抑制5α－还原酶活性和抗痤疮丙酸杆菌作用的组合物的制作方法

专利名称：：抑制5α－还原酶活性和抗痤疮丙酸杆菌作用的组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及含有苦参(sophoraflavescens)提取物的组合物，该组合物可有效地抑制5α-还原酶(5α-reductase)的活性的同时，又可对于造成酒刺恶化的原菌-痤疮丙酸杆菌(propionibacteriumacnes)具有优良抗菌作用。男性型脱毛、酒刺、漏脂性皮炎等是男性激素依赖性疾病(androgen-dependentdisorders)、慢性皮肤疾病(VanLuu-The等5人characterization、Expression、andImmunohistochemicalLocalizationof5α-ReductaseinHumanSkin.JInvest.Dermatol，102，221-226，1994)。其中，对于中年男性给予深刻精神伤害的男性型脱发是与男性的激素量有直接的关系。最近，关于通过抑制男性激素活性来预防及治疗脱发的很多研究业已报导。此外，在慢性皮肤疾病中，酒刺和漏脂性皮炎是与皮脂相关连的疾病(Sebum-relateddisorders)，是由于男性激素而生成的过剩皮脂而引起的疾病，为了从根本上的治疗，必须通过抑制男性激素活性，来抑制皮脂的过剩生成。以下通过皮脂生成的机理简要地说明男性激素的作用。男性激素中之一的睾酮(testosterone)通过5α-还原酶被转化成活性男性激素的二氢睾酮(dihydrotestosterone)，此激素的非正常过剩时，则作为引起男性型脱发物质而发挥作用，同时成为从皮脂细胞(sebocyte)过剩生成皮脂(sebum)的因素。由于上述的机理，皮脂非正常的过剩生成或分泌出时，则会引起与皮脂相关的疾病(酒刺、漏脂性皮炎)。其结果男性型脱发、酒刺及漏脂性皮炎等是由于5α-还原酶的作用而过剩生成的二氢睾酮而产生的，所以若能抑制5α-还原酶的活性，就可以根本的、有效的预防及治疗上述的疾病。上述疾病中，产生酒刺时，除了过剩生成皮脂以外，还有其中的一个重要因素对疾病起着恶化作用，具体的如以下的说明。由于上述的机理而生成的皮脂，由于毛孔的过角质化不能排出到毛孔外时，则会生成一次性的微细粉刺(micro-comedones)。存在于毛孔皮脂内的厌氧性皮肤常驻菌-痤疮丙酸杆菌(以下称为丙痤疮菌的作用发展成慢性炎症性疾病的丘疹(papule)、脓疮(pustule)、囊胞(cyst)、结节(module)，严重时会生成疤痕。所以酒刺的情况时，说明了是由于皮脂的过剩生成、毛孔的过角质化以及丙痤疮菌的作用的各种复合因素而引起的发病疾患。为了预防或治疗酒刺、男性型脱发及漏脂性皮炎等的与男性激素有关的疾病，直到目前有很多关于抑制5α-还原酶活性的研究报告(YasuroSugimoto等3人；CationsInhibitSpecificallyTypeI5α-ReductaseFoundinHumanSkinJ.Invest.Dermatol，104，775-778，1995)，虽然发现了一些物质，但其效果和实用性差，使用它们还需要相当的注意。进而，对于酒刺，作为抗丙痤疮菌的抗菌物质而使用四环素等抗生物质时，往往会引起出现抗药菌或光过敏作用等的付作用。本发明人考虑了上述的问题，为了抑制酒刺、男性型脱毛及漏脂性皮炎等与男性激素有关的疾病的男性激素生成，对于与生成有直接关系的酶-5α-还原酶的活性可有效地抑制的同时，对于使酒刺恶化主原菌的丙痤疮菌也有优良的抗菌作用，为了开发即使长时间使用且安全性高的各种天然物质为对象进行系统研究，结果发现了在洗面剂、肥皂及软膏组合物中若含有苦参提取物时，在低浓度下就可以有效地抑制5α-还原酶的活性，同时对丙痤疮菌也有有效的抗菌效果。本发明涉及具有5α-还原酶的活性抑制作用和对痤疮丙酸杆菌具有抗菌作用的组合物。以下详细说明本发明。本发明中所使用的苦参的一般性状、应用及鉴定试验法如下。学名是槐属黄(sophoraflavescens)或者槐属窄叶(Sophoraangustifolia)，生药名是槐属根(sophoraeradix)，其根作为生药使用。苦参的形状是圆周形或圆锥形的根，长度5～20cm、直径2～3cm，外表是暗褐色至黄褐色，竖向有明显的皱纹，剥去主皮时露出黄白色的纤维。另外，具有特殊的呕吐性气味、有苦味、有残留性。作为其最有代表性的主成分生物碱(alkaloids)有苦参碱(matrine)、氧苦参碱(oxymatrine)、槐醇(sophoranol)等，另外，作为黄酮类化合物类(flavonoids)有库拉里啶(kuraridin)、异脱氢淫羊藿亭(isoanhydroicaritin)等。此外，叶中含有藤黄菌素-7-葡萄糖，种子含有金雀花碱(Cytisine)等。苦参的用途是可用于苦味健胃剂、末稍血管收缩剂、解热镇痛剂、皮肤寄生虫治疗剂等，其毒性是0.4g/kg，所以要避免大量服用(参照ハンデスオケ外；生药学，ドンミョング社，194-196，1994)。作为鉴定试验法是将10ml水放到苦参提取物0.5g中后，煮沸，过滤后向滤液2ml中滴入2～3滴的迈尔试剂时，则会生成黄色沉淀(参照苦参碱等的生物碱类的鉴定试验，大韩药典VI)。以下说明用于本发明的苦参的提取方法。首先将苦参的根洗净、粉末化后，在约10倍量的萃取溶剂中进行5天的冷浸后，过滤萃取原液，通过浓缩及冷冻干燥等方法得到苦参提取物的干燥粉末。此时，所使用的萃取溶剂有蒸馏水、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、丙三醇、丙二醇、1，3-丁二醇、乙酸甲酯、乙酸乙酯、苯、己烷、乙醚、二氯甲烷等中选出的1种或者混合2种以上的溶剂用于萃取。苦参提取物对5α-还原酶活性抑制力的评价试验用于5α-还原酶活性抑制实验的5α-还原酶是从白鼠的肝脏中得到的(Sprague-Dawley成年雄性鼠(8-10周令)，通过蛋白质定量后，准备一定量的蛋白质悬浮液。另外，用一般的方法准备酶反应溶液。作为5α-还原酶的反应基质使用放射线标记的睾酮(3Htestosterone)，酶反应溶液∶蛋白质悬浮液∶苦参提取物＝20∶20∶10的比例在恒温槽中反应2分钟后，蒸发反应溶剂，将残留物溶解在展开溶剂中，展开在薄层色谱(TLC)上，用光密度计定量分析展开的睾酮量和二氢睾酮量，测定由于α-还原酶，从睾酮向二氢睾酮的转化率，其结果与对照组(未添加苦参提取物时的转化率)比较，评价5α-还原酶的抑制率。抑制率的评价方法如下。抑制率(％)＝[(A-B)/A]×100A＝从睾酮向二氢睾酮的转化率(未添加提取物时)B＝从睾酮向二氢睾酮的转化率(添加提取物时)用上述的抑制率计算方法得到的实验结果如下<p>苦参提取物对丙痤疮菌的抗菌力评价试验用上述方法得到的苦参提取物的抗菌力实验，是通过用液体培养基中培养的丙痤疮菌中加入一定浓度的苦参提取物后，在厌氧性培养槽中培养后，求出抑制丙痤疮菌生长的最小抑制浓度(MIC)，其结果，用各萃取溶剂得到的苦参提取物对丙痤疮菌的最小抑制浓度(MIC)范围是10～100ppm。有效成分的分离及鉴定为了研究苦参提取物中的对5α-还原酶的抑制的有效成分及显示优良抗菌性有效成分，将用上述方法得到的一次溶剂萃取物分级到极性的水层和比水大的非极性的溶剂层(例如乙醚、二氯甲烷及己烷等)中，分别评价移到溶剂层的有效成分对5α-还原酶的抑制力，其结果，确认了在非极性溶剂层中具有显示优良抑制力(0.001％～100％的抑制率)的有效成分。评价对丙痤疮菌的最小抑制浓度的结果，确认了非极性溶剂层(MIC1～10ppm)比水层(MIC约200ppm)具有有效抗菌作用，在两实验的全部中，可以看出有效成分都移动到非极性溶剂层中。为进一步研究，为对5α-还原酶有效抑制及显示抗菌性有效成分的分离及鉴定，将用上述方法转移到非极性溶剂层中的提取物用二相溶剂系展开，根据各个的极性度，使用柱色谱分离及分取有效成分，不同时间洗脱出来的各个有效成分，利用薄层色谱(TLC)，合并包含同样成分的分取溶液，进行5α-还原酶抑制实验及抗菌性实验后，鉴定显示优良抑制性及抗菌性的有效成分，作为其方法，是通过标准品的确认及利用各种分析装备进行鉴定，最终确认有效成分。用上述方法，对有效成分进行鉴定的结果，有效抑制5α-还原酶的有效成分组是苦参碱等的生物碱类(1×10-5％～100％抑制)。进而，对于丙痤疮菌显示抗菌作用的分离成二种类成分组，一种是苦参碱、异苦参碱、氧苦参碱、槐醇等的生物碱类，另一种是异脱氢淫羊藿亭、库拉里酮、库拉里啶及槐属黄烷酮G(sophraflavanoneG)等的黄酮类化合物。本发明的组合物的干粉末中最好含有生物碱类0.05至12.9重量％，黄酮类化合物为0.005至11.3重量％。此时，可以确认黄酮类(MIC0.1～1ppm)比生物碱类(MIC约1ppm)更具有优良的抗菌力。将用于5α-还原酶抑制实验及对丙痤疮菌抗菌力的评价实验的各种萃取溶剂而萃取出的苦参提取物加在高速液相色谱(HPLC)上，评价提取物中的苦参碱、异苦参碱、氧苦参碱、槐醇等的生物碱类的含量，其结果，根据萃取溶剂的种类多少有差异，但可以确认溶剂萃取物的干粉末中的生物碱类的含量是在0.05～12.9重量％范围内，黄酮类的含量在0.005～11.3重量％的范围内。用上述方法确认了有效成分的本发明者，制造出含有苦参提取物的洗面剂、肥皂、软膏等组合物，评价5α-还原酶的活性抑制力和对丙痤疮菌的杀菌力(洗面剂、肥皂、软膏)，在临床上确认苦参对皮脂生成的抑制作用及对丙痤疮菌的杀菌效果时，为对皮脂过剩分泌要因及丙痤疮菌要因复合关连疾病的酒刺的治疗效果进行评价，以洗面剂临床实验的结果，发现含有苦参提取物的组合物对皮肤不显示发红的付作用，对酒刺有优良的治疗效果。本发明涉及的组合物含有上述方法得到苦参提取物，具有有效的抑制5α-还原酶活性和对丙痤疮菌有优良抗菌作用，它包括了洗面剂、肥皂及软膏。本发明的各种组合物是以不含过脂肪的一般的各种产品基质作为基料，相对于各种组合物总量，苦参提取物的干燥粉末的含量最好是0.005～10重量％。本发明中，洗面剂及肥皂是在洗面剂及肥皂基质中含有苦参提取物，为了进一步提高对酒刺、男性型脱发及漏脂性皮炎等的皮肤疾病的临床效果，也可在其中添加α-羟基酸、β-羟基酸或皮肤角质去除剂等。进而可以使用香料、色素、杀菌剂、抗氧剂、防腐剂、保湿剂等，为了改善物性可以使用增粘剂、无机盐类、合成高分子物质等。此外，本发明中的软膏是在一般的水包油型(O/W)的基质中含有苦参提取物，可以使用香料、色素、抗氧剂、防腐剂等，为了改善物性可以使用合成或天然的材料。本发明的洗面剂、肥皂及软膏用通常方法很容易地制造。本发明的5α-还原酶的活性抑制作用和对丙痤疮菌的抗菌作用的组合物的性状可适于作成各种不同的剂型即液状、软膏状、糊状或固体状等任何一种形状。以下，通过实施例及比较例说明本发明，但是本发明的技术范围不受这些实施例的限制。实施例1含有苦参提取物洗面剂组合物的制造及效能实验将洗面剂基质和苦参提取物的混合物在均匀混合机中经过搅拌、加热、脱气、冷却的过程后，制造出组成物质均匀混合的洗面剂组合物。(单位重量％)</tables>5α-还原酶活性抑制力评价实验为了评价上述实施例及比较例制造出的洗面剂组合物对于5α-还原酶的活性抑制力，制造出5％的实施例及比较例洗面剂水溶液作为实验液，用上述说明的方法评价5α-还原酶活性抑制力。抑制率评价方法如下。抑制率(％)＝[(A-B)/A]×100A＝从睾酮转化二氢睾酮的转化率(未添加提取物时)B＝从睾酮转化二氢睾酮的转化率(添加提取物时)对5α-还原酶活性抑制力，若在80％以上时则判断为有效果。上述对5α-还原酶活性抑制力实验结果如下述表1-1。表1-1(洗面剂)实施例1-11-21-31-41-51-6比较例1-11-21-3活性抑制率(％)80.192.193.295.697.898.965.935.6100操作性良好良好良好良好良好良好良好良好不良</table>对丙痤疮菌的杀菌力实验为了评价上述实施例及比较例制造出的洗面剂组合物对丙痤疮菌的抗菌力，在陪替氏培养皿(培养细菌用皿)中接种后，在厌氧性培养槽中培养三天，测定丙痤疮菌的菌落数(N1)，将5％的实施例及比较例洗面剂水溶液滴落在陪替氏培养皿上，在厌氧性培养槽中培养三天后，测定菌落数(N2)。将用上述方法求出的菌落数，用以下的方法评价对丙痤疮菌的杀菌率。丙痤疮菌的杀菌率在90％以上时，则判断为有杀菌效果。对于上述的丙痤疮菌的杀菌力实验结果如下述表1-2所示。表1-2(洗面剂实施例1-11-21-31-41-51-6比较例1-11-21-3最初培养的丙痤疮菌数750568568856510874512754658加入洗面液三日后的丙痤疮菌数(N2)753530411051512970丙痤疮菌的杀菌率(％)90.093.894.795.298.099.470.560.6100操作性良好良好良好良好良好良好良好良好不良</table>>苦参的临床效果评价实验为了在临床上确认上述实验确认的苦参对于5α-还原酶的优良活性抑制效果和对于丙痤疮菌的有效杀菌作用，选用由二者复合作用而产生的代表性疾病酒刺来实验临床效果。使用含有苦参提取物的洗面剂(实施例1-3)和不含苦参提取物的洗面剂(比较例1-2)，测定对酒刺的预防及治疗的临床效果，选定10岁多～20多岁的男性(实验组10名、对照组10名)作为被试验者，一日三次，使用一个月后评价对酒刺的预防及治疗效果。判定的方法是，在实验开始前，根据酒刺的状态设定成一定的等级后，用目视观察确认面疱减少，判定的标准如下。</tables>对于临床实验对象者的酒刺若减少3个等级以上则认为效果优良、减少1～2个等级则认为效果中间，不显示减少的认为无效果。若实验后的等级比实验前的等级高则判定为恶化。对于上述酒刺的预防及治疗效果的实验结果如以下的表1-3表1-3(洗面剂)</tables>综合观察上述洗面剂的实验结果，可以看出含有苦参提取物的洗面剂比不含有这些的洗面剂显示了对5α-还原酶活性的有效抑制作用。对丙痤疮菌的杀菌力也很优良，在临床实验结果上，对于酒刺也有非常优良的治疗效果。进而，如上述结果所示，添加的苦参提取物不足0.005重量％时，对于5α-还原酶活性抑制力及对丙痤疮菌的杀菌力多少有些降低，若超过10重量％时，杀菌力虽然优良但制造上很困难。因此，本发明所使用的洗面剂内的苦参提取物的含量是在0.005～10重量％范围。在此范围内对于5α-还原酶的活性抑制力、对丙痤疮菌的杀菌力以及操作性都显示了优良的效果。实施例2含有苦参提取物的肥皂组合物的制造及效能实验肥皂基质和苦参提取物在混合器中充分混合后，用肥皂制造机械压出、切断、模压后，制造出固形肥皂形态的肥皂组合物，上述的苦参提取物不仅用于一般的肥皂，也包括了用通常的肥皂制造方法制造出的合成肥皂和复合肥皂。(单位重量％)</tables>5α-还原酶活性抑制力评价实验为了评价用上述实施例制造出的肥皂组合物对5α-还原酶的性抑制力，制造出5％的实施例及比较例肥皂水溶液作为实验液，用上述说明的方法评价5α-还原酶的活性抑制力。抑制率评价的计算方法如下。抑制率(％)＝[(A-B)/A]×100A＝从睾酮转化二氢睾酮的转化率(未添加提取物时)B＝从睾酮转化二氢睾酮的转化率(添加提取物时)上述5α-还原酶的活性抑制力实验结果如以下表2-1所示表2-1(洗面剂)</tables>对丙痤疮的杀菌力实验为了评价上述实施例及比较例制造的肥皂组合物对丙。痤疮的杀菌力，在陪替氏培养皿(培养细菌用皿)中接种丙痤疮菌后，在厌氧性培养槽中培养三天，测定丙痤疮菌的菌落数(N1)，将5％的实施例及比较例肥皂水溶液滴落在陪替氏培养皿上，在厌氧性培养糟中培养三天以上，测定菌落数(N2)。利用以下的方法评价用上述求出的菌落数对丙痤疮菌的杀菌率。对丙痤疮菌的杀菌率在90％以上时，则判断为有杀菌效果。对于上述的对丙痤疮菌的杀菌力实验结果如下述表2-2所示。表2-2(肥皂)</tables>如上表所述的结果，含有苦参提取物的肥皂比不含有的肥皂显示了对5α-还原酶有效的抑制力，对于丙痤疮菌也显示了卓越的杀菌力。进而，苦参提取物的添加量低于0.005重量％时，对5α-还原酶活性的抑制力及对于丙痤疮菌的杀菌力多少有些降低，超过10重量％时，虽然杀菌力优良，但制造上有困难。因此，本发明中所使用的肥皂内的苦参提取物含量在0.005-10重量％的范围内显示了对5α-还原酶活性抑制力、对于丙痤疮菌的杀菌力以及操作性好的性能。实施例3含有苦参提取物膏组合物的制造及效能实验将作为膏基料的油性成分、水性成分、表面活性剂等的组合物和苦参提取物在混合器中混合，经过脱气、过滤、冷却后制造膏组合的，也可以添加以外的添加剂，如防腐剂、敖合剂、香料及色素等，制造出少量油性成分存在的水包油型(O/W)的软膏。将上述的苦参提取物可以方便地添加到泡沫洗涤剂、洗发剂、香精等的基础化妆品中，用于酒刺的预防和治疗。(单位重量％)<>5α-还原酶活性抑制力的评价实验为了评价上述实施例及比较例制造的软膏组合物对5α-还原酶活性的抑制力，制造5％的实施例及比较例软膏水溶液作为实验液，用上述的方法评价对5α-还原酶活性的抑制力。抑制力评价计算方法如下。抑制率(％)＝[(A-B)/A]×100A＝从睾酮转化成二氢睾酮的转化率(未添加提取物时)B＝从睾酮转化成二氢睾酮的转化率(添加提取物时)5α-还原酶活性抑制率在80％以上时，则判断有效果。上述5α-还原酶活性抑制力实验结果如以下的表3-1所示。表3-1(软膏)对丙痤疮的杀菌力实验为了评价上述实施例及比较例制造的软膏组合物对丙。痤疮的杀菌力，在陪替氏培养皿(培养细菌用皿)中接种丙痤疮菌后，在厌氧性培养糟中培养三天，测定丙痤疮菌的菌落数(N1)，将5％的实施例及比较例软膏水溶液滴落在陪替氏培养皿上，在厌氧性培养糟中培养三天以上，测定菌落数(N2)。利用以下的方法评价用上述求出的菌落数对丙痤疮菌的杀菌率。对丙痤疮菌的杀菌率在90％以上时，则判断为有杀菌效果。对于上述的对丙痤疮菌的杀菌力实验结果如下述表3-2所示。表3-2(软膏)如上述表的结果所示产，含有苦参提取物的软膏比不含有的软膏显示了有效的对5α-还原酶活性的抑制力，对于丙痤疮菌也显示了卓越的杀菌力。进而，苦参提取物的添加量低于0.005重量％时，对5α-还原酶活性的抑制力及对于丙痤疮菌的杀菌力多少有些降低，超过10重量％时，虽然杀菌力优良，但制造上有困难。因此，本发明中所使用的软膏内的苦参提取物含量在0.005-10重量％的范围内显示了对5α-还原酶活性的抑制力及对于丙痤疮菌的杀菌力以及操作性好的性能。因此，按照本发明，含有0.005-10重量％苦参提取物的洗面剂、肥皂及软膏显示了对5α-还原酶活性的有效抑制力，对于丙痤疮菌也显示了卓越的杀菌效果。特别是对于由5α-还原酶和丙痤疮菌二个因子引起的代表性疾病-酒刺的预防及治疗效果也非常好。权利要求1.一种具有可抑制5α-还原酶活性及对于痤疮丙酸杆菌有抗菌作用的组合物，其特征在于含有苦参提取物。2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于含有0.005-10重量％的苦参提取物的干粉末。3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于苦参提取物的干粉末中含有0.05-12.9重量％的可抑制5α-还原酶活性的有效成分和对痤疮丙酸杆菌的抗菌性有效成分的苦参碱、异苦参碱、氧苦参碱、槐醇等的生物碱类。4.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于苦参提取物的干粉末中含有0.005-11.3重量％的作为对痤疮丙酸杆菌的抗菌性有效成分的异脱氢淫羊藿亭、库拉里酮、库拉里啶等的黄酮类化合物。5.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于苦参提取物，作为萃取溶剂使用从蒸馏水、甲醇、丙醇、丁醇、丙三醇、丙二醇、1，3-丁二醇、乙酸甲酯、乙酸乙酯、苯、己烷、乙醚及二氯甲烷中选出的一种或二种以上的混合溶剂，将苦参的根在常温下冷浸后，蒸发出溶剂或者冷冻干燥后而得到提取物。6.权利要求1-5的任何一项所述的组合物，其特在于可用于酒刺的预防或治疗。7.权利要求1-5的任何一项所述的组合物，其特征在于可用于预防或治疗脱发或者漏脂性皮炎等由5α-还原酶引起的皮肤疾病。8.权利要求1-7的任何一项所述的组合物，其特征在于组合物的形状可以是液状、软膏状、糊状或者固体状。全文摘要本发明涉及一种具有可抑制5α－还原酶活性及对于痤疮丙酸杆菌有抗菌作用的组合物,其特征在于含有苦参提取物。文档编号A61K31/35GK1170606SQ9711222公开日1998年1月21日申请日期1997年7月11日优先权日1996年7月12日发明者崔升,崔永浩申请人:株式会社Lg化学