30] 本发明的药物组合物，以细胞自噬抑制剂和精氨酸酶为活性成份，包含有效量的 细胞自噬抑制剂和精氨酸酶，以及药学上可接受的载体。
[0031] 所述"药学上可接受的"的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应（如 毒性、刺激和变态反应）的，即有合理的效益/风险比的物质。
[0032] 所述"有效量"是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所 接受的量。
[0033] 所述"药学上可接受的载体"指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释 剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的 毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington' s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub. Co.，N. J. 1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。在 药物组合物中，药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体 中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、PH缓冲物质等。
[0034] 任何适用的给药途径都是可以的，包括但不限于：口服、静脉内注射、皮下注射、肌 肉给予、局部给予、植入、缓释给予、心脏内给予等；优选的，所述给药方式是非肠道给予的。
[0035] 本发明的药物组合物和药学上可接受的载体可以制备以下制剂形式：固体、溶液、 分散剂、胶束、乳剂、脂质体、纳米微球等。
[0036] 本发明的第三方面，提供了细胞自噬抑制剂在制备用于提高肿瘤放疗药物或肿瘤 化疗药物的敏感性的药物中的应用。
[0037] 所述的肿瘤放疗药物或肿瘤化疗药物，包括但不限于精氨酸酶等。
[0038] 所述的提高肿瘤放疗药物或肿瘤化疗药物的敏感性的药物，即肿瘤放疗药物或肿 瘤化疗药物的增效剂。
[0039] 所述的肿瘤，为头颈部肿瘤，包括喉癌、下咽癌和鼻咽癌等。
[0040] 有益效果
[0041] 本发明提供了一种新的肿瘤治疗手段，即使用一种或者多种自噬抑制剂与精氨酸 酶制成复方药物、组合物联合给药或是序贯使用，从而增强精氨酸酶对头颈部肿瘤的杀伤 作用，增强精氨酸酶的疗效。
【附图说明】
[0042] 图1为人重组精氨酸酶能诱导喉癌Tu212发生细胞自噬，其中A为透射电镜下观 察自体的形成，B为采用Confocal检测焚光斑点（自相关蛋白）的形成，C为自相关 蛋白的检测。
[0043] 图2为人重组精氨酸酶能诱导喉癌Tu212细胞产生自噬流，其中A为检测随着人 重组精氨酸酶浓度的增加以及单独或者联合巴法罗霉素 Al对喉癌Tu212细胞中自噬相关 蛋白的变化情况，B为采用Confocal检测随着人重组精氨酸酶作用时间的增加喉癌Tu212 细胞中荧光斑点（自噬相关蛋白）的形成。
[0044] 图3为人重组精氨酸酶能抑制喉癌Tu212和下咽癌FaDu细胞的增殖，其中A为人 重组精氨酸酶对下咽癌FaDu细胞的增殖的影响，B为人重组精氨酸酶对喉癌Tu212细胞的 增殖的影响。
[0045] 图4为人重组精氨酸酶引起Tu212细胞内相关信号通路的变化，其中A为检测喉 癌Tu212细胞中PI3K/Akt/mTOR信号通路的变化，B为检测喉癌Tu212细胞中ERK1/2信号 通路的变化。
[0046] 图5为联合自噬抑制剂能增强人重组精氨酸酶对喉癌Tu212细胞增殖的抑制， 其中A、B为检测人重组精氨酸酶联合自噬抑制剂氯喹（CQ)和巴法洛霉素 Al作用下喉癌 Tu212细胞中自噬相关蛋白的变化情况，C、D为检测人重组精氨酸酶联合自噬抑制剂氯喹 (CQ)和巴法洛霉素 Al作用对喉癌Tu212细胞增殖的作用。
【具体实施方式】
[0047] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。
[0048] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人， 分子克隆：实验室指南（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述 的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除 非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此 外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实 施方法与材料仅作示范之用。
[0049] 实施例1 :人重组精氨酸酶的制备。
[0050] 采用PCR的方法获得了编码人精氨酸酶的编码序列（NM_000045. 3)。该基因编码 序列全长969bp，带有酶切位点XhoI和EcoRI。用XhoI和EcoRI内切酶分别双酶切PCR产物 和空质粒载体，将目的基因与载体连接后转化氨苄抗性平板，挑取若干个阳性转化子，取其 中一个扩增并提取质粒，进行Xh 0I和EcoRI内切酶双酶切鉴定。提取重组质粒，将重组载 体用Bgl II酶切使线性化，电击转化毕赤酵母。挑取阳性转化子。通过RDB、MM和MD平板筛 选，得到表型为his+muts的克隆子，进一步在摇床水平上进行诱导表达，通过SDS-PAGE蛋 白电泳检测摇床水平上精氨酸酶的表达情况，从而筛选分泌表达精氨酸酶的重组子。从若 干株带有精氨酸酶基因的重组酵母中筛选到分泌表达精氨酸酶的重组子。样品纯化中，将 酵母离心后取上清。样品经过超滤浓缩，采用凝胶排阻层析进行精制。我们选用Sephacryl S-200作为样品的精制层析柱。
[0051] 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)和HPLC进行纯度检测，结果显示，本发明提 供的重组精氨酸酶纯度约为95%。获得的人重组精氨酸酶保存于4摄氏度冰箱。
[0052] 以下实施例所使用的人重组精氨酸酶，也可购自拜奥生物科技（上海）有限公司。
[0053] 试验临用前用细胞培养基稀释至使用浓度。
[0054] 实施例2 :自噬抑制剂药物的配方
[0055] 氯喹（CQ)，购自sigma公司；
[0056] 氯化按（NH4Cl)，购自sigma公司；
[0057] 羟基氯喹，购自sigma公司；
[0058] 3-甲基腺嗓呤（3-MA)，购自sigma公司；
[0059] PI3K 抑制剂 LY294002,购自 Cell Signaling Technology 公司；
[0060] 巴伐洛霉素 Al (Bafilomycin Al)，购自 sigma 公司；
[0061] (1)氯喹的配制：取适量氯喹溶于纯水配成lOmmol/L的储存液，用0. 1 μπι的滤 器过滤除菌后保存于4°C，体外实验用PRMI-1640培养基（赛默飞世尔科技公司）稀释 500-1000倍用于抑制细胞自噬。
[0062] (2)氯化铵的配制：取适量氯化铵溶于水配成0. 4mol/L的储存液，用0. 1 μ m的滤 器过滤除菌后保存于4°C。体外实验时稀释50-80倍用于抑制细胞自噬。
[0063] (3)羟基氯喹的配制：取适量羟基氯喹溶于纯水配成lOmmol/L的储存液，用 〇. 1 μπι的滤器过滤除菌后保存于4°C，体外实验室稀释500-1000倍用于抑制细胞自噬。
[0064] ⑷3-甲基腺嘌呤（3-MA)的配制：取适量3-MA干粉配制成0· 2mol/L的储存液，用 〇. 1 μπι的滤器过滤除菌后保存于-20°c。体外实验时稀释50-200倍用于抑制细胞自噬。
[0065] (5) LY294002的配制：取适量LY294002干粉配制成0· 2mol/L的储存液，用0· 1 μ m 的滤器过滤除菌后保存于_20°C。体外实验时稀释50-100倍用于抑制细胞自噬。
[0066] (6)巴伐洛霉素 Al的配制：取适量巴伐洛霉素 Al干粉配制成0. 5 μ g/ml的储存 液，用〇. 1 μ m的滤器过滤除菌后保存于_20°C，体外实验时稀释1000倍用于抑制细胞自噬。
[0067] (7)以上自噬抑制剂与精氨酸酶联合应用于体内或体外抗肿瘤时，自噬抑制剂 3-MA的使用浓度范围为Ο-lmol/L，自噬抑制剂CQ的使用浓度范围为0-50mol/L，羟基氯喹 的使用浓度范围为0-50mol/L，LY294002的使用浓度范围为Ο-lmol/L，巴伐洛霉素 Al的使 用浓度范围为0-10m〇l/L，精氨酸酶的使用浓度范围为0-100IU/ml。
[0068] 实施例3 :人重组精氨酸酶能诱导喉癌Tu212发生细胞自噬
[0069] 喉癌Tu212细胞（购自湖南湘雅医学院中心实验室细胞资源中心）用0· 12U/ml 的精氨酸酶处理24h后，进行石蜡包