一种树突状细胞肿瘤疫苗及其制备方法
【技术领域】
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[0001]本发明属于生物制剂领域，特别涉及一种负载肿瘤抗原致敏树突状细胞而获得的树突状细胞肿瘤疫苗及其制备方法。
【背景技术】
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[0002]树突状细胞(DC)是存在于外周血、皮肤、淋巴器官和胸腺中的抗原提呈细胞(APC)，是人体内功能最强的APC，除了具有强大的抗原提呈能力外，在树突状细胞表面上表达的I类和II类分子的抗原肽，能分别激活CD4+和CD8 +T细胞，并通过这种激活DC诱导针对特定抗原的体内免疫应答，所述抗原是例如肿瘤相关抗原、病原微生物抗原以及移植物抗原等。
[0003]树突状细胞肿瘤疫苗(DC肿瘤疫苗)是一类携带肿瘤抗原信息的功能性树突状细胞，能有效激活特异性T细胞产生免疫应答，产生抗肿瘤效应及免疫记忆功能。DC肿瘤疫苗的优势是能通过特异性肿瘤抗原诱导DC细胞成熟，并通过DC将肿瘤抗原信息传递给T细胞，使T细胞重新认识并杀伤肿瘤细胞。采用不同形式的肿瘤抗原体外冲击致敏DC后可以产生较强的抗肿瘤免疫，抑制肿瘤的生长和转移，并能在患者体内诱发免疫记忆，使患者体内获得长期的抗肿瘤效应从而有效防止肿瘤的复发。
[0004]现有的树突状细胞体外负载的抗原主要是已知的肿瘤特异性抗原，即肿瘤细胞株裂解物。由于许多肿瘤的特异性抗原尚未明确且易发生抗原位点变异，另外肿瘤细胞株在体外传代过程中表面抗原可能发生改变，DC细胞不能将该肿瘤的所有抗原有效呈递给效应T细胞，从而限制了效应T细胞在体内的抗肿瘤效应。
[0005]传统的胸、腹水肿瘤细胞的提取方法有多种，其中采用密度梯度离心法和贴壁培养法操作较为简单、经济，但由于腹水中含有较多红细胞、肿瘤浸润淋巴细胞等，使制备成的细胞悬液不利于肿瘤细胞的分离；而贴壁培养法是根据肿瘤细胞易贴壁而淋巴细胞不易贴壁的原理，将经淋巴细胞分离液分离得到的淋巴细胞与肿瘤细胞混合培养并根据贴壁特性进行分离获得，由于细胞需要在体外传代培养，其表面抗原可能发生变化；采用免疫磁珠法较为先进，但需要特异性肿瘤细胞抗体，价格较昂贵，成本较高，不利于规模化生产。
【发明内容】
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[0006]本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种具有高效肿瘤细胞致敏的DC肿瘤疫苗及其制备方法，特别是采用胸、腹水肿瘤细胞致敏的DC肿瘤疫苗及其制备方法。
[0007]本发明是通过下面的技术方案实现上述发明目的的。
[0008]一方面，本方法采用胸、腹水肿瘤细胞抗原，与肿瘤特异性抗原相比，该胸、腹水中了细胞抗原中抗原肽丰富，有效避免了肿瘤细胞可能对特异性单一抗原的抵抗作用；与肿瘤细胞株抗原相比，由于胸、腹水肿瘤细胞是原代细胞而避免了肿瘤细胞株在体外传代过程中可能产生表面抗原结构的变异，此外采用患者胸、腹水中特异性肿瘤细胞裂解液作为肿瘤抗原，效应T细胞的杀伤活性更强；且原料中不添加额外的化学药物，安全性更高。
[0009]另一方面，本发明在胸、腹水肿瘤抗原制备过程中，使用蛋白酶抑制剂避免了在体外裂解胸、腹水肿瘤细胞过程中胸、腹水肿瘤细胞内的蛋白酶释放到胞外降解胸、腹水肿瘤细胞抗原蛋白，最大程度上保持了胸、腹水肿瘤细胞抗原的完整性，对肿瘤细胞抗原起到很好的保护作用，进而可以通过负载DC细胞制备具有高效杀瘤活性的胸、腹水肿瘤细胞致敏的DC肿瘤疫苗。
[0010]第三方面，使用细胞因子刺激增加成熟的树突状细胞数目，对治疗效果的提高起着关键作用，优选使用rhTNF-α，巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和/或白细胞介素，有效增强树突状细胞扩增倍数，成熟DC细胞的成熟度> 86 %，解决了现有DC细胞制备过程中细胞数量少、增殖缓慢等问题。
[0011]相对于原有DC培养技术用血量多，扩增倍数少、扩增效率不高等情况，本发明提供的这种新的肿瘤树突状细胞治疗性疫苗的制备方法用于肿瘤的治疗及预防，具有用血量少、制备方法工序简便、细胞增殖数量多、特异性杀伤活性强、疗效好等特点。由于DC在人外周血中比例较低，因此提高扩增倍数，增加成熟的树突状细胞数目，对治疗效果的提高起着关键作用。
[0012]本发明提供了一种DC肿瘤疫苗，其特征在于所述疫苗为肿瘤治疗性疫苗。所述的DC肿瘤疫苗，其特征在于所述肿瘤包括:胃癌、结直肠癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌或食管癌等。
[0013]本发明采用的DC细胞，可通过外周血直接采取获得，可通过外周血单个核细胞分离获得，可通过骨髓或其他组织来源的间充质干细胞定向分化获得，还可通过HLA基因半相合或全相合同种异体外周血、外周血单个核细胞、骨髓造血细胞或其他组织来源的间充质干细胞分离或定向分化获得。
[0014]本发明还提供了一种肿瘤细胞致敏DC肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于:用含抑肽酶和亮抑蛋白酶肽的RPM1-1640重悬胸、腹水离心过滤后的单细胞悬液；将贴壁培养的DC细胞加入上述肿瘤相关全抗原单细胞悬液，加入rhTNF- a ,GM-CSF和/或IL，继续培养，得到肿瘤细胞致敏DC肿瘤疫苗。
[0015]在本发明的实施方案中，肿瘤细胞致敏DC肿瘤疫苗的制备方法特征在于包括以下步骤:
[0016]1.抗原的制备:包括如下步骤:
[0017](I)取胸、腹水离心，用生理盐水洗涤，经过滤后收取单细胞悬液；
[0018](2)用含抑肽酶(Aprotinin)和亮抑蛋白酶肽(Leupeptin)的RPM1-1640重悬步骤⑴得到的细胞；
[0019]2.DC疫苗的制备:将贴壁培养的DC细胞加入上述步骤(2)获得的肿瘤相关全抗原细胞，加入rhTNF- a、GM-CSF和/或IL，继续培养，得到肿瘤细胞致敏DC肿瘤疫苗。在优选的实施方案中，用rhTNF-α刺激加入肿瘤相关全抗原的贴壁培养的DC细胞。在另一个优选的实施方案中，用GM-CSF，IL-2和IL-4刺激加入肿瘤相关全抗原的贴壁培养的DC细胞。
[0020]优选地，所述抑肽酶终浓度为0.05-2.0mg/ml，亮抑蛋白酶肽终浓度为0.05-2.0mg/ml。所述 rhTNF- α 浓度为 50_2000U/ml，GM-CSF 浓度为 500U/ml-2000U/ml，IL 是 IL-2 和 / 或 IL-4，浓度为 50U/ml-2000U/ml。
[0021]在优选的实施方案中，用浓度为50_2000U/ml的rhTNF-α刺激加入肿瘤相关全抗原的贴壁培养的DC细胞。在另一个优选的实施方案中，用浓度为500U/ml-2000U/ml的GM-CSF，浓度为 50U/ml-2000U/ml 的 IL-2 和浓度为 500U/ml-2000U/ml 的 IL-4 刺激加入肿瘤相关全抗原的贴壁培养的DC细胞。
[0022]在本发明的优选实施方案中，肿瘤细胞致敏DC肿瘤疫苗的制备方法特征在于包括以下步骤:
[0023]1.抗原的制备:包括如下步骤:
[0024](I)取胸、腹水离心，用生理盐水洗涤，经过滤后收取单细胞悬液；
[0025](2)用含终浓度为0.05-2.0mg/ml的抑肽酶，终浓度为0.05-2.0mg/ml亮抑蛋白酶肽的RPM1-1640重悬步骤(I)得到的细胞；
[0026](3)将步骤(2)的细胞速冻后置于水浴中，待混合液完全溶化后，再次抗原制备，反复3-5次；
[0027](4)将步骤(3)的细胞经60-Gy辐照后，将肿瘤细胞裂解物离心，收取上清；
[0028](5)将步骤(4)获得的肿瘤细胞冻溶上清液过滤除菌；
[0029]2.DC疫苗的制备:将贴壁培养的DC细胞加入肿瘤相关全抗原，加入rhTNF-α、GM-CSF和/或IL，其中所述rhTNF- α浓度优选为50_2000U/ml，GM-CSF浓度优选为500U/ml-2000U/ml，IL优选是IL-2和/或IL-4，浓度优选为50U/ml-2000U/ml，继续培养，得到肿瘤细胞致敏DC肿瘤疫苗。在优选的实施方案中，用浓度为50-2000U/ml的rhTNF-α刺激加入肿瘤相关全抗原的贴壁培养的DC细胞。在另一个优选的实施方案中，用浓度为500U/ml-2000U/ml 的 GM-CSF，浓度为 50