5A至5H:具有不同的蔗糖浓度的配制剂以及含有蔗糖和脯氨酸的配制剂的浊 度。
[0065]图6 :具有不同蔗糖浓度的冻干饼的图片。
[0066] 图7 :具有不同蔗糖浓度和蔗糖和脯氨酸的冻干饼的图。 实施例
[0067] 实施例1:制备样品
[0068] 为了制备用于后续实验的样品，将胆酸钠（NewZealandPharmaceuticals)溶于 缓冲剂（IOmMNaCl，ImMEDTA，IOmMTRIS，pH8. 0)，搅拌直至透明。将大豆磷脂酰胆碱（磷 脂GmbH)加至适当体积的胆酸盐，在室温下搅拌16小时。用IOmMNaCl将ApoA-I溶液稀 释至9.Omg/mL的蛋白质浓度（由0D280测定），与适当体积的脂质溶液混合，获得1:45至 1:65的蛋白质：脂质比率。在2-8°C搅拌混合物30分钟至16小时。HDL模拟物制备如下： 用1%蔗糖作为透析过滤缓冲剂进行胆酸盐透析。浓缩洗脱物至33至38g蛋白质/L的蛋 白质浓度。加入蔗糖，获得所希望的浓度（1%，2%，3%，4%，5%，6. 5%，7%，10%w/w)。用 0? 2MNaOH调节溶液pH至pH7. 50±0. 1，随后加入WFI(注射用水），获得30mg/mL的蛋白 质浓度。然后，通过〇. 2+0.Iym滤器无菌过滤最终配制剂，将其于I. 7g蛋白质每小瓶充入 IOOmL玻璃小瓶，冻干。
[0069] 在某些配制剂中，加入脯氨酸至所希望的浓度。脯氨酸维持等渗的配制剂。
[0070] 实施例2 :分子大小分布
[0071] 颗粒形成用HPLC-SEC确定，并用各种配制剂的分子大小分布进行评价。尺寸 排阻色谱法（HPLC-SEC)进行如下；在Superose6HR10/30柱（GEHealthcare)上，采用 140mmo1 /INaCl，10mmol/INa-磷酸盐，0? 02%NaN3,pH7. 4,流速 0? 5ml/min。添加约 90yg 蛋白质的样品，于280nm记录洗脱曲线。
[0072] 对于最终配制剂中含有5-10%w/w蔗糖的配制剂（图1)几乎没有观察到差异，这 指出含有彡5%w/w蔗糖的配制剂在重构之后不影响颗粒稳定性。图1显示（1)内标，2: 5%w/w蔗糖，3 :6. 5%w/w蔗糖，4 :7. 5%w/w蔗糖和5 :10%w/w蔗糖的完整色谱图。
[0073] 此外，7. 5%w/w鹿糖配制剂和4%w/w鹿糖配制剂的直接比较展示这些配制剂展 不相似的分子大小分布（图2A)。
[0074] 图2B和2C显示蔗糖浓度1，2, 3和4% (w/w)以及包含蔗糖和脯氨酸的配制剂的 结果。
[0075] 全部测试配制剂都是稳定的。4至7. 5%w/w的蔗糖含量最优且不影响重构之后 的颗粒稳定性。
[0076] 实施例3:LCAT活化
[0077] 在各种配制剂中，rHDL颗粒有效性的测量通过测量LCAT活性来确定。HDL颗粒能 够通过与ATP-结合盒转运蛋白Al(ABCAl)相互作用螯合来自沿动脉壁或细胞形成的斑块 的胆固醇。卵磷脂-胆固醇酰基转移酶（LCAT)是一种血浆酶，其将游离胆固醇转化为胆固 醇基酯（更疏水的胆固醇形式），然后螯合进入HDL颗粒核心，随后被运输至肝进行代谢。 如果最终配制剂中的蔗糖含量影响rHDL颗粒的效力，则LCAT活性会降低。
[0078] 卵磷脂-胆固醇酰基转移酶（LCAT)活性醋化如Stokke和Norum(ScandJClin LabInvest. 1971 ;27 (I) :21-7)的描述来测试。在 20yI[4-14C]胆固醇（7. 5yCi/ml)存 在下，将150y1汇集的人血浆（CSLBehring)与10yIrHDL样品和150yIPBS于4°C温 育1.5小时。为了引发胆固醇的酯化，在37°C将反应混合物的一半放置30分钟而将另一半 于4°C进一步温育30分钟（以测定背景噪音）。对于两份样品，胆固醇和胆固醇基酯均通 过液液萃取用正己烧萃取。用固相萃取柱（SampliQAmino，Agilent)将胆固醇基醋与未醋 化的胆固醇分离，通过闪烁计数测量。将在4°C储存的样品的计数率从在37°C储存样品的 计数率扣除。相同程序也对参比样品进行。LCAT活性表示为参比样品的％。
[0079] 图3A和3B显示4-10%w/w鹿糖配制剂的LCAT活性。图3C显示1-4%w/w鹿糖 配制剂的LCAT活性。在最终配制剂中蔗糖范围是5-10%w/w的情况下观察到LCAT活性几 乎没有差异（图3A)，然而在蔗糖进一步降低至4%w/w的情况下则显现轻度降低趋势（图 3B)。图3D显示包含蔗糖和脯氨酸的配制剂的LCAT活性。对于含有蔗糖和脯氨酸的配制 剂观察到LCAT活性没有明显趋势。从而，蔗糖/脯氨酸配制剂中HDL颗粒效力得以保持。
[0080] 实施例4 :胆固醇流出
[0081] 反向胆固醇运输（RCT)是蓄积的胆固醇从容器壁运输至肝进行分泌的途径。细胞 流出经由ABCAl途径将胆固醇游离至低脂质的ApoA-I。胆固醇流出测试测量HDL接受从 细胞释放的胆固醇的能力。预计如果蔗糖含量影响颗粒形成和/或完整性，则其差异会影 响胆固醇流出。
[0082] 来自鼠类巨噬细胞细胞系J774和RAW264. 7的胆固醇流出高度响应cAMP刺激， 其导致ABCAl上调（Bortnick等人，?JBiolChem. 2000 ;275 (37) :28634-40)。RAW264. 7 细胞得自AmericanTypeCultureCollection(ATCC)。在加湿的（1)2温育器中，于 37° 在DMEM(Dulbecco'smodifiedEagle'smedium，Gibco)中培养细胞，所述培养基补充有 10 % (v/v)胎牛血清（FCS，Gibco)，2mM谷氨酰胺，100单元/mL青霉素和100yg/mL链霉 素。对于流出实验，将细胞于〇.35xIO6细胞每孔的密度接种入24-孔板。第二天，在补充 5% (v/v)FCS的DMEM中，将细胞用[1，2-?]胆固醇（IyCi/mL，GE)标记。在36小时的标 记时间段之后，将细胞用磷酸缓冲的盐水（PBS)洗涤，然后，于不存在或存在0.3mM8-溴腺 苷3 '，5 ' -环状一磷酸钠盐-cAMP(8Br-cAMP)的情况下，在含有0. 2 %无脂肪酸的牛血清白 蛋白（BSA)DMEM中温育16小时以上调ABCAl。用PBS洗涤两次之后，将细胞与不同的胆固 醇受体在DMEM/0. 2%无脂肪酸BSA培养基中温育。在温育5-6小时之后，于500g将板离 心10分钟以除去任何飘浮的细胞和细胞碎肩。细胞上清液中的放射性通过液体闪烁计数 来测量。在对照孔中用0.IMTritonX-100萃取细胞至少30分钟之后，确定总细胞结合的 [%]胆固醇。胆固醇流出表示为从细胞释放入培养基的放射性相对细胞和培养基中的总和 放射性的百分比。在对照与8Br-cAMP-刺激的细胞之间的流出差异用作ABCAl-依赖性流 出的度量。
[0083] 图4A和4B显示随鹿糖浓度从7. 5%w/w降低至4%w/w，胆固醇流出增加。在含 脯氨酸的配制剂与7. 5%蔗糖配制剂之间未观察到胆固醇流出的明显差异（图4C)。
[0084] 实施例5:池度
[0085] 术语浊度用来描述溶液中的浑浊或混浊。严格来说，浊度产生自可见光被溶液中 的元素分散的多个事件。由于浊度产生自净分散的光，其取决于样品的路径长度，蛋白质浓 度和蛋白质/聚集体/颗粒的尺寸。如果重构后全部降低蔗糖的配制剂含有相同的蛋白质 浓度，并用相同的路径长度测量，则浊度差异能够是由各种蔗糖配制剂中的蛋白质/聚集 体/颗粒的尺寸和/或数量差异所导致。
[0086] 池度用LED池度计（Hach2100ANTurbiditimeter，Loveland，CO.)测量，用 formacin作内标。结果表示为相对光散射（NTU)。
[0087] 含有4-10%w/w蔗糖的配制剂重构后产生相似浑浊的溶液（图5A&5B)。小于4% 的蔗糖浓度则显示增加的浊度（图5E和5G)。基于浊度，4% (w/w)及以上的蔗糖浓度是最 优的。
[0088] 贮藏（储存）后溶液浊度的相对增加常常在蛋白质生物药学中视为团聚的指示。 图5C、5D、5F和5H显示以液体形式贮藏（储存）后几乎未观察到至未观察到浊度增加，由 此指出颗粒的稳定性。
[0089] 实施例6 :冻干饼外观
[0090] 具有4%w/w和7. 5%w/w鹿糖的鹿糖配制剂产生最稳定的冻干饼（图6)。
[0091] 具有1至4%w/w蔗糖的蔗糖配制剂和含有蔗糖和脯氨酸的配制剂也产生稳定的 冻干饼（图7)。
[0092] 实施例7 :rHDL配制剂的稳定性
[0093] 在40°C贮藏（储存）（避光）12周之前和之后检查冻干的rHDL配制