埋、切片、染色，在透射电子显微镜下观察细胞亚显微 结构，结果如图IA所示，给药组细胞内有大量的电子致密夹杂物，放大后可以清楚地看到 典型的双层膜结构自噬体，而对照组则未发现。
[0070] 喉癌Tu212细胞用0· 12U/ml的精氨酸酶处理24h和48h后，用CytO- ID? Autophagy Detection Kit自噬体染色试剂盒（ΕΝΖ0生命科学研宄院）按说明书处理，随后 在激光共聚焦显微镜下观绿色荧光斑点，结果如图IB显示，给药组细胞内有大量的荧光斑 点，经过48h处理的给药组荧光更强，而对照组较少。雷帕霉素作为阳性对照组。
[0071] 将收集到的喉癌Tu212细胞用PBS洗2次，用RIPA试剂盒裂解细胞，并定量后按照 每个泳道20 μ g进行蛋白电泳后转膜至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭lh，分别加入LC3B 和tubulin抗体，于4°C孵育12h。TBST洗膜后加入二抗室温孵育I. 5h，用ECL显色液显色。 Tu212细胞经过0. 12U/ml的精氨酸酶处理24h后，通过Western Blot的检测，结果如图IC 所示，与对照组相比，给予精氨酸酶组的Tu212细胞的LC3 II的表达水平增强。
[0072] 实施例4 :人重组精氨酸酶能诱导喉癌Tu212细胞产生自噬流
[0073] 喉癌Tu212细胞用不同浓度（分别是0、0. 015、0. 03、0. 06、0. 12U/ml)的精氨酸酶 处理20h，然后单独或联合巴法洛霉素 Al作用4h，分别收集各实验组的Tu212细胞用RIPA 裂解液裂解抽取细胞总蛋白，定量后按每孔20 μ g蛋白量上样进行蛋白电泳并转膜进行 Western blot，用ECL化学发光试剂盒进行化学发光。如图2A所示，联合巴法洛霉素 Al和 精氨酸酶实验组的Tu212细胞LC3 II的表达水平增强，并且呈现一定的剂量依赖性。
[0074] 喉癌Tu212细胞用0. 12U/ml的精氨酸酶分别处理他，611，1211，2411和4811后，用 Cyto-ID? 和 Lyso-Tracker? Autophagy Detection Kit 自体染色试剂盒按说明书处 理，随后在激光共聚焦显微镜下观绿色和红色荧光斑点，结果如图2B显示，随着时间的增 加给药组细胞绿色荧光先不断增强，达到一个峰值，然后逐渐减弱；红色荧光随着时间的增 加逐渐增强。绿色焚光表不自体的产生，代表自的启动；红色焚光代表自体和溶酶体 结合。绿色荧光和红色荧光的变化显示了自噬的一个过程：自噬体的产生，然后自噬体与溶 酶体结合，最后自噬体被溶酶体降解。
[0075] 实施例5 :人重组精氨酸酶能抑制喉癌Tu212和下咽癌FaDu细胞的增殖
[0076] 将适当浓度的喉癌Tu212和下咽癌FaDu细胞（购自中国科学院上海生命科学研 宄所细胞库）种在96孔培养板内，加入不同浓度的精氨酸酶，体系终体积为100 μ L，培养 48h，向每孔加入10 μ MTT液，在培养箱内放置4h，之后用含DMSO溶解，570nm下测量光密度 值（〇· D.) 〇
[0077] 结果如图3A、3B显示，精氨酸酶处理24h显著地抑制了细胞的增殖。
[0078] 实施例6 :人重组精氨酸酶引起Tu212细胞内相关信号通路的变化
[0079] 用RIPA裂解液裂解抽取细胞总蛋白，定量后按每孔20 μ g蛋白量上样进行蛋白电 泳并转膜进行Western blot，用ECL化学发光试剂盒（Millipore公司）进行化学发光。
[0080] 结果如图4A和4B所示：经过人重组精氨酸酶处理的Tu212细胞的LC3 II的表达 量高于对照组，并且呈现一定的剂量依赖性和时间依赖性。
[0081] PI3K/Akt/mT0R信号通路是真核细胞内一条重要的调节自噬的信号通路，它们在 正常情况下以磷酸化形式存在。
[0082] 结果显示，随着精氨酸酶浓度的增加，磷酸化的mTOR在不断降解，它的上游产物 磷酸化的Akt和其下游产物磷酸化的4E-BP1和磷酸化的p70S6K也在不断降解。ERK1/2信 号通路是调节细胞存活的重要的信号通路。结果显示，随着给药时间的增加，ERK1/2在不断 降解，磷酸化的ERK1/2在不断增加。以上结果显示PI3K/Akt/mT0R信号通路和ERK1/2信 号通路参与调节人重组精氨酸酶诱导Tu212细胞产生的自噬。
[0083] 实施例7 :联合自噬抑制剂能增强人重组精氨酸酶对喉癌Tu212细胞增殖的抑制
[0084] 为了研宄自噬在精氨酸酶作用喉癌Tu212细胞中的作用，我们选择两种自噬抑制 剂氯喹（CQ)和巴法洛霉素 Al。
[0085] 喉癌Tu212细胞经过0. 12U/ml的精氨酸酶联合或者单独与5 μ mol/L的氯喹和 2. 5nM/L的巴法洛霉素 Al作用48h，收集各实验组的Tu212细胞用RIPA裂解液裂解抽取细 胞总蛋白，定量后按每孔20 μ g蛋白量上样进行蛋白电泳并转膜进行Western blot，用ECL 化学发光试剂盒进行化学发光。结果如图5A和5B所示，精氨酸酶联合巴法洛霉素 Al或者 氯喹实验组的Tu212细胞LC3 II的表达水平明显增强。
[0086] 喉癌Tu212细胞经过0. 12U/ml的精氨酸酶联合或者单独与5 μ mol/L的氯喹和 2. 5nM/L的巴法洛霉素 Al作用48h，向每孔加入10 μ MTT液，在培养箱内放置4h，之后用含 DMSO溶解，570nm下测量光密度值（0. D.)。结果如图5C和所示，联合自噬抑制剂氯喹和 巴法洛霉素 Al能增强精氨酸酶对喉癌Tu212细胞增殖的抑制。
[0087] 以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述 实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的 变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
【主权项】
1. 精氨酸酶在制备治疗头颈部肿瘤药物中的应用。
2. 根据权利要求1所述的精氨酸酶在制备治疗头颈部肿瘤药物中的应用，其特征在 于，所述的精氨酸酶，为鼠源精氨酸酶、人重组精氨酸酶，以及各种长效化修饰的精氨酸酶。
3. -种联合制剂、药物组合物或药盒，其包含细胞自噬抑制剂和精氨酸酶。
4. 根据权利要求3所述的联合制剂、药物组合物或药盒，其特征在于，所述的精氨酸 酶，为鼠源精氨酸酶、人重组精氨酸酶，以及各种长效化修饰的精氨酸酶。
5. 根据权利要求3所述的联合制剂、药物组合物或药盒，其特征在于，所述的细胞自噬 抑制剂，选自以下任一或两者以上的组合：3_甲基腺嘌呤、渥曼青霉素、LY294002、放线菌 酮、巴法洛霉素Al、NH4Cl、氯喹、羟基氯喹。
6. 如权利要求3至5任一所述的联合制剂、药物组合物或药盒在制备治疗头颈部肿瘤 药物中的应用。
7. 根据权利要求6所述的联合制剂、药物组合物或药盒在制备治疗头颈部肿瘤药物中 的应用，其特征在于，所述的头颈部肿瘤为喉癌、下咽癌或鼻咽癌。
8. 细胞自噬抑制剂和精氨酸酶在制备治疗头颈部肿瘤药物中的应用，其特征在于，所 述的药物为细胞自噬抑制剂和精氨酸酶组成的联合制剂、细胞自噬抑制剂和精氨酸酶组成 的药物组合物、细胞自噬抑制剂和精氨酸酶组成的药盒、细胞自噬抑制剂和精氨酸酶的联 用或序贯。
9. 细胞自噬抑制剂在制备用于提高肿瘤放疗药物或肿瘤化疗药物的敏感性的药物中 的应用。
10. 根据权利要求9所述的细胞自噬抑制剂在制备用于提高肿瘤放疗药物或肿瘤化疗 药物的敏感性的药物中的应用，其特征在于，所述的肿瘤放疗药物或肿瘤化疗药物为精氨 酸酶；所述的细胞自噬抑制剂选自以下任一：氯喹、巴法洛霉素Al和NH4Cl。
【专利摘要】本发明涉及生物医药技术领域，本发明经研究发现，精氨酸酶能显著诱导头颈部肿瘤细胞发生细胞自噬，而细胞自噬则会部分抵消精氨酸酶的抗肿瘤效果；通过使用细胞自噬抑制剂抑制细胞自噬能增加头颈部肿瘤细胞对精氨酸酶的敏感性，从而增强精氨酸酶对头颈部肿瘤细胞的疗效。本发明提供了一种用于头颈部肿瘤联合治疗的制剂，具体为包含细胞自噬抑制剂和精氨酸酶的药物组合物，本发明还提供了该药物组合物在制备治疗头颈部肿瘤特别是喉癌、下咽癌和鼻咽癌的药物中的应用。
【IPC分类】A61P35-00, A61K45-00, A61K45-06, A61K38-50
【公开号】CN104815322
【申请号】CN201510161988
【发明人】林辰, 鞠佃文, 赵舒薇, 李力
【申请人】中国人民解放军第二军医大学
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2015年4月8日