035] 1. 2人牛重配轮状病毒毒种来源于NIH(NationalInstitutesofHealth美国国 立卫生研宄院）
[0036] MVS-BRV-1:人-牛轮状病毒G1血清型
[0037] MVS-BRV-2:人-牛轮状病毒G2血清型
[0038] MVS-BRV-3 :人-牛轮状病毒G3血清型
[0039] MVS-BRV-4 :人-牛轮状病毒G4血清型
[0040] 1290XUK:人-牛轮状病毒G8血清型
[0041] MVS-BRV-10 :人-牛轮状病毒G9血清型
[0042] 1. 3轮状病毒工作代次疫苗株：轮状病毒工作代次各血清型疫苗株由武汉生物制 品研宄所有限责任公司制备生产（在NIH毒种的基础上扩增传代培养而得到）。
[0043] 1. 4 细胞工厂（cellfactory货号：173240)购自Corning公司
[0044] 1. 5细胞培养液VP-SFM、病毒培养液DMEM购自GIBC0公司
[0045] 实施例1.各血清型病毒原液的制备
[0046] 细胞传代：各血清型病毒的培养基质为Vero细胞，首先复苏Vero细胞工作种子， 37°C条件下培养3-5天后，按照一定比例进行传代扩增培养，培养容器分别为T25、175、 T175细胞培养瓶、10层细胞工厂、40层细胞工厂，在40层细胞工厂中培养3-5代后分别接 种Gl、G2、G3、G4、G8、G9血清型轮状病毒。
[0047] 病毒培养：细胞工厂内细胞汇合度达到90%以上后，即可进行病毒接种操作。 病毒接种前，选择一个细胞工厂进行细胞计数，根据计数结果，按照M0I(病毒感染复 数）0. 005-0. 2进行计算，得出需要的病毒量，并用胰蛋白酶对病毒激活。激活条件为37°C、 胰蛋白酶浓度10-20yg/ml，激活15min-60min。将激活的病毒接种于细胞工厂内，接种后 的各血清型病毒培养于35-37°C条件下2-5天。
[0048] 病毒收获：待细胞病变完全（细胞脱落达到75%以上）将各细胞工厂内的液体收 集于一容器内，进行下游处理。
[0049] 下游操作：首先进行细胞破碎处理，采用冻融或高压均质方式破碎细胞，冻融温度 为-30°C-37°C，高压均质压力范围为100-1000bar，高压均质处理完后，进行细胞碎片澄清 过滤操作，采用两级过滤，第一级为1. 〇ym+0. 5ym深层过滤器，第二级为0. 2ym除菌过滤 器。澄清过滤完成后，对病毒液进行超滤浓缩，采用300K孔径超滤膜，对处理后的病毒收获 液进行10倍浓缩，即得到单价血清型疫苗原液。
[0050] 实施例2.疫苗保护剂的研制
[0051] (1)病毒抗酸能力的确定
[0052] 通过实验确定六价轮状病毒疫苗所能耐受的最低pH值。
[0053] 将六价血清型病毒混合疫苗（六价疫苗原液等体积混合）与1 %枸橼酸钠溶液等 体积混合。
[0054] (2)准备7支一次性无菌50ml离心管，其中6支分别加入2ml步骤（1)中混合好 的六价苗，另1支加入lml六价混合苗和lmlDMEM做对照。
[0055] (3)调节pH，6 支离心管中分别加入 0? 1M盐酸 0ml、0. 4ml、0. 6ml、0. 7ml、0. 8ml、 1. 2ml，测得对应的pH为 7. 84、5. 02、4. 00、3. 50、3. 05、2. 00。
[0056] (4)将7支离心管置于37°C水浴箱内孵育2h。
[0057] (5)孵育时间结束后，每支离心管中立即加入DMEM至20ml。
[0058] (6)将上述试验样品分装至冻存管中，存放于-70°C冰箱内保存待检。
[0059](7)每个pH值对应的样品反复检测三次病毒滴度（FFA)，与对照组比较，滴度无明 显改变的组别对应的最低pH即为牛人重配轮状病毒减毒疫苗株所能耐受的最低pH。表1 为六种血清型三次滴度检测的结果。
[0060]表1.六种血清型三次滴度检测的结果（单位：lgFFU/ml)
[0061]
【主权项】
1. 一种口服六价重配轮状病毒活疫苗，其特征在于，所述疫苗含有六种主要流行株血 清型 G1、G2、G3、G4、G8&G9。
2. 根据权利要求1所述的口服六价重配轮状病毒活疫苗，其特征在于，所述的六价重 配口服轮状病毒疫苗成分为， (1) G1、G2、G3、G4、G8及G9血清型活疫苗，各血清型原液滴度为1?5X106FFU/ml ; (2) 保护剂：枸橼酸0? 5?2g/L、枸橼酸钠50?150g/L、蔗糖250?450g/L、氯化锌 5?10mM、氯化钙10?20mM。
3. 根据权利要求1或2任一所述的口服六价重配轮状病毒活疫苗，其特征在于， 所述的G1血清型活病毒NIH编号为：MVS-BRV-1 ; 所述的G2血清型活病毒NIH编号为：MVS-BRV-2 ; 所述的G3血清型活病毒NIH编号为：MVS-BRV-3 ; 所述的G4血清型活病毒NIH编号为：MVS-BRV-4 ; 所述的G8血清型活病毒NIH编号为：1290 X UK; 所述的G9血清型活病毒NIH编号为：MVS-BRV-10。
4. 权利要求1-3所述的口服六价重配轮状病毒活疫苗的制备方法，其特征在于，包括 如下步骤： (1) 制备各血清型单价病毒原液，并按照目标滴度配置各个血清型病毒原液，并将各原 液依次加入同一提前灭菌的容器中，充分混合并除菌，即得六价混合液； (2) 配制保护剂母液并除菌； (3) 将保护剂母液及步骤（1)配制的六价混合液混合，并将其按照2ml/瓶规格进行分 装，即得到成品。
5. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的除菌为0. 2 y m除菌过滤器过 滤除菌。
6. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的制备各血清型单价病毒原液 的步骤为： (1) 细胞传代：各血清型病毒的培养基质为Vero细胞，首先复苏Vero细胞工作种子， 37°C条件下培养3-5天后，按照一定比例进行传代扩增培养，培养容器依次分别为T25、 I75、T175细胞培养瓶、10层细胞工厂、40层细胞工厂，在40层细胞工厂中培养3-5代后即 可分别接种Gl、G2、G3、G4、G8、G9血清型轮状病毒； (2) 病毒培养：细胞工厂内细胞汇合度达到90%以上后，进行病毒接种操作。病毒接 种前，选择一个细胞工厂进行细胞计数，根据计数结果，按照病毒感染复数〇. 005?0. 2进 行计算，得出需要的病毒量；用胰蛋白酶对病毒激活，激活条件为37°C、胰蛋白酶浓度10? 20 y g/ml，激活15?60min ;将激活的病毒接种于细胞工厂内，接种后的各血清型病毒培养 于35?37°C条件下2?5天； (3) 病毒收获：待细胞病变完全（细胞脱落达到75%以上）将各细胞工厂内的液体收 集于一容器内，进行下游处理； (4) 下游操作：首先进行细胞破碎处理，采用冻融或高压均质方式破碎细胞，冻融温度 为-30°C?37°C，高压均质压力范围为100?lOOObar，高压均质处理完后，进行细胞碎片澄 清过滤操作，采用两级过滤，第一级为l.Oym?0. 5ym深层过滤器，第二级为0. 2 y m除菌 过滤器，澄清过滤完成后，对病毒液进行超滤浓缩，采用300K孔径超滤膜，对处理后的病毒 收获液进行10倍浓缩，即得到单价血清型疫苗原液。
7.权利要求1-4任一所述的口服六价重配轮状病毒活疫苗在制备口服轮状病毒疫苗 中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种口服六价重配轮状病毒活疫苗，含有六种主要流行株血清型G1、G2、G3、G4、G8及G9，涵盖了A群轮状病毒99.6％的G血清型病毒，预计对轮状病毒腹泻有很好的预防保护效果。本发明的目的旨在提供一种口服接种的、由六价轮状病毒血清型组成的活疫苗，用以预防因轮状病毒导致的婴幼儿腹泻，所述的六价重配口服轮状病毒疫苗成分为，(1)G1、G2、G3、G4、G8及G9血清型活疫苗，各血清型原液滴度为1～5×106FFU/ml；(2)保护剂：枸橼酸0.5～2g/L、枸橼酸钠50～150g/L、蔗糖250～450g/L、氯化锌5～10mm、氯化钙10～20mm。
【IPC分类】A61P1-12, A61P31-14, A61K39-15
【公开号】CN104524562
【申请号】CN201410742561
【发明人】杨晓明, 徐葛林, 李庆亮, 何泗涛, 白萱, 姜志军, 程满荣, 张久威, 马涛, 董犇, 胡蓉, 刘涛, 梁婧, 陈金华, 姜礼朋, 冯冬扬, 杨彪, 林楠, 段凯, 杨邦玲, 徐晓, 曾凯
【申请人】武汉生物制品研究所有限责任公司
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月8日