专利名称：治疗组合物(Ⅱ)的制作方法
技术领域：
本发明涉及组合物，所述组合物适合于给予需要增加(R)-3-羟基丁酸化物(hydroxybutyrate)((R)-3-羟基丁酸或D-β-羟基丁酸化物)水平的人和动物；详细地说是通过口服、局部、皮下或胃肠外给药，但是最好是口服给药。
给予(R)-3-羟基丁酸对人体和动物体具有许多有益的作用。这些有益的作用尤其包括增强心脏功能如对心力衰竭病人、作为葡萄糖的替代性能源如对糖尿病和胰岛素抵抗状态的病人，以及治疗由于神经元细胞如CNS细胞损害所引起的疾病，特别是延缓或预防例如发现于早老性痴呆和帕金森氏综合征及类似的疾病和症状中的脑损伤。
羟基丁酸钠显示可使大脑循环和局部血管舒缩反射增加40％(Biull.Eksp.Biol.Med.88卷11,555-557页)。欧洲专利0780123 A1进一步描述使用乙酰乙酸、β-羟基丁酸、这些酸的一元、二元或三元醇酯或2到10个β-羟基丁酸酯的线性低聚物抑制大脑水肿、保护大脑功能、调整大脑能量代谢并减少大脑梗塞的范围。
在正常的人受试者和具有许多症状的病人身上使用了(R)-3-羟基丁酸钠盐的静脉输注剂，所述病人在一个精心护理单体内接受严重脓毒症的治疗，并且发现(R)-3-羟基丁酸钠盐的静脉输注剂是无毒的并能够减少葡萄糖游离脂肪酸和甘油的浓度，但是对减少亮氨酸的氧化无效。
本发明进一步确定升高(R)-3-羟基丁酸和/或乙酰乙酸化物(acetoacetate)的血液水平的化合物和组合物，所述化合物和组合物也可用于减少体内的游离基，并且因此具有治疗与游离基有关的疾病的作用。
(R)-3-羟基丁酸化物和/或乙酰乙酸化物，通常归为酮体，为普通的产生能量的底物提供了一种正常的生理替代物，所述底物为葡萄糖和脂肪酸。在长期禁食期间，人体内的脂肪酸通过肝脏转化为可被体内除肝脏而外的大多数组织利用的(R)-3-羟基丁酸和乙酰乙酸化物。在这类情况下，血液总酮体升高到大约7mM。当血液中的总酮体适度升高时，肝外的组织如脑、心脏和骨骼肌利用在线粒体内的这些酮体以NADH的形式提供减少的能量，NADH为电子转移体系的最基本的底物和合成ATP所需能量的发生器(generator)。由酮体产生的线粒体NADH又依次降低游离的线粒体[NAD+]/[NADH]比率和胞质液的[NAD+]/[NADPH]比率之间的比率，线粒体[NAD+]/[NADH]连接至胞质液的[NAD+]/[NADPH]。酮体的分解代谢减少线粒体的[NAD+]/[NADH]时，它氧化一定比率的线粒体的[辅酶Q]/[ubiquinol],[Q]/[QH2]。Ubiquinol的半醌形式是线粒体过氧化物、O2产生的主要来源。通过减少还原形式的QH2及其半醌的量，可以减少由线粒体产生的游离基，同时增加与NADP系统连接的游离基的清除剂，如谷胱甘肽。
因此，本发明人确定通过给予在体内升高酮体水平的药剂可减少过量的还原Q或NADH脱氢酶抑制导致的游离基损害，如出现在MPP引起的毒性时的游离基损害。
许多疾病过程与游离基损害有关，所述疾病中有神经性疾病帕金森氏病、肌萎缩性侧索硬化、早老性痴呆和大脑局部缺血。另外，暗示过量的游离基损害在冠状再灌流、糖尿病性血管病、肠炎性疾病和胰腺炎中发挥了作用。
本发明人的同时待审的WO 98/41201揭示当给予(R)-3-羟基丁酸和/或乙酰乙酸的线性酯时可升高体内游离化合物的水平。口服给予4 mM的四-(R)-3-羟基丁酸酯的低聚物或其乙酰乙酰基酯显示升高了酮体的血液水平，以致超过2个小时后仍可测出(R)-3-羟基丁酸化物的水平增加1到2 mM。
现在，本发明人确定，当该组合物中的(R)-3-羟基丁酸成分作为环状低聚物给予时可提供出乎意料的优点。这些优点可特别包括(a)增加升高血液中(R)-3-羟基丁酸水平的效率，以致该水平增加超过2mM，包括接近或超过禁食水平；(b)在数小时期间维持升高的水平；(c)能够给药而不需抗衡离子，如钠或甲基葡萄糖胺，合乎需要的是不增加病人的盐的负担或者设计有意义的剂量及(d)由可通过生物培养获得的聚合原料制备纯化合物相对容易。
本申请特别涉及神经性退化疾病的问题，特别是神经元受到致病剂如蛋白质斑块和氧化损害的神经中毒作用的疾病，并且本申请进一步提供用于治疗这些及前述疾病的组合物。
在优选的实施例中，本发明提供了升高对纠正上述缺陷所必须的血液酮并且可以通过胃肠外或肠内给药达到目的。详细地说，它不要求给予具有潜在毒性的药物。本发明改良了的升高的酮体水平特别是血液水平的效力提供了典型生酮饮食的治疗作用而没有任何给予未用过的成年人的副作用，在儿童中没有发现生酮饮食有毒。另外，本发明人确定由于改正上述代谢的和毒性的缺陷，在退化的细胞中的细胞因子反应及增加的凋亡的(apoptotic)肽将减少，这归因于在神经细胞中增加了能量状态以及由增加的神经递质如乙酰胆碱的合成引起的营养刺激增加。
本发明人提供的治疗方法超出了酮体对循环的作用，因为提供了对由于神经退化及/或代谢缺陷使细胞不能够发挥作用的治疗，特别是在葡萄糖的代谢中，如由神经毒性剂如肽、蛋白质、游离基损害和遗传异常作用造成。所述治疗包括酮体对细胞本身的作用并且不使血液流向细胞。
因此，本发明的第一个方面提供一种式(Ⅰ)的(R)-3-羟基丁酸的环酯或其具有一个或多个阳离子的配合物或其盐用于医疗或营养 其中n为1或大于1的整数。
对于口服给药，优选游离的环状低聚物。配合物中存在的阳离子优选钠、钾、镁和钙阳离子并由生理上可接受的抗衡阴离子平衡，以提供一种盐配合物。
生理上可接受的盐的典型实例选自钠、钾、镁、L-赖氨酸及L-精氨酸或更复杂的盐如甲基葡萄糖胺盐。
n优选为1到200的一个整数，更优选1到20，最优选1到10并且特别便利的是1，例如(R,R,R)-4,8,12-三甲基-1,5,9-三氧杂十二-2,6,10-三酮、2、3、4或5。
本发明的环酯优选用于治疗疾病状态和/或增强细胞功能，如心力衰竭时增强心脏细胞功能，所述疾病状态由游离基、毒性剂如肽和蛋白质、不利于新细胞代谢的遗传缺陷、胰岛素抵抗或其它的葡萄糖代谢缺陷或包括状态缺陷、局部缺血、头部创伤介导。
本发明的第二个方面提供治疗细胞和/或用于增强细胞功能的方法，所述细胞由于游离基、毒性剂如肽和蛋白质、不利于细胞代谢的遗传缺陷、胰岛素抵抗或其它的葡萄糖代谢缺陷或包括状态缺陷、局部缺血、头部创伤的作用而发生机能障碍，该方法的特征包括给予式(Ⅰ)的环状低聚物。这可包括治疗人和/或动物的这类疾病状态。
通过它对血液和血浆(R)-3-羟基丁酸盐和乙酰乙酸化物水平的升高作用，该方面包括使用作为神经元的刺激剂，例如能够在体内或体外刺激神经细胞例如海马或黑质细胞中轴突和/或树突生长的用途，特别是在神经退化具有严重临床后果的疾病中的用途。
第三方面本发明提供了肠内或胃肠外营养的方法，优选口服途径营养，该方法包括给予式(Ⅰ)的环状低聚物。
第四方面本发明提供了式Ⅰ的环酯在生产用于治疗疾病状态和/或增强细胞功能的药物中的用途，所述疾病状态由游离基、毒性剂如肽和蛋白质、不利于细胞代谢的遗传缺陷、胰岛素抵抗或其它的葡萄糖代谢缺陷或包括状态缺陷、局部缺血、头部创伤介导。
第五方面本发明提供了组合物，该组合物的特征在于包括生理学上可接受的形式的式(Ⅰ)环状低聚物及生理学上可接受的载体。
详细地说，该组合物适合于胃肠外或肠内给药，特别是口服给药。胃肠外使用的组合物为无菌和无热原的。口服使用的组合物可以包含食品基质并可以以乳剂的形式或仅仅与固体食物混合的形式使用。
详细地说，总的组合物中包含的所述环状低聚物有效量至少为组合物的2％(重量)或以上，例如至少为5％(重量)，更优选20％或以上而最优选50％到100％。所述组合物可以采用口服、胃肠外或任何其它的常规给药方式。
本发明所有方面的方式中，优选将式(Ⅰ)化合物与生理比率的乙酰乙酸或乙酰乙酸的代谢前体一起给药。术语代谢前体具体指含有乙酰乙酰基部分的化合物如乙酰乙酰基-1,3-丁二醇，优选乙酰乙酰基-(R)-1,3-丁二醇、乙酰乙酰基-(R)-3-羟基丁酸化物和乙酰乙酰基甘油。这类具有一羟基、二羟基或三羟基或更多羟基如葡糖基的任何此类化合物的酯、醇也是有希望的。
在糖尿病病人中，使用所述环状低聚物可以维持低血糖水平而不必担心低血糖并发症。正常的非糖尿病受试者的禁食血糖为80到90mg％(4.4-5 mM)，在进餐后升到130 mg％(7.2 mM)。为了阻滞血管并发症长期推荐糖尿病患者采用“严格控制”的方法，但是，实际上医师已经发现，由于低血糖的影响，在餐后很难将血糖严格控制在150 mg％(8.3 mM)以下。血糖降到2 mM的正常受试者经常发生低血糖昏迷。与以前讨论的，(62,63)在存在5 mM的血液酮体的情况下，当血糖降到1 mM以下不会有神经病的症状。
本发明人确定给Ⅱ型糖尿病患者补充本发明的环状低聚物将能够更好地控制血糖，因而预防眼睛和肾脏的血管变化，所述变化在患糖尿病20年后发生并且所述变化是糖尿病患者发病和死亡的主要原因。
这里所述治疗是针对有关疾病的发作，如通过生酮饮食治疗顽固性的癫痫，由于使用环状低聚物改善了治疗方法，这归因于减少或除去了高脂和碳水化合物的量。这类病人包括那些在大脑的葡萄糖转运系统、糖酵解或PDH本身存在遗传缺陷的病人，如Leighs综合征、内毒素休克或高应激反应状态患者。
详细地说，可用这些药物治疗的疾病为所有与PDH阻塞有关的疾病，包括头部创伤后发生的疾病，或与供应给线粒体的乙酰辅酶A(CoA)减少或除去有关的疾病，如胰岛素昏迷和低血糖，脑中或其它部位葡萄糖转运缺陷或在糖酵解的酶步骤缺陷。
含有乙酰乙酸化物的药物或nutraceutical最好不要长期储存或暴露于超过40℃的温度中。乙酰乙酸化物不宜受热并且在100℃剧烈地分解为丙酮和CO2。在这类情况下优选通过使组合物与身体代谢过程接触产生乙酰乙酸化物。组合物优选含有乙酰乙酸的酯前体。
第六方面本发明提供了治疗人或动物神经元细胞如脑细胞的方法，所述细胞经受了与细胞损害有关的疾病，特别是那些导致细胞死亡的疾病，如在第二方面到第四方面所提到的疾病，特别是神经退化性疾病如与神经中毒情况(如淀粉样蛋白质的存在)有关的疾病，例如与记忆或运动有关的疾病如早老性痴呆和帕金森氏病，或癫痫发作，该方法包括给予患者至少一种在本发明第一到第五方面中使用的物质。
本发明人进一步确定，通过给予足够量的(R)-3-羟基丁酸的环状低聚物提供的酮体提升总的血液酮体浓度，升高的水平导致不仅简单的维持细胞活力而且实际上改善了细胞功能并且超过了正常细胞如以与血液流动或营养无关的方式控制水平的细胞的生长。一方面本发明进一步提供了环状低聚物作为能够产生神经元刺激作用的药物的用途，如类似于激活的神经生长因子，增加代谢的速率和增加如轴突和树突的功能特征的范围。在这一方面本发明提供了一种改善神经元的功能以及延缓退化的机理。
Hoshi和合作者的最近研究(77,78)强烈地暗示部分淀粉样蛋白质的累积是早老性痴呆症的特征，Aβ1-42作用刺激线粒体的组氨酸蛋白激酶，该酶磷酸化和灭活丙酮酸脱氢酶多酶配合物。PDH配合物是一种线粒体酶，该线粒体酶负责通过糖酵解在胞质内从丙酮酸盐产生乙酰CoA和NADH。形成的线粒体乙酰CoA与草酰乙酸盐缩合开始克雷布TCA(三羧酸)循环彻底燃烧丙酮酸盐产生CO2，同时提供具有还原能力的线粒体，该线粒体成为电子转移系统的底物，通过该系统产生线粒体的ATP合成所要求的能量。
脑中的酮体利用受转运的限制，在基底神经节利用酮体较少，其血液水平在1 mM(76)以下。可是，对于长期禁食的正常人，其水平为7.5 mM，酮体进入大脑的速率是足够满足大多数的大脑能量的需要并预防低血糖综合征，即使在面临通常引起惊厥或昏迷的血糖水平(63)时。
在同时待审的申请WO 98/41201，‘治疗组合物’中，本发明人假设在具有PDH阻塞(阻止由葡萄糖产生正常能量)的早老性痴呆中，如果能够提供升高如正常禁食的酮体水平，就可以分流存在于这些患者中的PDH阻塞，由此防止由于能量耗尽或缺少胆碱能的刺激而引起的细胞死亡并因此减缓进行性的记忆丧失和痴呆。另外，利用酮体的神经生长/刺激作用，特别是(R)-3-羟基丁酸化物或其与乙酰乙酸化物的生理比率，可以改善仍有活力的细胞超出它们已经退化的状态并且因此在患者中可以观察到一些改善的功能。
对于饲养的动物和人，以血液容量为基础的肝脏容量的乙酰乙酸化物是十分低的，如0.09 mM，而(R)-3-羟基丁酸化物为0.123 mM，但在禁食48小时后上升到如0.65 mM的乙酰乙酸化物和1.8 mM的(R)-3-羟基丁酸盐(84)。因为集合的胰岛素在脂肪组织中减少脂肪酸重新酯化为甘油三酯，从而引起游离的脂肪酸释放进入血流，所以饥饿时酮升高。释放的游离脂肪酸可以被吸收并在β-氧化的过程中被肌肉、心脏、肾脏和肝脏用作能源。可是，肝脏具有转化游离脂肪酸为代谢的燃料(fuel)，酮的能力，在禁食期间除肝而外的器官包括脑可用酮作为葡萄糖的替代物。酮体的肝脏合成由线粒体的乙酰CoA引起，而线粒体的乙酰CoA是在脂肪酸的β-氧化期间由肝脏产生的。
酮体通过相同的载体进入除肝以外的组织，在那里其它的一羧酸化合物可以象竞争抑制剂一样作用。非生理性的异构体如D-乳酸盐或(S)-3-羟基丁酸化物也可以象酮体转运的竞争抑制剂起作用。因为酮体转移穿过血脑屏障对大脑的酮体利用是一个限制性因素(76)，每种努力都应该是使这些非生理对映体的血液浓度在生酮治疗期间保持在低水平。当血液的酮体浓度升高到饥饿状态下发现的水平时，心脏、肌肉、肾脏及脑利用酮体作为最好的能量底物因此本发明人确定，由酮体衍生的线粒体乙酰CoA可以代替在抑制组织中的PDH多酶配合物期间发生的乙酰CoA缺乏，其中酮体通过使用本发明人描述的环状低聚物产生，所述组织依赖葡萄糖的代谢以供应其代谢的能量。供应线粒体的枸橼酸盐也可以通过三或二羧酸转运蛋白(transporter)转移到胞质，在胞质中可转化为合成乙酰胆碱所需要的胞质乙酰CoA。在方案1中显示了克雷布循环反应以便进一步帮助阐述这些概念。
与游离脂肪酸相反，酮体不能在肝脏产生乙酰CoA。因为乙酰CoA为脂肪酸的不可缺少的前体，它们在肝脏中既不能够引起增加脂肪酸也不能够增加胆固醇的合成，通常解释这两种潜在致病的物质的一半以上在体内合成。肝脏对出现在肝脏的乙酰乙酸/(R)-3-羟基丁酸盐的比率敏感并且将改变它的线粒体的游离[NAD+]/[NADH]，因为接近由β-羟基丁酸脱氢酶建立的平衡(BC 1.1.1.30)(31)。
上文也特别指出，可以提供一种方法增加未患慢性或急性代谢疾病的人或动物的线粒体能量产生效率，该方法包括给予人或动物式(Ⅰ)的环状低聚物，给予的量足以使(R)-3-羟基丁酸化物的血液水平升高到0.5 mM至20 mM。方案1
增加血酮的最容易的方法是饥饿。当长期禁食，血液酮升到7.5mM的水平(62,63)。可是，这种选择不可以长期使用，因为在禁食60天后会通常会发生死亡。
自1921年以来就一直使用主要包含脂质的生酮饮食治疗孩子的癫痫，特别是肌阵挛的和不能运动的癫痫发作(109)并且在通常的药物方法难以治疗的情况下证明有效(71)。口服或胃肠外给予游离脂肪酸或甘油三酯可增加血酮，提供低的碳水化合物和胰岛素以便防止在脂肪组织重新酯化。以含有70％玉米油、20％酪蛋白水解物、5％纤维素、5％的McCollum’s盐混合物的饮食饲养的老鼠血酮大约为2mM。用猪油代替玉米油时血酮升高到几乎5 mM(Veech，未出版)。
在所述饮食下，通常达到的酮体水平大约为2 mM的(R)-3-羟基丁酸盐和1 mM的乙酰乙酸，同时游离脂肪酸的水平大约为1 mM。其它变化的组合物已经尝试包含中等链长的甘油三酯。通常，由于它们的糟糕口味，符合这类限制的饮食一直是贫乏的(56)。也尝试将高脂低碳水化合物的饮食作为癌症患者的治疗剂，以便减少肿瘤对葡萄糖的利用(88)、作为患有和不患有糖尿病的患者的减肥饮食(74,112)并改善运动耐力(83)。
有许多限制性饮食依赖脂质升高血酮水平到神经学上的有效水平。首先，以脂质为基础的饮食的酮体水平趋向低于3 mM，长期禁食的超重人达到显著低于7.5 mM的水平。第二，未核准(unauthorized)摄入的碳水化合物增加胰岛素的分泌并引起肝脏的游离脂肪酸向酮的转化迅速减少，及随之而来的是降低血酮并且通过脂肪组织脂质转移酯化为甘油三酯。许多趣闻报道涉及“因生日蛋糕中断饮食”的儿童癫痫的重新发作。第三，它们的糟糕口味及必须避免碳水化合物以便维持高的酮体水平使得这类高脂饮食很难在缺少耐心的成年人中应用，特别是在社交时通常会出现精制糖、面包、面食、米饭及马铃薯的过多摄入。实际上，传统的高酮饮食并不能在除儿童外的患者中执行，因为儿童的所有食物都是在严格的监督下在家里制备的。第四，成年人摄食如此大量的脂质将导致严重的具有增加血管疾病和散在的肝及胰病的病理性后遗症的高甘油三酯血症和高胆固醇血症，因此不能规定作为医疗的根据。在70年代为了减重流行摄入高脂低糖的饮食而不顾高热量的摄入，所述饮食规定糖的摄入量是低的。可是，因为血脂升高与动脉粥样硬化之间关系的意识的增加，所述饮食的流行程度已大幅度降低。
在液体饮食中用具有外消旋的1,3-丁二醇替代葡萄糖(其中葡萄糖总计为热量的47％)，引起血酮浓度上升大约10倍，达到0.98 mM的(R)-3-羟基丁酸盐和0.33 mM的乙酰乙酸化物(1 07)。这些值稍微低于通常禁食48小时后获得的值而远远低于禁食的人所获得的7.5 mM的水平。外消旋的1,3-丁二醇被肝脏转化为乙酰乙酸化物和非天然的L-β及天然的D-β-羟基丁酸化物(分别为(S)3-羟基丁酸化物和(R)3-羟基丁酸化物)。虽然外消旋的1,3-丁二醇在动物食物中作为一种廉价的热量来源已被广泛地研究并且甚至实验性地用于人的食谱中(81,101)，非天然的L-异构体的产生很可能在长跑中产生严重的毒性，如人类使用非天然的D-乳酸盐所显示的一样(64)。给予非天然的L异构体的一个缺点就是它与天然的(R)-3-羟基丁酸化物竞争转运。因此(R)1,3-丁二醇作为酮体的一种前体的供应品可能可以避免不必要地给予或产生非天然的异构体。
推荐外消旋的1,3-丁二醇的单及双乙酰乙酰基酯作为一种卡路里的来源并用猪试验(67)。口服给予一种含有30％卡路里的食物团如酯产生一个短暂的5 mM血酮峰。可是，因为上述理由将不会推荐使用会产生异常的(S)3-羟基丁酸化物的外消旋的1,3-丁二醇。
尽管不推荐在这类配制中使用外消旋的1,3-丁二醇，却可以使用(R)1,3-丁二醇的酯，包括单独使用或作为乙酰乙酸酯使用。对鼠的研究显示喂外消旋的1,3-丁二醇引起肝脏胞质液的[NAD+]/[NADH]从1500减少到约1000(87)。比较起来，给予乙醇使肝的[NAD-]/[NADH]降到大约200(106)。
当新鲜制备时，可将乙酰乙酸用于输注液中，可按在生理学上与(R)-3-羟基丁酸化物的正常比率给予乙酰乙酸化物，以便取得最佳效果(95)。因为生产需要，即普遍要求长的放置期和加热灭菌的溶液，经常以酯的形式给予乙酰乙酸化物。在加热灭菌期间已经完成了增加其放置期和增加其稳定性的工作。估量酯酶的活性在血流中大约为0.1 mmol/min/ml而在肝脏中大约为15 mmol/min/g(68)。在胃肠外(59)和肠内的营养(82)中除了结合1,3-丁二醇和乙酰乙酸的酯外还有已被广泛研究的乙酰乙酸的甘油酯。曾经报道这类制剂可减少肠的萎缩，这归因于肠细胞对乙酰乙酸的高摄入并且可用于治疗灼伤(85)。
在最佳条件下，对本发明的优选实施例而言，酮的生理比率应该通过给予环状低聚物和乙酰乙酸实现。在所有的动物中，如果不是生理比率，肝脏将按照它自己的线粒体的游离[NAD+]/[NADH]调节酮的比率。如果给予异常比率的酮，肝脏将调节该比率，以与肝脏的[NAD+]/[NADH]一致。在工作的心脏中，用乙酰乙酸化物作为唯一的底物灌注将迅速地导致心力衰竭(99)，相反用葡萄糖、乙酰乙酸化物和(R)-3-羟基丁酸盐的混合物灌注大鼠的心脏，酮体的生理比率增强了心脏的效率(95)。
由微生物产生的聚酯方便地合成用于本发明的环状低聚物。天然的(R)-3-羟基丁酸的聚酯作为商业物品出售，例如来自于真养产碱杆菌(Sigma Chemical Co.St.Louis)的530,000 MW的聚合物或甜菜的250,000 MW聚合物(Fluka,Switzerland)。细菌产生作为贮存营养物来源的低聚物。在70年代，在比利时的UK和Solvay et Cie,ICI开发了通过细菌发酵这些聚合物作为潜在的可生物降解的塑料用于止血塞和其它用途。现在已经克隆了负责聚(R)-3-羟基丁酸酯合成的体系并且在给予细菌的底物的基础上改变产生的聚合物的组合物。负责聚链烷酸酯合成的基因已被克隆并在许多微生物中表达，在极易变化的条件下，在各种生物中生产这种物质(93,102,113)。
环状低聚的(R)-3-羟基丁酸酯的优选形式至少部分是容易被人或动物消化和/或代谢的。这些优选的形式为2到200个重复单体(repeats)，典型的是2到20个，最常用的是3到10个重复单体长度，特别是3个重复单体即三交酯(triolide)。最现实的是，由于可获得许多易于吸收的特征的优点，可以使用这类低聚物的混合物。为了调节产生的血液水平分布，类似地可以提供具单体或线性低聚物或聚合物的混合物。
通过Seebach等Helvetia Chimica Acta 71卷(1988)155-167页和Seebach等Helvetia Chimica Acta 77卷(1994)2007到2033页描述的方法，可以提供用于本发明的环状低聚物。对于一些情况，优选5到7个或更多的(R)-3-羟基丁酸酯单体的此类环状低聚物，因为它们在体内更容易分解。在此描述的所述化合物的合成方法通过引用结合到本文中。
因为肝脏不能够代谢酮体而仅仅能够改变(R)-3-羟基丁酸化物/乙酰乙酸化物的比率，所以一旦单体在血流中，酮体就被转移到可以被利用的肝外组织中。当存在生酮饮食的情况时，酮体达到的血流水平不受非依从的碳水化合物摄入造成的变化的影响。而是它们仅仅是对正常饮食的补充，给予足够的量以产生持续的血液水平，在24小时期间典型地是在0.3到20 mM之间，更优选2到7.5 mM，这取决于治疗的疾病。在耐药的儿童癫痫的情况下，目前认为2 mM的血液水平是足够的。按照对禁食人所完成的研究，在早老性痴呆症的病例中，努力提供替代性的能量和乙酰CoA供应早老性痴呆症患者的大脑组织(其大脑组织中的PDH容积因为过量的Aβ1-42淀粉样肽而损害(77,78))，力图保持水平在7.5 mM或以上。
本发明人确定(R)-3-羟基丁酸化物和其与乙酰乙酸化物的混合物作为神经刺激剂起作用，例如神经生长刺激剂和/或轴突和树突生长的刺激剂，为了治疗神经退化，开发选择性升高酮体水平至稍低于营养上所要求的程度。
本发明的组合物最好无菌和无热原，特别是无内毒素。其次，当将其作为正常饮食的添加剂以改进吸收补充物的患者的顺应性时，最好能够以使它们可口的方式配制。该环状低聚物通常是无气味的。(R)-3-羟基丁酸酯的环状低聚物和其与乙酰乙酸化物的混合物的制剂可以用掩盖剂包衣或通过以小肠吸收为目的肠溶衣包衣或用制药或制营养品领域所熟知的其它方式包封它们。
因为酮体含有大约4到6卡路里/g，所以为了避免肥胖最好代偿性减少其它营养品的摄入量。
本发明叙述了使用环状低聚物的具体优点为1)它们可与含有碳水化合物的普通饮食一起吃而不会降低血液的酮体水平(酮体水平的减少将会削弱治疗效果)。
2)它们不会象含有奶油和人造黄油的饮食一样升高血液的VLDL和胆固醇，因此排除了加速血管疾病、脂肪肝和胰腺炎的危险。
3)它们将可以广泛地用于各种病人包括但不限于此防止低血糖发作和昏迷的Ⅱ型糖尿病、在早老性痴呆症和其它神经退化性疾病中防止神经细胞如海马细胞的死亡、归因于大脑的葡萄糖转运蛋白减少、糖酵解缺陷或具有PDH先天缺陷的所谓的Leigh’s综合征的顽固性癫痫。
以乳剂的形式口服及胃肠外使用本发明的环状低聚物，而很少选用未酯化状态的乙酰乙酸，因为它受自发性脱羧作用成为丙酮的影响，其在室温下的半衰期大约为30天。本发明的组合物包含乙酰乙酸，乙酰乙酸可以为前体形式。如同时待审的申请“治疗组合物”中所述一样，乙酰乙酸可以作为(R)-3-羟基丁酸酯方便地提供。
治疗方法可以包括使患者摄入大部分热量的供应品，该供应品含有环状的(R)-3-羟基丁酸酯低聚物或低聚物制剂，以便缓慢地释放，在24小时期间维持血酮水平在升高的范围内，如在0.5到20 mM，优选2-7.5 mM的范围。酮体释放进入血液可能受所采用的各种技术如微囊化、吸附作用等的限制，这些技术在许多药剂的口服给药中普遍采用。在酸性环境中物质不需要水解或对水解不敏感时，可特别使用靶向传递通过胃的肠溶衣形式。对一些这样的水解可以设计为未包衣的形式使用。一些形式可包括酶能裂解酯而释放出酮体，如在Doi.Microbial Polyesters中提到的形式。
优选的环低聚物如三交酯可以被添加到如食品中和/或在治疗方案中补充通过不同的释放模式产生的其它酮体如单体(R)-3-羟基丁酸酯。后者可以以水溶液的形式，如作为盐如钠、钾、镁或钙盐提供。
对于1500卡路里的饮食，成年病人每天可以消费198g本发明的环酯。对于同样比例的2000卡路里的饮食，患者可以每天消费264g的酮。当摄入生酮的脂质饮食时，血酮升高到大约2 mM，该水平在某种程度上证明至少对60％的接受治疗的儿童有效。当摄入酮饮食时，酮水平应该更高，因为酮已经取代热量相等的脂肪，即为1.5 g酮/g脂肪。因此，血酮应该接近3 mM，一个对儿童有效的水平，但是仍低于禁食人所达到的7.5 mM水平。
使用直接升高酮体水平的化合物包括升高酮体本身的血液水平的本发明环状低聚物的益处有以下几点。第一，酮体本身的供应品不需要限制碳水化合物，因此增加了食品配方的可口性，特别是在普遍的高碳水化合物饮食文化中。第二，酮体可以被肌肉、心脏和脑组织代谢，但在不能肝脏中代谢。因此避免了生酮饮食可能产生的不必要脂肪肝的付作用。第三，在食物配方中包含碳水化合物的能力增加顺应的机会并开发了高胰岛素的Ⅱ型糖尿病的实用治疗途径，高胰岛素的Ⅱ型糖尿病使得已知的生酮饮食不可行。
本发明人确定，当需要酮体升高时，给予含有任意的乙酰乙酰基成分的优选量的环酯将足以升高血液的酮体水平至0.5到20 mM，优选2 mM到7.5mM水平及以上，特别是当试图阻止疾病如早老性痴呆症和帕金森氏综合征的脑细胞死亡时。尽管不能恢复死亡的脑细胞，但预料将可以阻止进一步恶化并且至少恢复一些功能。
在治疗神经退化性疾病如早老性痴呆症和帕金森氏综合征中使用的酮体总量最好能升高酮体的血液水平0.5 mM到20 mM。本发明人估量每个病人每天需要200到300 g(0.5磅)的酮体以便达到所述水平。该治疗方法通过保护细胞对抗神经毒素的作用，这可能达到一个水平，该水平足以作为一个重要的热量来源起作用，如在血中为2到7.5 mM。其依赖于如此产生的(R)-3-羟基丁酸盐的神经刺激因子的作用，给药量可以较低，例如提供0.2到4 mM增量，当然对于这种或其它疾病给药量可以更多。
最现实的是，对于神经退化性疾病如早老性痴呆症和帕金森氏综合征最有效的治疗是，一旦病人被鉴定具有发展为该疾病的一个因素就尽快给药。因此，对于早老性痴呆症最有效的治疗是针对选自下列组的一个或多个疾病的阳性实验结果进行(ⅰ)在21染色体上的淀粉样前体蛋白质基因突变，(ⅱ)在14染色体上的早老基因突变，(ⅲ)存在阿朴脂蛋白E的对碘氧基苯甲醚(isoforms)。其它显示早老性痴呆指征的试验当然是适用的。
按照阳性实验结果，用一种或几种方法在病人的血液或血浆中升高酮体(R)-3-羟基丁酸盐和/或乙酰乙酸化物的浓度总量至例如1.5mM和10 mM，优选2到8 mM之间，对阻止记忆丧失和/或其它神经机能障碍是适宜的。优选给患者摄入足够量的式(Ⅰ)化合物的饮食，任选胃肠外但更优选有利的肠内给药。
最现实的是，低血糖的大脑机能障碍也可以用本发明的治疗方法和组合物及化合物治疗。另外一个与本治疗方法有关的特性是将改善肌肉的功能。
许多相当廉价的或潜在廉价的原料的有效价值推进了基于环状低聚物的本发明的食品和药物的供应，所述原料来自于可以衍生的环状(R)-3-羟基丁酸酯(见Microbial Polyesters Yoshiharu Doi.ISBN 0-89573-746-9 Chapters 1.1.3.2和8)。能够插入产生食物的微生物的基因的可利用性为制造如酸乳酪和乳酪的产品提供了一种方法，该产品中富含(R)-3-羟基丁酸的环状低聚物，或随后由能够裂解该类具有单体物质本身的聚合物的酶使其分解(Doi.Chapter 8)。
制备聚(R)-3-羟基丁酸酯的方法并不特别要求权利保护，因为这些方法是本领域所熟悉的。例如，Shang等，(1994)Appli.Environ.Microbiol.60:1198-1205。所述聚合物可从Fluka Chemical Co.P1082,cat#1329,1993-94,980.Second St.Ronkonkoma NY 11779-7238,800358 5287市售获得。
参考以下图和实验实施例，仅通过说明的方式进一步描述本发明。借助这些实施例，本领域的技术人员将想起在本发明范围内的其它实施方案。1为显示用酸乳酪中的(R)-3-羟基丁酸的三交酯喂饲大鼠和单用酸乳酪喂饲的对照大鼠后所产生的血液(R)-3-羟基丁酸酯水平的图，(R)-3-羟基丁酸的三交酯为一种在实施例1中产生环状低聚物。
在实验的早晨将0.64g三交酯与5g Co-op商标的Black Cherry酸乳酪混合以分开的碗喂其中的9只大鼠。其余的3只给予5g不含三交酯的酸乳酪作为对照。将含有酸乳酪的碗放置在笼中并且记录鼠进食时间。三只对照鼠中的两只吃光所有的酸乳酪而六只三交酯酸乳酪组大鼠中的4只吃了提供量的约一半。其余的六只鼠睡眠。
在食入酸乳酪后60分钟和180分钟杀死对照鼠(n=2)，而在80、140、150和155分钟杀死喂三交酯的鼠。取血液样品分析(R)-3-羟基丁酸盐。冷冻大脑并且稍后用过氯酸提取，中和提取物并分析。用Anal.Biochem(1983)131,478-482页的NAD-/EDTA分析法测量(R)-3-羟基丁酸盐的血液水平。将由2-氨基-2-甲基-1-丙醇(100mM pH 9.9,0.094g/10ml)、NAD-(30mM,0.199g/10ml)和EDTA(4mM,0.015g10ml)组成的溶液取1.0ml加入到每个小杯和4μl样品或(R)-3-羟基丁酸盐对照组中。
两只对照鼠吃了5.2±0.1g的酸乳酪并且它们的血浆(R)-3-羟基丁酸盐浓度在60分钟和180分钟为约0.45mM。四只喂三交酯的鼠吃了0.39+0.03g的三交酯和2.6±0.2g的酸乳酪。它们的血浆(R)-3-羟基丁酸盐浓度在80分钟后为0.8 mM而这组处死的大鼠在约150分钟时为1.1 mM。所有的鼠显示摄食三交酯没有不利的结果。发现仅仅喂了0.4g的三交酯的大鼠的血清(R)-3-羟基丁酸盐升高到0.65mM。注意，当对鼠禁食时，(R)-3-羟基丁酸盐初始的水平从喂食状态的0.1mM升高到大约0.45mM。
受试鼠显示增加血浆(R)-3-羟基丁酸盐至少3小时，没有不利的结果。应该注意，其它两只鼠用‘Hob-Nob’饼干喂了约1.5g的三交酯，在两周后显示没有不利的结果。
应该注意，增加的(R)-3-羟基丁酸盐水平也将反映在此没有测量的乙酰乙酸水平，因为在体内两者之间迅速地建立平衡以至乙酰乙酸水平在(R)-3-羟基丁酸化物水平的40到100％之间。比较实施例3口服给予大鼠(R)-3-羟基丁酸酯的低聚物和乙酰乙酰基(R)-3-羟基丁酸酯低聚物按照如下方法研究口服给予(R)-3-羟基丁酸酯和比较实施例1及2的线性低聚物升高血液酮体水平的能力。使鼠禁食过夜，然后按照100μl/100g体重，将用甲基葡萄糖胺调节pH至7.4的4M(R)-3-羟基丁酸酯管饲大鼠，在30分钟后测量(R)-3-羟基丁酸盐的血浆水平为0.62mM，作为比较，当使用9M(R)-3-羟基丁酸酯时为3mM。
用2M的(R)-3-羟基丁酸酯低聚物和在比较实施例1和2中所述的它们的乙酰乙酰基酯的混合物溶液重复所述程序。用甲基葡萄糖胺调节(R)-3-羟基丁酸酯低聚物(19/1)和乙酰乙酰基酯(20/4)到pH 7.6并且用前述的分析方法监测血液的(R)-3-羟基丁酸盐水平。在管饲后60和120分钟，血清中(R)-3-羟基丁酸盐的增加显示在0.2mM到0.5mM之间。
量(g) 脂肪(g) 蛋白质(g) CHO(g) 环状物(Ⅰ)(g)早餐蛋 3244苹果汁 70 7酮 6666脱脂乳 9202 3早餐总量 46 10 66午餐瘦牛肉 121.75 3.5烹调的红萝卜45 0.6 3罐装梨 40 4酮 69.75 69.75脱脂乳 92 2 3午餐总量 1.75 6.1 10 69.75晚餐猪牛肉混合香肠 22.5 63烹调的花椰菜50 1 2西瓜75 5酮 62.25 62.25脱脂乳 92 2 3晚餐总量 66 10 62.25日总量11.7518.130 198实施例6(R)-3-羟基丁酸盐对海马细胞的作用方法培养基和化学药品使用含有Neurobasal培养基的无血清培养基(用B27补充物稀释50倍)0到4天(Life Technology,Gaitherburg,MD)，向其中加入0.5mML-谷氨酰胺、25uM L-谷氨酸钠、100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素。4天后，使用含有5uM胰岛素、30nM 1-甲状腺素、20uM黄体酮、30nM亚硒酸钠、100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素的DMEM/F12培养基。海马的微岛(microisland)培养在18天将原始的海马培养物从Wistar胚胎中移出并用一支滴管轻柔地搅动使其分散。按1,500 xg离心该悬浮液10分钟并弃去上清夜。将沉淀重新悬浮在新的培养基中使最后的细胞量为0.4-0.5×106细胞/ml。吸取10微升该悬浮液到聚L-赖氨酸覆盖的培养孔的中心并将培养板在38℃孵育4小时，然后加入400ul新鲜的Neurobasal培养基。孵育2天后用新鲜的培养基替换一半原培养基并继续孵育另外2天。4天后，用含有5uM胰岛素、30nM 1-甲状腺素、20uM黄体酮、30nM亚硒酸钠、100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素的DMEM/F12培养基替换原培养基。将培养孔分为4组一半培养孔接受终浓度为8nM的(R)-3-羟基丁酸盐，而一半孔接受5nM淀粉样蛋白β1-42(Sigma)。2天后(8天)更换这些培养基并在10天固定细胞，用MAP2(Boehringer Manheim,Indianapolis IN)染色以便使神经元显影以及用维蒙亭(vimentin)GFAP(Boehringer)以便使神经胶质的细胞显影。结果细胞计数向孵育物中加入(R)-3-羟基丁酸化物以使每个微岛的神经元细胞数量增加，每个微岛的细胞平均数从30增加到70。向培养物中加入5nM淀粉样蛋白β1-42使每个微岛的细胞数从70减到30个细胞，证实了以前Hoshi等的观察，即淀粉样蛋白β1-42对海马神经元是有毒的。向含有淀粉样蛋白β1-42的培养物中加入(R)-3-羟基丁酸盐使每个微岛的细胞平均数从30增加到70个细胞。根据这些数据我们得出结论，向培养基中加入底物水平量的(R)-3-羟基丁酸盐会减缓培养物中细胞死亡的速率。所述培养基的主要营养为葡萄糖、丙酮酸盐和L-谷氨酰胺。进一步断定(R)-3-羟基丁酸盐可以降低由于在培养物中加入淀粉样蛋白β1-42引起的海马细胞死亡增加的速率。
已观察到，无论β1-42是否存在，由于(R)-3-羟基丁酸盐的存在树突长出的数量和轴突的长度皆有增加。这是神经生长因子类似行为的指征。
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权利要求
1．式(Ⅰ)的(R)-3-羟基丁酸环酯或其与一个或多个阳离子的配合物或其盐用于医疗或营养 其中n为1或1以上的一个整数。
2．根据权利要求1的化合物，其中一个或多个的阳离子选自钠、钾、镁和钙或该化合物为游离的未配合的低交酯(oligolide)。
3．按照权利要求1或2的化合物，其中n为1到20的整数。
4．按照权利要求1的化合物，其中所述化合物为(R,R,R)-4,8,12-三甲基-1,5,9-三氧杀十二-2,6,10-三酮。
5．一种治疗细胞和/或增加细胞效率的方法，其特征在于该方法包括给予式(Ⅰ)的环状低聚物，所述细胞由于游离基、毒性剂如肽和蛋白质及对细胞代谢有害的遗传缺陷的作用、胰岛素抵抗或其它的葡萄糖代谢缺陷或包括缺陷引起的状态、局部缺血、头部损伤而机能不良。
6．权利要求4的方法，其特征在于式(Ⅰ)的环状低聚物作为一种神经元刺激剂起作用，如在体内或体外能够刺激神经细胞如海马或黑质细胞中轴突和/或树突的生长，特别是在神经退化具有严重临床后果的疾病中。
7．一种实现肠内或胃肠外营养的方法，优选口服途径营养，该方法包括以生理学上可接受的形式，任选用生理学上可接受的载体，给予式(Ⅰ)的环状低聚物。
8．一种在人或动物体内产生生理上可接受的酮病(ketosis)的方法，该方法包括口服给予式(Ⅰ)的环状低聚物。
9．权利要求8的方法，其中给予人或动物低于50％(重量)热量的作为脂肪的饮食。
10．权利要求8的方法，其中给予人或动物0-25％(重量)热量的作为脂肪的饮食。
11．按照权利要求7或8的方法，其中所述方法是在需要治疗以下一种或多种疾病的患者中进行早老性痴呆症、帕金森氏综合征、肌萎缩性侧索硬化、癫痫、游离基疾病、心力衰竭、Ⅱ型糖尿病、丙酮酸脱氢酶缺乏或阻塞、在一种或多种类型细胞中缺乏糖酵解的能力及杜兴氏肌萎缩。
12．一种替代碳水化合物提供热量替代物以降低血糖的方法，该方法包括给予需要这类替代品的人或动物受试者含有式(Ⅰ)环状低聚物的组合物。
13．一种替代碳水化合物提供热量替代物以降低体内脂量的方法，该方法包括给予需要这类替代品的人或动物受试者含有式(Ⅰ)环状低聚物的组合物。
14．一种在未患慢性或急性代谢疾病的人或动物中增加线粒体能量产生效率的方法，该方法包括给予人或动物一定量的式(Ⅰ)环状低聚物，该量足以使血液中的(R)-3-羟基丁酸盐的水平升高至0.5到20mM。
15．权利要求14的方法，其中所述水平升高到1至10mM。
16．式Ⅰ的环酯在生产药物时的用途，该药物用于治疗由游离基、毒性剂如肽和蛋白质、不利于细胞代谢的遗传缺陷、胰岛素抵抗或其它的葡萄糖代谢缺陷诱导的疾病状态或缺陷引起的疾病状态、局部缺血、头部创伤，或用于增强细胞功能。
17．一种组合物，其特征在于它含有生理上可接受的形式的式(Ⅰ)环状低聚物。
18．权利要求11的组合物，其特征在于该组合物包含生理学上可接受的载体。
全文摘要
提供含有酮体和/或它们的代谢前体的组合物，该组合物适宜给予人和动物，它具有以下特殊的性质(ⅰ)增加心脏功能，确切地说是葡萄糖利用的功能，(ⅱ)提供能源，特别是在糖尿病和胰岛素抵抗状态下，(ⅲ)治疗由于脑细胞损害引起的疾病，特别是延缓或防止在与记忆有关的区域的脑损伤如在早老性痴呆症和类似疾病中发现的一样。根据营养的目的摄取这些组合物，例如运动员或为了疾病的治疗，特别是那些与弱的心功能、胰岛素抵抗和神经元损害有关的疾病的治疗。本发明进一步提供治疗的方法并且提供包含在本发明组合物中的新的酯和聚合物。
文档编号A61P25/28GK1316902SQ99810837
公开日2001年10月10日 申请日期1999年9月15日 优先权日1998年9月15日
发明者R·L·韦克 申请人:英国技术集团国际有限公司