专利名称：用于治疗痴呆的组合制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及治疗痴呆的药物组合制剂，所述痴呆是伴随胆碱能神经元破坏和胆碱能丧失的神经退化性疾病的后果(Tohgi等，神经学通讯。177(1994)，1939-1942页)。该组合制剂通过刺激蕈毒受体诱导钙离子依赖性信号递质增加，从而补偿胆碱能的丧失。所述增加显然可以通过协同腺苷作用获得，即通过能增加胞外腺苷浓度的蕈毒受体拮抗剂或乙酰胆碱酯酶抑制剂(AChE抑制剂)的物质组合获得。至今治疗老年性痴呆的药理策略仍是通过给予能够提高受体内源性乙酰胆碱(ACh)的蕈毒拮抗剂或AChE抑制剂激活蕈毒受体来维持。然而，对于胆碱能神经元系统的连续破坏，实际上提高AChE抑制将ACh水平提高到足以维持细胞功能仍有问题。另外，AChE抑制剂表现出明显的副作用并且缺乏特异性。经蕈毒受体通过其它机理介导的AChE浓度不足的作用可能是人所希望的，因此可能是开发适宜组合治疗的基础。
已知ACh不仅影响神经细胞的功能，还影响胶质细胞(星形细胞)(Messamore等，神经学报告，5(1994)，1473-1475页)。由于病理胶质细胞反应在痴呆的病理学中起明显重要的作用(Akiyama等，大脑研究632(1993)，249-259页)，故选择培养的星形细胞作为体外模型体系。借助荧光成象法研究蕈毒受体对胞内钙离子释放的作用。
现在发现，在培养的大鼠星形细胞中，Cl-腺苷以浓度依赖方式加强蕈毒能胞内钙离子释放(见附
图1-3；表1和2)。甚至在1μM Cl-腺苷的存在下，测得由ACh诱导的胞内钙离子释放也加强了约30倍。该作用不仅可被烟酸ACh受体拮抗剂抑制、还可被蕈毒受体拮抗剂阻断(表3)。Cl-腺苷还加强蕈毒能激动剂oxotremorine-M诱导的胞内钙离子释放(表4)。
大部分实验证明，加强Cl-腺苷作用(n＞200)是在ACh浓度为100nM下进行的。在该低浓度下，ACh本身是无效的。在试验浓度范围内(3nM-3μM)，Cl-腺苷本身是无效的。在微摩尔Cl-腺苷浓度下，与100nMACh的协同中，测得诱导钙离子信号所需的Cl-腺苷浓度的剂量作用实验显示出加强作用。阈浓度为1μM。在其受体亲和性上，Cl-足腺苷对应于内源性腺苷(Daly等，生命科学，28(1981)，2083-2097页)，这意味着胞内腺苷水平从生理毫微摩尔增加到1μM(Ballarin等，Acta Physiol.Scand.，142(1991)，97-103页)，也相应地使低于阈值的ACh浓度对蕈毒受体产生作用。
由这些实验结果可以得知，在痴呆中对经蕈毒受体介导的胆碱能作用的副作用可通过提高胞外腺苷浓度得到改善。后者可提高组合给予腺苷吸收抑制剂例如丙戊茶碱来实现(Parkinson等，Gem.Pharmacol.25(1994)，1053-1058页)。在组合治疗中，胞外腺苷浓度的增加降低了需任意使用的AChE抑制剂或蕈毒受体拮抗剂剂量，由此降低有害副作用的危险。
本发明涉及一种组合制剂，包含至少1.一种具有乙酰胆碱酯酶抑制作用(所谓“AChE抑制剂”)或表现出蕈毒能作用的化合物2.一种提高内源性胞外腺苷水平的化合物，和3.一种药物赋形剂，它在神经退化性疾病中同时、分开或顺序给药时具有协同增加的蕈毒作用。
提高内源性胞外腺苷水平的化合物是例如式I的黄嘌呤
和/或式I化合物的生理可耐受盐，其中R1是a)含3-8个碳原子的氧烷基，其碳链可以是直链或支链的，b)含1-8个碳原子的羟烷基，其碳链可以是直链或支链的并且其羟基可以是伯、仲或叔醇羟基，或者c)含1-6个碳原子的烷基，其碳链可以是直链或支链的，R2是a)氢原子或b)含1-4个碳原子的烷基，其碳链可以是直链或支链的，R3是a)氢原子，b)含1-6个碳原子的烷基，其碳链可以是直链或支链的，c)含1-6个碳原子的烷基，其碳链可以被氧原子间隔，或d)含3-8个碳原子的氧烷基，含1-6个碳原子的烷基，其碳链可以是直链或支链的。
优选使用这样的式I化合物，其中R1是a)含4-6个碳原子的氧烷基，其碳链是直链的，或b)含3-6个碳原子的烷基，R2是含1-4个碳原子的烷基，R3是a)含1-4个碳原子的烷基或b)含3-6个碳原子的氧烷基。
尤其优选使用1-(5-氧己基)-3-甲基-7-正丙基黄嘌呤(丙戊茶碱)。
以示例性的方式，例举下列化合物1-(5-羟基-5-甲基-己基)-3-甲基黄嘌呤，7-(乙氧甲基)-1-(5-羟基-5-甲基己基)-3-甲基黄嘌呤，1-(5-氧己基)-3，7-二甲基黄嘌呤，7-(2-氧丙基)-1，3-二正丁基黄嘌呤或1-己基-3，7-二甲基黄嘌呤。
式I黄嘌呤衍生物的适宜的生理可耐受盐是，例如碱金属、碱土金属或铵盐，包括那些生理可耐受的有机季铵碱。
式I化合物可在标准条件下用已知方法制备(US 4289776，US4833146，US 3737433)。
反应的原料物质是已知的或者可参考文献用已知方法制备。术语“协同”应理解为大于各作用之和的作用。
优选的组合制剂包含丙戊茶碱和1-苄基-4-[(5，6-二甲氧基-1-二氢茚酮)-2-基]甲基哌啶。
本发明的组合制剂适宜于治疗例如痴呆，特别是老年痴呆。
本发明的组合制剂还可包括组合的包装或组合物，其中的成分是相邻放置的，故可同时、分开或顺序给药于同一和相同的人或动物体。
本发明还涉及制备该组合制剂的方法，包括以常规方式加工1)一种具有乙酰胆碱酯酶抑制剂作用的或表现出蕈毒能作用的化合物2)一种提高内源性胞外腺苷水平的化合物和3)一种药物赋形剂，得到药物的给药形式。
本发明的组合制剂可呈单位药剂形式，如胶囊(包括微胶囊，其中通常不含药物赋形剂)，片剂(包括包衣片剂和丸)或栓剂，当使用胶囊时，胶囊材料应具有赋形剂功能并且内容物可呈例如粉末、凝胶、分散液或溶液。特别有益和简单的是，制备两种活性化合物成分1)和2)的口服(经口)制剂，它含有计算量的活性化合物和各自所需的药物赋形剂。可采用适于直肠治疗的剂型(栓剂)。另外，也可采用软膏或霜剂透皮应用、经非胃肠(腹膜内、皮下、静脉内、动脉内、肌内)注射或输注溶液或者口服给药溶液，所述溶液含有本发明的组合药物。除活性成分外，软膏、糊剂、霜剂和粉末还可含有常规赋形剂，例如动物和植物脂肪、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、聚硅氧烷、滑石、氧化锌、乳糖、硅酸、铝、硅酸铝和聚酰胺粉末或这些物质的混合物。
片剂、丸或颗粒可采用常规的压制、滴制或流化床方法或盘包衣方法制备，它含有赋形剂和其它成分辅剂，如明胶、琼脂糖、淀粉(如土豆、玉米或小麦淀粉)，纤维素如乙基纤维素、硅石、各种糖如乳糖、碳酸镁和/或磷酸钙。包衣用溶液通常由明胶、阿拉伯胶、聚乙烯吡咯烷酮、合成纤维素酯、表面活性物质、增塑剂、染料和相应于本领域的类似添加剂组成。为制备药物制剂，还可使用常规的流动调节剂、润滑剂或助流剂如硬脂酸镁和控释剂。
制剂优选为包衣-/核片剂或多层片剂，活性成分可在包衣或核或中间层中，而活性成分1是在核或包衣或另一中间层中。还可将活性化合物成分制备成延缓释放形式或吸收在延缓释放的材料中或包含在延缓释放的材料(例如那些基于纤维素或聚苯乙烯树酯的材料，如羟乙基纤维素)中。也可通过掺入常规肠衣的层或室来延缓释放活性成分。
当然，使用的剂量取决于各种因素，例如所治疗的生物体(即人或动物)、年龄、体重、健康状况、疾病严重程度、所医治的疾病、同时并存的疾病(如果有的话)、同时使用的其它药物的性质或治疗频率。药剂可每日给药数次，优选每日一到三次。在此基于各种单个活性化合物的每日推荐剂量，在组合制剂中所使用的各种活性化合物的量一般应为每日推荐剂量的10％-100％，优选20％-80％，尤其是50％。适于治疗的本发明的组合剂可以以单位剂量的本发明组合制剂给药，所述制剂组成如下1)100mg-600mg，优选200mg-400mg丙戊茶碱，尤其是300mg丙戊茶碱，和2)2mg-20mg，优选5mg-10mg 1-苄基-4-[(5，6-二甲氧基-1-二氢茚酮)-2-基]甲基哌啶，该量取决于单位剂量的性质以及所医治的疾病，单位剂量可由数种同时给药的剂量单位组成。药理实施例星形细胞培养物该培养物取自乙醚麻醉处死后的19-20天龄的雌性Wister大鼠胚胎的脑胶质的胶质星形细胞。制备脑后，用吸移管吸出胶质组织并加到加有15％胎牛血清Dulbecco改性Eagle培养基中(DMEM)。滤过晶状体组织后，将细胞悬浮液转移到载波片(用聚乙烯亚胺包被)上，并在培养瓶中、在标准条件下在培养箱中培养，每两周更换一次培养基。约7天后，收获细胞，胰酶消化(为除去神经细胞)后，再以5×104细胞/cm2转移并培养6-8天直至实验开始。这些培养物由高于95％的胶质细胞组成，它们对星形细胞标记GFAP(酸性纤维性胶质细胞蛋白)呈免疫阳性反应。测定胞内钙离子浓度的荧光成象实验和其实验影响。
在实验开始时(再转移后6-8天)，通过在BHKR(碳酸氢盐的，HEPES缓冲的Krebs-Ringer溶液)中与5μM fura-2-乙酰氧甲酯(分子探针)在37℃培养1小时，使培养的星形细胞携带钙离子荧光标记而具有特异性。携带标记后，将载有培养的星形细胞的载波片转移到测定室中并安置在倒置的荧光显微镜(Zeiss Axiovert 100，Zeiss Fluar 40 x目标)上(属荧光成象测定站)。在实验期间(通常为20-30分钟)，往测定室中以600μl/分的流速连续灌注温控的(37℃)BHKR。使用FUCAL荧光成象系统(T.I.L.L Photonics GmbH，Planegg)进行测定，在340nm和380nm波长两次兴奋后，借助CCD摄像机(CS 980，Theta System，Grobenzell)测定420nm波长下的发射荧光并计算相应的钙离子浓度。在各种试验物质加入灌注培养基之前、期间和之后的测定时间间隔均为12秒。在各个确定的细胞水平下，测定胞内钙离子浓度的变化。
通常，用1分钟将各种试验物质(在有或没有Cl-腺苷存在下的乙酰胆碱或oxotremorine)加到灌注培养基中。由于诱导的胞内钙离子的升高是暂时性的，胞内钙离子浓度的变化显示于结果表中，在各实验中基于测得的峰值作曲线。表1胞内钙离子浓度的增加(nM)
平均值±SEM，测量的细胞数n＝45(对于每个测量值)表1说明，在1μM Cl-腺苷同时作用下，星形细胞中由ACh诱导的胞内钙离子增加的剂量-作用曲线明显左移。为产生等量高的钙离子信号，在此ACh水平仅为100nM，在没有协同腺苷的作用下，相同情况所需的ACh浓度要高出30倍还多(高于3μM)。该协同作用所必须的关键腺苷增加作用在通过用腺苷吸收阻断剂丙戊茶碱治疗所获得的药理作用范围内。表2
平均值±SEM，测量的细胞数n＝40(对于每个测量值)表2说明，在100nM ACh存在下，钙离子迁移所需的Cl-腺苷浓度。表3在培养的胶质星形细胞中，烟酸乙酰胆碱受体拮抗剂(己烷双胺)和蕈毒乙酰胆碱受体拮抗剂(pFHHSiD)对由100nM乙酰胆碱和1μM Cl-腺苷诱导的胞内钙离子浓度的增加作用。
pFHHSiD(hexadrodiladifenidol盐酸盐，对氟类似物)；制造商RBI(Reaearch Biochemicals International)。
在没有拮抗剂存在下，获得100nM乙酰胆碱和1μM Cl-腺苷的胞内钙离子增加的百分数平均值±SEM(对照值＝100％)。测得的胞内钙离子增加的对照值为98.4±6.4nM(n＝125)。
表3说明由Cl-腺苷加强的ACh作用是代表性的经蕈毒受体介导的ACh作用，该受体为蕈毒受体阻断剂所拮抗，但不被烟碱受体阻断剂所拮抗。表4在培养的胶质星形细胞中Cl-腺苷和蕈毒乙酰胆碱受体激动剂oxotremorine-M对胞内钙离子含量的影响。
平均值±SEM(n＝6)。
表4说明，Cl-腺苷也加强由蕈毒受体激动剂诱导的钙离子信号。
附图1显示第7页下段至第8页所述荧光成象实验的结果。单独使用100nMACh和1μM Cl-腺苷是无效的。它们的组合可大大增加培养的星形细胞中的胞内钙离子。在不含钙离子的培养基中组合使用ACh和Cl-腺苷进行相同实验时，虽然显示了稍低的加强作用，但仍大大增加了培养的星形细胞中的胞内钙离子。这表明，胞内钙离子迁移了。
附图2说明如第7页下段至第8页所述的荧光成象实验，其中在星形细胞中，在1μM Cl-腺苷同时作用下，由ACh诱导的胞内钙离子增加的剂量作用曲线明显左移。为产生等量高的钙离子信号，在此ACh水平仅为100nM，在没有协同腺苷的作用下，相同情况所需的ACh浓度要高出30倍还多(高于3μM)。
附图3说明如第7页下段至第8页所述的荧光成象实验结果，其中测定了在100nM ACh存在下，钙离子迁移所需的Cl-腺苷浓度。
权利要求
1.一种组合制剂，包含至少1)一种具有乙酰胆碱酯酶抑制作用的或表现出蕈毒能作用的化合物2)一种提高内源性胞外腺苷水平的化合物，和3)一种药物赋形剂，它在神经退化性疾病中同时、分开或顺序给药时，具有协同增加的蕈毒作用。
2.权利要求1的组合制剂，其特征在于，含有的具有乙酰胆碱酯酶抑制作用的化合物选自9-氨基-1，2，3，4-四氢吖啶、1-苄基-4-[(5，6-二甲氧基-1-二氢茚酮)-2-基]甲基哌啶和milameline。
3.权利要求1组合制剂，其特征在于，含有的增加内源性胞外腺苷水平的化合物选自式I的黄嘌呤
和/或式I化合物的生理可耐受盐，其中R1是a)含3-8个碳原子的氧烷基，其碳链可以是直链或支链的，b)含1-8个碳原子的羟烷基，其碳链可以是直链或支链的，并且其羟基可以是伯、仲或叔醇羟基，或者c)含1-6个碳原子的烷基，其碳链可以是直链或支链的，R2是a)氢原予或b)含1-4个碳原子的烷基，其碳链可以是直链或支链的，R3是a)氢原子，b)含1-6个碳原子的烷基，其碳链可以是直链或支链的，c)含1-6个碳原子的烷基，其碳链可以被一个氧原子间隔，或d)含3-8个碳原子的氧烷基，其碳链可以是直链或支链的。
4.权利要求1-3任一项或多项的组合制剂，其特征在于，含有的化合物是丙戊茶碱和1-苄基-4-[(5，6-二甲氧基-1-二氢茚酮)-2-基]甲基哌啶。
5.权利要求1-4任一项或多项的组合制剂的用途，用于生产治疗神经退化性疾病，尤其是老年性痴呆的药物。
6.一种制备权利要求1-4任一项或多项的组合制剂的方法，其特征在于，以常规方式加工1)一种具有乙酰胆碱酯酶抑制剂作用或表现出蕈毒能作用的化合物2)一种提高内源性胞外腺苷水平的化合物，和3)一种药物赋形剂，得到一种药物给药形式。
全文摘要
一种组合制剂,含有具有乙酰胆碱酯酶抑制作用或显示出蕈毒能作用的化合物和增加内源性胞外相水平的化合物,适于治疗痴呆症。
文档编号A61K45/06GK1192904SQ98105328
公开日1998年9月16日 申请日期1998年2月25日 优先权日1997年2月26日
发明者H-P·舒伯特, H·尼迈斯格恩, K·鲁多尔菲 申请人:赫彻斯特股份公司