mL的2mg/mL羧基石墨烯分散液，300W超声30min，使其充分分散；
[0048](2)将步骤(I)超声充分分散后的羧基石墨烯分散液滴加于步骤(I)制备得到的壳聚糖季铵盐-乙酸溶液中，60°C下持续持续搅拌5h，得到壳聚糖静电结合石墨烯的复合材料；
[0049](3)取伏立康唑的注射液用生理盐水稀释，搅拌状态下滴加于步骤(2)制备得到的壳聚糖静电结合石墨烯的复合材料中，使伏立康唑在复合材料中的最终浓度为10mg/mL，50°C下持续搅拌12h;装入透析袋(截留大小800Da)中，置于去离子水中除去未载上的药物，透析Ia后，得到治疗真菌性角膜炎的长效缓释制剂，置于4°C保存。可进一步浓缩后得到新型凝胶制剂，或者进一步流延于玻璃上干燥后得到载药膜制剂。
[0050]实施例5药物缓释实验
[0051](I)按照实施例1的方法制备治疗真菌性角膜炎的长效缓释制剂，取其20mL装入透析袋中(MWCO = 800Da)，待未负载的药物透析完后，测其光吸收值，计算出未负载的量，从而算出药物负载量为:lmg复合材料膜上的药物载药量为0.7977mg?
[0052](2)按照实施例1的方法制备治疗真菌性角膜炎的长效缓释制剂，用透析袋除去未负载的药物后，转入另一透析袋；置于PH 7.4的PBS溶液中，37°C下恒温孵育，设置三个平行组。每组定时取出4mL PBS溶液，再向其补入4mL新鲜的PBS溶液。所取液于255nm下检测光吸收值，以每个取样点(时间)为横坐标，每个取样点上累计的伏立康唑的释放总量为纵坐标，绘制曲线图，结果如图2所示。从图中可以看出，缓释慢慢增加，最后趋于稳定，缓释效果良好。
[0053]实施例6抑菌试验
[0054](I)大肠杆菌(ATCC8739，华南农业大学资源环境学院微生物实验室提供)和金黄色葡萄球菌(ATCC6538，华南农业大学资源环境学院微生物实验室提供)接种于LB培养基上，37°C下培养；茄病镰刀菌(CGMCC3.1829，购自中国医学科学院微生物所中国医学真菌保藏管理中心)和烟曲霉菌(AS3.772，购自中国医学科学院微生物所中国医学真菌保藏管理中心)则接种于沙保罗(Sabourand’ s)琼脂培养基，28°C下培养。待形成较多菌落后，生理盐水洗脱，并稀释至105/mL，各取15 μ L涂板。向治疗真菌性角膜炎的长效缓释制剂(实施例I)的2mg/mL混悬液中加入5片直径8mm的灭菌滤纸圆片，待滤纸圆片完全吸附混悬液后，贴附于涂抹过菌液的平板上，然后置于恒温培养箱中培养。待出现抑菌圈后，游标卡尺测量抑菌圈直径。每一抑菌圈测量三次。对茄病镰刀菌的抑菌圈直径为9mm，对烟曲霉菌的抑菌圈直径为8mm，对大肠杆菌的抑菌圈直径为16mm，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为15mm，制剂对细菌的抑菌效果较对真菌的抑菌效果要强。
[0055](2)上述菌株(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、茄病镰刀菌和烟曲霉菌)液体培养后，采用倍比稀释法检测最低抑菌浓度(MIC)。取灭菌小试管10支，第I管中加入培养液1.9mL，2?10管中各ImL ;第I管中加入测试的药物或者载药材料0.1mL,混匀后取ImL加入到第2管，依次倍比稀释，自第9管吸取ImL弃去，第10管中不加药物或者载药材料，作为对照；各管中加入105CFU/mL，菌液均为50yL，混匀培养。以不出现肉眼可见菌落生长的最低药物浓度为所测物质的MIC。所测伏立康唑对茄病镰刀菌的MIC为2.5 μ g/mL，对烟曲霉菌的MIC为2.5?5 μ g/mL,而实施例1制备得到的治疗真菌性角膜炎的长效缓释制剂对这两种真菌的MIC均为1.25 μ g/mL。
[0056]实施例7细胞毒性实验
[0057](I)采用MTT法检测材料对角膜上皮细胞的毒性。在96孔细胞板中加入处于对数期的角膜上皮细胞(HECEs，购自中山眼科中心)，每个孔的细胞密度为5000/孔，加入胎牛血清的培养基。24h后，吸去培养基，每孔加入新鲜培养基200 μ L。处理组各加入实施例1制备得到的治疗真菌性角膜炎的长效缓释制剂30 μ L，对照组加入培养基30 μ Lo每个组均设6个复孔。
[0058](2) 24h后，每个孔中以200 μ L基础培养基(即不加血清)代替，同时每个孔中加Λ 20 μ L 5mg/mL MTT溶液(pH7.4的PBS溶液溶解)。37°C下培养3h后，吸去空中的培养液，各加入200 μ L 二甲基亚砜，使形成的细胞结晶溶解。将此96孔板置于酶标仪中，580nm波长下测其吸光值，以此数值检测载药材料对正常细胞的生长是否有抑制作用。
[0059]根据结果，得到载药材料对细胞生长没有抑制作用。
[0060]实施例8动物试验
[0061]选择6?8周龄、体重18?22克的C57BL/6j小鼠(购于南方医科大学动物饲养中心)。采用角膜基质内注射法建立真菌性小鼠角膜炎模型，具体方法为:用一个30-gauge的有30°斜面的针头自角膜中周边进针，做一个深度达到基质层的角膜隧道，然后换一个33-gauge的有30 °斜面的针头沿隧道进入角膜基质，随后注射1.5 μ L烟曲霉菌悬浮液(I X 1VmDo将实施例1制备得到的载药膜剪成适当大小置于兔的左眼下结膜囊内，右眼作为对照，裂隙灯下连续7天观察角膜变化。我们得到，小鼠的真菌性角膜炎逐渐治愈，目艮睛恢复健康。
[0062]本发明具体实施例制备的一种治疗真菌性角膜炎的长效缓释混悬剂、凝胶制剂或者薄膜类制剂，对其进行药物缓释测试，抑菌测试，毒性评价，眼角膜变化测试等，得到良好的实验结果。
[0063]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种治疗真菌性角膜炎的长效缓释制剂的制备方法，其特征在于包含如下步骤: (1)将壳聚糖类物质溶于乙酸溶液，得到壳聚糖类物质-乙酸溶液； (2)将步骤(I)制备得到的壳聚糖类物质-乙酸溶液与石墨烯类物质分散液混合，在20?80°C下搅拌反应I?5h，得到壳聚糖类物质静电结合石墨烯类物质的复合材料； (3)在步骤(2)制备得到的壳聚糖类物质静电结合石墨烯类物质的复合材料中添加抗真菌类药物伏立康唑，然后在30?80°C下反应3?12h，透析，得到治疗真菌性角膜炎的长效缓释制剂。2.根据权利要求1所述的治疗真菌性角膜炎的长效缓释制剂的制备方法，其特征在于: 步骤(I)中所述的壳聚糖类物质为壳聚糖和壳聚糖衍生物中的任意一种或者至少两种。3.根据权利要求1所述的治疗真菌性角膜炎的长效缓释制剂的制备方法，其特征在于: 步骤(I)中所述的乙酸溶液的体积分数为1%?2%。4.根据权利要求1所述的治疗真菌性角膜炎的长效缓释制剂的制备方法，其特征在于: 步骤(2)中所述的石墨烯类物质为石墨烯和改性石墨烯中的任意一种或者至少两种。5.根据权利要求1所述的治疗真菌性角膜炎的长效缓释制剂的制备方法，其特征在于: 步骤(2)中所述的石墨烯类材料在壳聚糖类物质静电结合石墨烯类物质的复合材料中的质量分数为0.1%?1%。6.根据权利要求1所述的治疗真菌性角膜炎的长效缓释制剂的制备方法，其特征在于: 步骤(2)中所述的壳聚糖类物质静电结合石墨烯类物质的复合材料中壳聚糖和石墨烯类物质的质量比为(100:1)?(200:1) ο7.根据权利要求1所述的治疗真菌性角膜炎的长效缓释制剂的制备方法，其特征在于: 步骤(3)所述的伏立康唑在复合材料中的终浓度为5?10mg/mL。8.根据权利要求1所述的治疗真菌性角膜炎的长效缓释制剂的制备方法，其特征在于: 所述的治疗真菌性角膜炎的长效缓释制剂可进一步加工制备得到混悬剂、凝胶类制剂或者真空干燥成膜，得到载药膜制剂。9.一种治疗真菌性角膜炎的长效缓释制剂，其特征在于:根据权利要求1?8任一项所述的制备方法制备得到。10.权利要求9所述的治疗真菌性角膜炎的长效缓释制剂在制备治疗真菌性角膜炎药物中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种治抗真菌药物的制剂，具体涉及一种治疗真菌性角膜炎的长效缓释制剂及其制备方法与应用。本发明所述的治疗真菌性角膜炎的长效缓释制剂的基体由石墨烯类材料静电结合载药壳聚糖类物质构成，药物负载于石墨烯类材料的片状结构上，结构稳定，负载量大。该制剂对真菌和细菌均有具有良好的抑菌活性，具有良好的细胞相容性和柔韧性和抗拉伸强度。该制剂可以简单方便地贴敷于角膜，在达到优良抑菌活性的同时，对正常组织没有毒性作用。作为一种眼科用药剂型，可以粘附在患者角膜长效缓释达到有效的药物浓度，并且该制剂制备简便，载药材料本身具有优良抑菌活性，机械性能良好，具有对眼部组织无刺激及毒副作用，使用方便等优点。
【IPC分类】A61K47/04, A61P27/02, A61P31/10, A61K9/06, A61K31/506, A61K47/36
【公开号】CN104940936
【申请号】CN201510309886
【发明人】蒋刚彪, 袁进, 陈国普, 黄健菲, 阮仲航
【申请人】华南农业大学
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年6月8日