胞株(MT-2细胞)的毒性作用，试验情况如下表
结果表明，土贝母苷甲的浓度低于40μg/ml时，其细胞毒性很低。
5.防癌试验采用经典的诱发小鼠二阶段皮肤乳头状瘤的实验模型，用二甲基苯并蒽激癌、12-0-十四酰佛波-13-乙酸酯(以下简称TPA)促癌。实验组每鼠每次用1mg的土贝母苷甲水溶液涂抹背部皮肤，并将含0.2mg/ml土贝母苷甲的饮水供小鼠自由饮用，对照组用二甲基苯并蒽激癌、TPA促癌，进行18周试验。
试验结果背部皮肤涂抹土贝母苷甲可完全抑制实验组小鼠皮肤上出现肿瘤，而对照组的带瘤率为80％，平均肿瘤数1033(见图2)。饮水中加入土贝母苷甲可减少皮肤肿瘤的发生(见图3)。此外，土贝母苷甲的应用并不妨碍小鼠体重增加。
上述各项毒性试验表明，土贝母苷甲的毒副作用低。
三、土贝母苷甲治疗白血病的作用机理试验1.土贝母苷甲对肿瘤细胞脱氧核糖核酸(DNA)合成的影响用3H-胸苷法测定土贝母苷甲对人胰癌和胃癌细胞DNA合成的影响。将胰癌或胃癌细胞培养24小时，加入土贝母苷甲或其溶媒作对照试验。胰癌或胃癌细胞继续培养24、48或72小时，然后以3H-胸苷标记1小时，并测定其掺入酸不溶性物质的放射活性。试验结果表明土贝母苷甲抑制3H-胸苷掺入DNA组分(参见表2)。提示，这些肿瘤细胞DNA的正常合成和成熟受到了抑制。试验结果还表明，在不同细胞DNA合成的抑制发生在不同时相。
2.3H掺入培养细胞C3H10T 1/2克隆8磷脂试验将C3H10T 1/2克隆8磷脂细胞置于含10％胎牛血清的Eagle′sminimum essential medium、37℃、湿度饱和、95％空气、5％二氧化碳的孵箱中单层培养。细胞经胰酶处理剥离后转移到35mm直径的Petri塑料盘内，使其密度为2×105细胞/ml。培养48小时后，土贝母苷甲以二甲基亚砜溶液的形式加入，使其在培养基中的终浓度分别为5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml。对照组加入同量的二甲亚砜在相同条件下培养。细胞经1小时培养后，试验组和对照组同时加入TPA(5×10-8mol/L)和3H-胆硷(4μCi/碟)，继续培养4小时。
与3H-胆硷一起培养过的细胞经胰酶处理后收集，并以磷酸盐缓冲液涮洗后悬浮在150μl的磷酸盐缓冲液中，细胞中的脂质以改进的Bligh和Dyer法提取。即将细胞冻融1次后，加入300μl的氯仿/甲醇(1/2、V/V)，其中甲醇中含2％乙酸。细胞悬液用冰浴型超声波发生器处理，再加入100μl氯仿，并振荡混匀，混合液经离心机离心后分为氯仿相和液相，用液体闪烁仪测定氯仿相的放射性，蛋白质含量用改进的Lowry氏法测定。
试验结果如图4所示，土贝母苷甲具有抑制TPA增强3H掺入细胞磷脂的作用。当土贝母苷甲的浓度低于5μg/ml时仍可测出这一效果，而且表现出明显的量效依赖关系。
3.土贝母苷甲与TPA竞争HL-60细胞内的受体试验HL-60细胞用含有10％胎牛血清的1640培养基培养。
试验方法取1ml细胞悬液(1×105细胞/ml)接种到直径为35mm的塑料培养皿中，离心收集细胞，再用含有137mM NaCl、2.7mM KCl、8.1mM Na2HPO4和1.3mM KH2PO4的磷酸盐缓冲液洗涤。被悬浮在含50mM Tris-HCl缓冲液中的细胞(1×107细胞/ml)用匀浆器处理，收集上清液，得细胞提取物，低温贮存备用。在细胞提取物解冻后加入Tris-HCl缓冲液调整蛋白浓度至200μg蛋白/ml，再加入不同浓度的土贝母苷甲、3H标记的TPA，放入孵箱，39℃孵育20分钟，抽滤器迅速过滤后，用丙酮冲洗滤膜，滤膜放入闪烁瓶，加入液体闪烁液，液体闪烁计数仪测定放射性。
试验结果如图5所示，土贝母苷甲能竞争性抑制3H-TPA与HL-60细胞提取物的结合。
4.细胞毒作用(1)参见图1，土贝母苷甲对白血病细胞有直接杀伤作用。
(2)细胞凋谢性死亡形态学试验电镜观察经土贝母苷甲处理过的肿瘤细胞产生细胞萎缩，染色质凝聚成块、边移甚至裂解为凋零体。
DNA的有控降解电泳图谱表明，经土贝母苷甲处理的肿瘤细胞DNA出现典型凋零梯型图谱。
四、土贝母苷甲的药代动力学试验1.土贝母苷甲的吸收试验取小鼠14只，每鼠以土贝母苷甲100mg/kg灌胃给药，给药后不同时间各处死2只小鼠，取出全部胃肠道及内容物，制成匀浆。用同法作空白对照，给药后即处死小鼠，测定残存于消化道及内容物中的药物含量。
试验结果即药后即刻处死者胃肠中土贝母苷甲的回收率为100％，给药后0.5、1、2、4、8、12小时的回收率分别为91.8％、82.0％、60.7％、41.0％、18.0％和0。
2.组织分布试验取20只小鼠和4只大鼠，每鼠肌肉注射土贝母苷甲60mg/kg，1小时后处死，取心、肝、脾、肺、肾和脑组织1g，加生理盐水3ml研成匀浆，按实验者建立的甲醇提取—薄层分离—比色测定法测定在各组织内土贝母苷甲的含量。
试验结果土贝母苷甲在肝和脾内含量最高，在血、肺和心内含量次之，在肾和脑内含量最低。
3.土贝母苷甲与血浆蛋白与组织蛋白的结合试验采用平衡透析法测定土贝母苷甲与血浆、肝、肾组织蛋白的结合率。
试验结果土贝母苷甲与血浆、肝、肾组织蛋白的结合率分别为17％、28％、20％。
4.排泄试验取10只小鼠，每鼠肌肉注射60mg/kg土贝母苷甲，收集24小时尿液，取胆汁，测定在排泄物中土贝母苷甲的含量。
试验结果在胆汁和尿液中无土贝母苷甲，推测土贝母苷甲可能以代谢产物的形式从尿液或胆汁排出。
图1是土贝母苷甲对HL-60细胞生长的抑制作用图。图中横坐标为培养天数，纵坐标为活细胞数，单位为活细胞数/碟○-○为对照培养，●--●为土贝母苷甲用量1.9μmol/L，×-×为土贝母苷甲用量3.8μmol/L，△-△为土贝母苷甲用量7.6μmol/L，■-■为土贝母苷甲用量15.2μmol/L。
图2是局部应用土贝母苷甲对小鼠皮肤促癌过程的抑制作用图。图中横坐标为促癌周数，纵坐标A为带瘤鼠数(％)，纵坐标B为肿瘤个数/鼠。●-●为对照组，○-○为实验组。
图3是小鼠口服土贝母苷甲对皮肤促癌的抑制作用图。图中横坐标为促癌周数，纵坐标A为带瘤鼠数(％)，纵坐标B为肿瘤个数/鼠。●-●为对照组，○-○为实验组。
图4是土贝母苷甲对TPA增强3H掺入培养细胞磷脂的抑制效应图。图中横坐标为土贝母苷甲的浓度(μg/ml)，纵坐标为抑制率(％)。
图5是土贝母苷甲与TPA竞争HL-60细胞内受体图。图中横坐标为土贝母苷甲的浓度(μM)，纵坐标为3H-TPA特异性结合(dpm)，图中左边一条曲线为未标记的TPA对3H-TPA结合的抑制作用曲线，右边一条曲线为土贝母苷甲对3H-TPA结合的抑制作用曲线。
发明人给出了用土贝母苷甲制备治疗白血病药物的药用制剂的实施例。
实施例1药用制剂制备成片剂，以生产10000片土贝母苷甲片为例所用的原料和辅料的配比为土贝母苷甲100g乳糖 400g玉米淀粉 500g实施例2药用制剂制备成注射液，以生产1000ml土贝苷甲注射液为例所用的原料和辅料的配比为土贝母苷甲 5g葡萄糖 40g盐酸利多卡因 3g注射用水 加至1000ml
表1土贝母苷甲对HL-60细胞的诱导分化作用a培养 晚幼粒细胞或中性氮蓝四唑 酵母多糖天数 粒细胞(％)b还原(％)b吞噬(％)b对照3 4.25±0.405.25±0.602.50±0.285 4.50±0.385.50±0.503.25±0.30维甲酸 3 67.23±8.91 64.88±6.60 62.46±6.34(1mmol/L) 5 64.26±5.68 51.26±4.68 60.54±5.68土贝母苷甲3 31.50±3.34c25.12±2.48c30.50土4.09c(2.4μmol/L) 5 62.34土5.87c56.78±7.23c43.64±3.98ca.三份平行试验的平均结果。
b.均值±标准误。
c.P＜0.01(与相应的对照组比较)。
表2土贝母苷甲对人胰癌和胃癌细胞DNA合成的影响*细胞条件DNA合成3H-胸苷掺入培养期(日)12 3胰癌对照3.56±0.273.63±0.33 5.88±0.85(100) (100) (100)土贝母苷甲 3.44±0.523.56±0.33 3.45±0.34(3μg/ml) (96.7) (98.0) (58.7，P＜0.0002)胃癌对照8.78±0.5510.05±0.65 7.50±0.21(100)(100) (100)土贝母苷甲6.12±0.56 6.40±0.85 5.47±0.85(10μg/ml) (69.7，P＜0.0001) (63.7，P＜0.0002)(72.9，P＜0.0018)*表中给出的值代表三份平行试验的平均值。括弧中的值是以对照作为100％的百分率。
权利要求
有效成份用土贝母苷甲制备治疗白血病的药物用途。
全文摘要
有效成分用土贝母苷甲制备治疗白血病的药物用途，土贝母苷甲是从中药土贝母中提取出来的一种有效成分，该有效成分与有机或无机的固体或液体赋形剂混合，制备成固体形式如片剂、颗粒剂、粉剂、胶囊剂或液体形式如针剂、悬浮剂、糖浆剂、乳剂等，土贝母苷甲经药效、毒理、药理、药代动力学试验，证明它具有杀伤白血病细胞和诱导白血病细胞分化作用，对动物骨髓无明显抑制作用，毒副作用低等优点，可用于动物和临床试验。
文档编号A61K31/70GK1146895SQ9511375
公开日1997年4月9日 申请日期1995年9月29日 优先权日1995年9月29日
发明者马润娣, 于立坚 申请人:陕西省中医药研究院