专利名称：具有抗病毒和杀精子活性的含有壬苯聚醇的脂囊泡的制作方法
技术领域：
本发明的背景本发明涉及构造含有表面活性剂的非-磷脂基脂质体(Novasome)的方法，所述表面活性剂为乳胶相容的并且在接触时可使有包膜病毒和精子灭活。也公开用于避孕套包衣或用于阴道插入的制剂。壬苯聚醇-9为用于此类制剂和方法的优选的表面活性剂。
致病性病毒侵入人类的主要入口为粘膜和呼吸道。任何传染的第一步是粘附或移生，接着是传染性病原体的侵入和播散。在移生位置灭活潜在的病原体可以预防许多传染病。本发明的目的是使接触时灭活精子和有包膜病毒。
尽管有一些用脂质体作释放系统传递各种物质的试验，但是无成功用脂质体或其它的脂囊泡(lipid vesicles)作接触抗病毒药物或接触杀精子剂(spermacide)的报道。主要的问题为相容性和稳定性问题，特别是由于所使用的环境常常是生长的细菌的完美的“实验室”，所述细菌可以粘附并降解所述制剂。所述制剂必须能够在广泛的生理pH范围和生理温度下发挥作用。pH和温度要求利用了许多磷脂制剂或常规的脂质体，但由于其稳定性问题都不适合。而且，用磷脂或非-磷脂的许多制剂是乳胶不相容的，这是如果将该制剂与避孕套一起使用时的一项要求，或者在释放位置对粘膜产生刺激。这两种性质，即乳胶相容性和无刺激性对于一成功产品而言是很重要的。
近几年，数家公司，主要有IGI,Inc.，通过其前身子公司MicroVesicular Systems,Inc.和Nova Vax,Inc.以及L’Oreal已开发并推广了非-磷脂脂囊泡及其应用。美国专利4911928、美国专利4895452、美国专利5260065和美国专利申请系列号08/482552(在此引入其公开的内容作参考)公开了各种制剂和制备脂囊泡的方法，所述脂囊泡可以利用多种非-磷脂物质。这些专利和该申请以及对所公开的方法和物质的改变已被用于开发从疫苗到皮肤护理品等各种产品。然而，到目前为止没有制备出成功满足乳胶相容且稳定的杀精子或抗病毒产品所需的所有要求的制剂。
因此，本发明的目的是提供接触灭活病毒的灭活病毒脂囊泡。
本发明的另一个目的是提供非刺激性的、稳定的制剂，该制剂可以灭活病毒，特别是皮肤或粘膜上的有包膜病毒。
本发明的另外一个目的是提供通过给予受治疗者灭活病毒的脂囊泡，在感染的受治疗者中预防病毒感染的方法。
本发明的再一个目的是通过使精子与杀精子脂囊泡接触灭活精子的方法。
本发明的这些目的及特征和其它目的及特征可以从优选的实施方案和权利要求书的描述中显而易见。
本发明的概述本发明的特征为接触灭活精于和有包膜病毒例如HIV的方法，以及具有这些性质的制剂。本发明基于(至少在部分上基于)这样一个发现，即可以制备具有足够部分的携带于脂质双层的抗病毒或杀精子表面活性剂的脂囊泡制剂，以使该制剂在囊泡不破裂的情况下具有活性。该制剂也比其它制剂刺激性小。
用于本发明的制剂含有由非离子两亲物、油、甾醇和具有抗有包膜病毒或杀精子活性的表面活性剂组成的脂囊泡。优选的表面活性剂为nonoxyphenol表面活性剂，最优选壬苯聚醇-9。选择所述非离子两亲物、油和表面活性剂，以使所述表面活性剂至少部分被携带于脂囊泡的外双层中。
优选的非离子两亲物选自脂肪醇的POE醚、脂肪酸的POE酯、甘油一和二月桂酸酯、甘油一和二硬脂酸酯和POE脱水山梨醇脂肪酸醚、最优选甘油一硬脂酸酯。所述油为所述表面活性剂在其中具有低溶解性的油，优选所述表面活性剂在其中不溶的油。如果用壬苯聚醇-9作表面活性剂，那么优选植物油例如大豆油，而不使用矿物油。理论上，如果所述表面活性剂溶于所述油中，那么它不能在脂质双层中，但是如果不溶的话，那么它必定被携带于所述双层表面。
尽管可以使用几乎任何甾醇，但是优选胆甾醇或植物甾醇，例如大豆甾醇。所述囊泡也可以含有电荷产生剂，优选负电荷产生剂，例如油酸。所述囊泡可以用药学上可接受的载体如盐水制备以供释放。所述囊泡可以制成乳油，例如适合阴道插入的乳油，或适合用于避孕套上或与避孕套一起使用的乳油。
本发明的方法使用具有抗有包膜病毒活性或杀精子活性的这类制剂。尽管部分本发明的制剂具有抗有包膜病毒和杀精子活性，如使用壬苯聚醇-9作为表面活性剂的制剂，但是也可能使用其它的仅具有其中一种性质的表面活性剂。可以使用的部分其它的表面活性剂包括Triton-X家族的表面活性剂，已经显示该家族具有部分杀精子性质，或用显示有部分抗病毒性质的十六烷基氯化吡啶鎓。简言之，本发明的方法使精子或有包膜病毒暴露于所述制剂，并使制剂作用于精子或病毒。由于本发明的制剂提供快速活性，因此暴露可以非常短暂，可能是数秒。对于性传播的病毒和精子而言，本发明的制剂可以制成阴道乳油或避孕套润滑剂。对于其它的病毒而言，可以使用其它的剂型，如鼻内喷雾剂。
下列描述和权利要求书将进一步明确本发明的范围。
优选实施方案的描述本发明提供灭活有包膜病毒和精子的方法以及这些方法中使用的制剂。本发明使用脂囊泡以提供快速活性而无需该囊泡破裂，该脂囊泡在其外双层包含杀精子或抗病毒表面活性剂。
本发明的基本囊泡是由非离子两亲物例如甘油一硬脂酸酯、甾醇例如大豆植物甾醇、显示抗病毒或杀精子(或两者兼有)活性的表面活性剂例如壬苯聚醇-9和油如大豆油形成的。选择所述油、非离子表面活性剂和表面活性剂，以使至少所述表面活性剂的一部分在所述囊泡的外双层中，由此它可以提供所需的活性而无需该囊泡破裂。这需要所述非离子两亲物和所述表面活性剂之间的相容性，并且它还需要所述表面活性剂不溶于所述油中。任何表面活性剂的选择需要该表面活性剂能够用于稳定的脂囊泡中，以及相容性试验，所有这些试验是本领域标准的。例如，如果所述制剂有待于与乳胶例如与乳胶避孕套一起使用，那么它们必须是乳胶相容的，此项可以用标准的乳胶相容性试验快速测定。选择物质的适当混合物的方法是利用杀精子活性的筛选测定法；所述脂囊泡必须在20秒之内灭活精子。如果所述表面活性剂都不在外双层中，那么快速杀精子活性不能随着脂囊泡的溶解立即发生。杀精子活性和抗病毒活性的试验在实施例中描述。
通过下列非限定性实施例可以更清楚地理解本发明。
实施例1-含有壬苯聚醇-9的GNP9SO Novasomes的制备表1含有用于生产GNP9SO Novasomes的物质，包括壬苯聚醇-9用作表面活性剂、甘油一硬脂酸酯用作两亲物、大豆油和油酸用作负电荷产生剂。
表1化学成分 重量甘油一硬脂酸酯13.7g大豆甾醇(或胆甾醇)3.8g壬苯聚醇-97.2g大豆油16g油酸 250μl使表1所示成分形成脂质-油相，将其于86℃加热1小时以获得均一性。将水加热至65℃。然后通过将该水注入脂质相产生GNP9SONovasomes，脂质油与水的体积比为13∶37。用往复注射器装置或连续流动装置也可以人工生产GNP9SO Novasomes。
实施例2-壬苯聚醇-9Novasome制剂的鉴定Novasomes产生后，对其进行鉴定研究。测试所有制剂的无菌性和pH。也在有循环水浴的Coulter LS230 Laser sizing装置上测定制剂的大小。表2说明所述囊泡的物理特征。表3和4显示用可使病毒繁殖的细胞系体外试验抗病毒活性，表5和6说明乳胶相容性，表7说明用Sander-Cramer测定法测定的抗杀精子活性，表8说明口服毒性数据。
表2 平均Coulter平均Coulter活性成分 电荷 pH 大小μm 范围μmGNP9SO Novasomes负 4.52 0.598 0.375-0.839实施例3-抗病毒测定A．HIV-1MN杀病毒测定测试实施例1的Novasomes制剂的抗HIV-1病毒的活性。将100μlHIV-1Mn 1000x沉积病毒Lot#50-013(TCID-50/ml=10-6)与100μl注射用水或100μl Novasome制剂混合30分钟。然后向每种制剂中加入1.8ml组织培养基。然后系列稀释10倍(从10-2至10-6)。然后将每一稀释液0.4ml置于含有C8166细胞(HTLV-1转化的T细胞系)的试管中。然后将这些合并的物质于37℃孵育2小时，用磷酸盐缓冲液洗涤三次，再悬浮于新鲜培养基中，将每种稀释液置于4个复制孔中。将细胞每周补料两次。于第7和14天观察细胞的致细胞病变效应，收集上清液进行p24测定证明病毒繁殖。根据p24测定结果进行TCID-50计算。
结果列于表3中。Novasome制剂明显具有抗-HIV活性。
表3测试物质TCID50,1周时 TCID50,2周时水10-4.7510-4.75GNP9SO Novasomes0 0B．杀牛痘WR病毒测定也测试实施例1 Novasome制剂的抗牛痘WR病毒的活性。将100μl牛痘WR1000x沉积病毒Lot#68-016(TCID-50/ml=10-9)与100μl注射用水或100μl Novasome制剂混合30分钟。然后向每种制剂中加入200μl组织培养基。然后系列稀释10倍所述病毒和无病毒对照(从10-1至10-6)。然后将每一稀释液40μl置于含有BSC-1细胞的96孔培养板中。每种稀释液复制5份，制备复份培养板。然后将这些合并的物质于37℃孵育2小时，用磷酸盐缓冲液洗涤1次，再悬浮于新鲜培养基中。于第3和7天观察细胞的致细胞病变效应。在3天时对第一块培养板进行MTS处理；每3天对第二块板补料，在7天对该板进行MTS处理。
表4说明牛痘WR测定结果。又一次确定Novasome制剂明显具有抗病毒活性。
表4测试物质TCID50,3天时TCID50,7天时水10-710-7GNP9SO Novasomes00实施例4-乳胶相容性测试也测试实施例1的Novasome制剂的乳胶相容性。在该测定中试验三种类型的避孕套，Trojan-Enz Non-Lubricated LO316RP、Lifestyles 0602258800和Aladan。用5秒钟，用柔软的毛刷将Novasome制剂涂于每个牌子的各13个避孕套上，置于干酪包布上。然后将避孕套于90％RH的潮湿室中、于38℃放置30分钟。然后洗涤、干燥并测试伸长度和拉伸强度。另外取每个牌子的13个避孕套如上测试，但是置于上述状态后直接固定于Airburst测试固定物上并进行测试。将每一牌子的80个避孕套不涂Novasome制剂测试这些性质作为对照。表5说明Novasome制剂的乳胶相容性试验的结果，而表6说明有Novasome制剂的试验结果。很明显Novasome制剂在短时间内的相容性测试中不影响乳胶避孕套性质。
表5避孕套牌子 Trojan Enz Non- Lifestyle AladanLubricated伸长度％ 783 827 802拉伸强度，MPa 25.9 29.829.0压力kPa2.3 1.3 2.2体积，升 39.4 40.736.5表6避孕套牌子Trojan Enz Non- LifestyleAladanLubricated伸长度％ 777 841 848拉伸强度，MPa 26.829.130.2压力kPa2.1 1.2 1.9体积，升 39.440.736.5实施例5-Sander-Cramer杀精子测定在该实施例中，用Sander-Cramer杀精子测定测试实施例1制剂的杀精子活性。用0.9％盐水制备受试化合物的系列稀释液。通过将所述混合物吸入移液管并压出该混合物，使1ml受试物质与0.2ml人精液在13×100mm试管中混合。将该步骤重复6次。制备一悬滴的该混合物，并在低倍下观察5个区域。从混合到显微镜观察的整个过程必须在20秒内完成。终点是在20秒内使精子固定的最高稀释度。
表7表明Sander-Cramer测定的结果。本发明的囊泡不仅使NP-9制剂比标准的DMSO制剂具有更高的浓度，而且它也可以在更高的稀释度时杀死精子，显示更高的活性。
表7受试物质最高杀精子的 浓度NP-9稀释度GNP9SO NovasomesTM52832.5mg/mlNP9对照 91 10mg/ml于DMSO中实施例6-大鼠口服毒性研究在该实施例中，测试实施例1制剂的口服毒性。将由5只雄性大鼠和5只雌性大鼠组成的一组Sprague-Dawley大鼠禁食过夜。第二天清晨称重后，通过管饲法给予每只大鼠3ml的GNP9SO Novasome制剂，为大鼠允许的最大口服剂量。每日观察动物的疾病和死亡率，在第7天和14天获得个体的体重。结果记录于表8。
表8大鼠平均获得的总重(第0-14天)雄性126.66g雌性24.13g根据在所述实施例中显示的研究结果，很明显本发明的制剂显示杀精子活性和抗病毒活性，而且是乳胶相容的和口服安全的。这些制剂具体可用于杀精子和杀病毒阴道乳油。
前述制剂和实施例仅仅是说明性的，本发明的范围由下列权利要求书所限定。
权利要求
1．灭活精子的方法，该方法包括将所述精子暴露于具有局部杀精子(spermacidal)活性的乳胶相容的脂囊泡(lipid vesicle)制剂中的步骤；所述脂囊泡制剂含有由非离子两亲物、油、甾醇和杀精子表面活性剂制备的脂囊泡；选择所述非离子两亲物、所述油和所述杀精子表面活性剂，以使所述杀精子表面活性剂不溶于所述油申，且至少部分所述杀精子表面活性剂在主要由所述非离子两亲物形成的脂囊泡的外双层中。
2．权利要求1的方法，其中所述杀精子表面活性剂包括nonoxyphenol表面活性剂。
3．权利要求2的方法，其中所述nonoxyphenol表面活性剂包括壬苯聚醇-9。
4．权利要求1的方法，其中所述非离子两亲物选自脂肪醇的POE醚、脂肪酸的POE酯、甘油一和二月桂酸酯、甘油一和二硬脂酸酯和POE脱水山梨醇脂肪酸醚。
5．权利要求5的方法，其中所述非离子两亲物包括甘油一硬脂酸酯。
6．权利要求1的方法，其中所述甾醇选自胆甾醇和植物甾醇。
7．权利要求6的方法，其中所述甾醇包括的大豆甾醇。
8．权利要求1的方法，其中所述油包括植物油。
9．权利要求8的方法，其中所述植物油包括大豆油。
10．权利要求1的方法，其中所述脂囊泡还包含电荷产生剂。
11．权利要求10的方法，其中所述电荷产生剂包括负电荷产生剂。
12．权利要求11的方法，其中所述负电荷产生剂包括油酸。
13．权利要求1的方法，其中所述制剂还包含药学上可接受的载体。
14．权利要求13的方法，其中所述制剂为乳油形式。
15．权利要求14的方法，其中所述制剂用于阴道插入。
16．权利要求1的方法，其中所述制剂涂于避孕套上。
17．灭活有包膜病毒的方法，该方法包括将所述有包膜病毒暴露于乳胶相容的脂囊泡制剂中的步骤，所述脂囊泡制剂含有由非离子两亲物、油、甾醇和nonoxyphenol表面活性剂制备的脂囊泡，选择所述非离子两亲物、所述油和所述nonoxyphenol表面活性剂，以使所述nonoxyphenol表面活性剂不溶于所述油中，且至少部分所述nonoxyphenol表面活性剂在主要由所述非离子两亲物形成的所述脂囊泡的外双层中。
18．权利要求17的方法，其中所述nonoxyphenol表面活性剂包括壬苯聚醇-9。
19．权利要求17的方法，其中所述非离子两亲物选自脂肪醇的POE醚、脂肪酸的POE酯、甘油一和二月桂酸酯、甘油一和二硬脂酸酯和POE脱水山梨醇脂肪酸醚。
20．权利要求19的方法，其中所述非离子两亲物包括甘油一硬脂酸酯。
21．权利要求17的方法，其中所述甾醇选自胆甾醇和植物甾醇。
22．权利要求21的方法，其中所述甾醇包括大豆甾醇。
23．权利要求17的方法，其中所述油包括植物油。
24．权利要求23的方法，其中所述植物油包括大豆油。
25．权利要求17的方法，其中所述脂囊泡还包含电荷产生剂。
26．权利要求25的方法，其中所述电荷产生剂包括负电荷产生剂。
27．权利要求26的方法，其中所述负电荷产生剂包括油酸。
28．权利要求17的方法，其中所述制剂还包含药学上可接受的载体。
29．权利要求28的方法，其中所述制剂为乳油形式。
30．权利要求29的方法，其中所述制剂用于阴道插入。
31．权利要求17的方法，其中所述制剂涂于避孕套上。
32．灭活精子和有包膜病毒的制剂，该制剂包含与乳胶相容的脂囊泡制剂，所述脂囊泡制剂含有由非离子两亲物、油、甾醇和nonoxyphenol表面活性剂制备的脂囊泡，选择所述非离子两亲物、所述油和所述nonoxyphenol表面活性剂，以使所述nonoxyphenol表面活性剂不溶于所述油中，且至少部分所述nonoxyphenol表面活性剂在主要由所述非离子两亲物形成的所述脂囊泡的外双层中。
33．权利要求32的制剂，其中所述nonoxyphenol表面活性剂包括壬苯聚醇-9。
34．权利要求32的制剂，其中所述非离子两亲物选自脂肪醇的POE醚、脂肪酸的POE酯、甘油一和二月桂酸酯、甘油一和二硬脂酸酯和POE脱水山梨醇脂肪酸醚。
35．权利要求34的制剂，其中所述非离子两亲物包括甘油一硬脂酸酯。
36．权利要求32的制剂，其中所述甾醇选自胆甾醇和植物甾醇。
37．权利要求36的制剂，其中所述甾醇包括大豆甾醇。
38．权利要求32的制剂，其中所述油包括植物油。
39．权利要求38的制剂，其中所述植物油包括大豆油。
40．权利要求32的制剂，其中所述脂囊泡还包含电荷产生剂。
41．权利要求40的制剂，其中所述电荷产生剂包括负电荷产生剂。
42．权利要求41的制剂，其中所述负电荷产生剂包括油酸。
43．权利要求32的制剂，其中所述制剂还包含药学上可接受的载体。
44．权利要求43的制剂，其中所述所述制剂为乳油形式。
45．权利要求44的制剂，其中所述制剂特别用于阴道插入。
46．权利要求32的制剂，其中所述制剂特别用于涂于避孕套上。
47．具有杀精子和灭活有包膜病毒活性包衣的避孕套，所述避孕套上具有权利要求32的制剂。
全文摘要
开发具有抗病毒和杀精子性质的新制剂。该制剂含有由非离子两亲物、具有杀精子和/或抗病毒活性的表面活性剂、油和甾醇形成的脂囊泡。本发明的制剂和方法特别适用于粘膜如阴道粘膜并试验用于抗病毒例如HIV和牛痘。
文档编号A61K9/00GK1226924SQ97196929
公开日1999年8月25日 申请日期1997年5月20日 优先权日1996年6月7日
发明者C·D·赖特 申请人:诺瓦瓦克斯有限公司