一种藏麻黄抗a型流感病毒活性部位的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物提取物技术领域，具体涉及一种藏麻黄抗A型流感病毒活性部位 及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 目前，现代医学针对病毒性传染病的防治，主要以抗病毒药物及特异性疫苗的研 制与应用为主，已取得较好成绩。然而多数病毒性疾病至今尚无特效药物，而能够应用疫苗 进行防治的病毒性疾病也很少。同时由于病毒的变异也使有些疫苗的临床效果受到一定影 响。抗病毒药在某种意义上说只是病毒抑制剂，不能直接杀灭病毒和破坏病毒体，否则也会 损伤宿主细胞。抗病毒药的作用在于抑制病毒的繁殖，使宿主免疫系统抵御病毒侵袭，修复 被破坏的组织，或者缓和病情使之不出现临床症状。至今，某些病毒性疾病如脊髓灰质炎和 狂犬病还没有抗病毒治疗药，只能靠疫苗预防，一旦错过防疫期，后果十分严重。因此，迄今 为止，这类疾病仍然是医学界感到棘手的一类疾病。尽管中医药、藏医药还未发现有特效杀 灭病毒的单味药或复方，但是通过辨证治疗，已在某些病毒性疾病的治疗(如艾滋病、病毒 性感冒与麻瘆、乙型病毒性肝炎）方面显示出一定的优势。在2003年的SARS治疗过程中， 包括中医药、藏医药在内的民族传统医药以其独特的疗效引起世界的关注，并得到世界卫 生组织（WHO)专家的肯定。因此，中医药、藏医药治疗病毒性疾病值得深入研宄与探讨。截 至目前，我国在研的抗病毒新药包括已获临床试验批准文号的新药和正在开展临床研宄的 新药，其品种有：抗流感病毒新药阿比朵尔及片剂和胶囊，盐酸金刚乙胺糖浆剂，抗乳头瘤 状病毒药咪喹莫特及其乳膏，更昔洛韦眼凝胶，盐酸伐昔洛韦滴眼液和颗粒剂等。
[0003] 流感病毒为正黏病毒科RNA病毒，根据其核蛋白（NP)和膜基质蛋白M抗原性不同 可分为甲（A)、乙（B)、丙（C) 3型。A型流感病毒亦称甲型流感病毒，病毒极小，直径约100 纳米，主要在冬季流行。A型流感病毒攻击力很强，原因是其表面密布两种武器，病毒感染生 物后能够迅速增殖，这就是血细胞凝集素（H)和神经氨酸苷酶（N)两种蛋白质。种类多样的 A型流感病毒可以从野生动物传给家畜家禽等，在鸡、鸭、猪等身上广泛传播。这些家畜家 禽携带的病毒如果发生基因变异，获得在人群中传染的能力，会对人类造成巨大危害。
[0004] 现有治疗A型流感病毒的药物中虽然涉及了采用麻黄科植物的提取物治疗流感 的设计，但存在以下问题：首先现有的麻黄科植物的提取物对于A型流感病毒的治疗效果 不理想，不具有较强的针对性，其原因是麻黄科植物提取物中成分复杂，其真正起到治疗A 型流感病毒的活性部位含量极低，制成药物后对A型流感病毒的治疗不具备针对性。其次， 现有技术中藏麻黄中治疗A型流感病毒的活性部位活性不明，提取方法不明，导致现有的 提取纯化手段获得产物抗A型流感病毒的活性较低，或者在多次提取时活性数据不稳定， 无法推广生产。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是：针对现有技术的上述不足，提供一种藏麻黄抗A型 流感病毒活性部位的制备方法及其应用，该方法可提取获得具有高抗A型流感病毒活性的 活性部位，并且方法简便，提取量较大，并且可应用于制备片剂、微丸剂或粉针剂，使对A型 流感病毒的治疗更具有针对性，提高对A型流感病毒的治疗效果。
[0006] 本发明是通过以下技术方案实现的：该藏麻黄抗A型流感病毒活性部位的制备方 法，其特征在于，包括如下步骤： 1) 采集藏麻黄全株，阴干，粉碎，过60~80目筛，得藏麻黄药材粗粉； 2) 加入体积百分数90 ~95%的乙醇水溶液至浸没藏麻黄药材粗粉，在55~60°C水浴 条件下回流提取l~2h，抽滤得滤液及滤渣；取滤渣并重复以上操作两次；合并滤液、减压浓 缩，得浸膏粗品； 3) 浸膏粗品加水溶解，超声30~40min，制成乳悬液；乳悬液置于分液漏斗中，按乳悬液 和乙酸乙酯体积比1 :1~2的比例加入乙酸乙酯进行萃取，分液得乙酸乙酯萃取液；将乙酸 乙酯萃取液置于旋转蒸发仪中，蒸馏、浓缩，得乙酸乙酯部位浓缩浸膏； 4) 取乙酸乙酯部位浸膏，以体积百分数90~95%的乙醇水溶液溶解，添加硅胶拌样， 搅拌、减压挥去溶剂；利用Flash快速色谱分离，流动相为甲醇一水，按照甲醇体积百分数 5~100%进行线性梯度洗脱，收集甲醇体积百分数65~70%的甲醇流份； 5) 将步骤4)所收集的甲醇流份减压浓缩、干燥，即得。
[0007] 优选的，步骤4)所述的洗脱中流动相流速为0. 5~ 2. 5mL/min。
[0008] 步骤3)所述的乙醇水溶液与乙酸乙酯部位浸膏的体积比为20~22 :1，所述的硅胶 与乙酸乙酯部位浸膏的质量比为4~5 :1。
[0009] 优选的，步骤4)所述的Flash快速色谱分离中所用的色谱填料为粒径lOMffl的C18 反向柱。
[0010] 优选的，步骤5)所述的减压浓缩、干燥的具体操作为：在压力-5 MPa，温度-60 °C 条件下减压冷冻干燥。
[0011] 优选的，步骤2)所述的抽滤具体操作为：加入体积百分数为95%的乙醇水溶液至 浸没藏麻黄药材粗粉，在60°C水浴条件下回流提取lh，抽滤得滤液及滤渣。
[0012] 优选的，步骤4)具体操作为：取乙酸乙酯部位浸膏，以体积百分数95%的乙醇水 溶液溶解，添加硅胶拌样，搅拌、减压挥去溶剂；利用Flash快速色谱分离，流动相为甲醇一 水，按照甲醇体积百分数5~100%进行线性梯度洗脱，收集甲醇体积百分数65~68%的甲醇流 份。
[0013] 利用以上所述的制备方法制得的藏麻黄抗A型流感病毒活性部位的应用，其特征 在于：藏麻黄抗A型流感病毒活性部位用于制备抗A型流感病毒的片剂、微丸剂或粉针剂。
[0014] 对于本发明，申请人说明如下： 青藏高原具有光照时间长、昼夜温差大、光合作用强等自然条件，使生长在青藏高原的 药用植物不仅种类繁多，而且非常有利于有效成分的积累。植根于青藏高原的藏药，其应用 历史悠久，价格低廉，效果明显，易于普及，已受到越来越多的人的欢迎。藏民族在长期与疾 病作斗争的过程中发现，多种产自青藏高原的药材对病毒性疾病具有很好的疗效。但是，藏 药基础研宄薄弱，药效不明，活性成分不清，是制约藏药现代化的关键。申请人对记载中具 有抗病毒功效的传统藏药材进行了较全面的筛选，并通过平行序列分离技术与活性追踪技 术相结合的研宄方法，发现抗病毒有效部位或有效成分，以明确其抗病毒作用，为有目的的 开发抗病毒创新藏药奠定基础。通过研宄发现：相比其他藏药和麻黄科其他植物，藏麻黄中 抗A型流感病毒的活性部位，其抗病毒活性强，而细胞毒性极小，具有较大的研宄价值。
[0015] 申请人在步骤3)中曾选用各种不同极性的溶剂进行萃取，通过研宄发现乙酸乙 酯为抗A型流感病毒活性部位的最佳萃取剂。申请人将步骤3)中的乳悬液按极性大小依 次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶剂，得乙酸乙酯部分，正丁醇部分，水部分。申请人通过 A型流感病毒活性筛选发现：相比其他不同极性的萃取剂，乙酸乙酯部分具有较高的抗A型 流感病毒活性，因此申请人在步骤3)中设计采用乙酸乙酯萃取乳悬液，以便最大限度的保 留抗A型流感病毒的活性部位。步骤2)浸膏粗品和步骤3)乙酸乙酯部位浸膏中液体所占 的质量百分比均小于1%，可以忽略不计。
[0016] 申请人在步骤4)中以甲醇一水作为流动相进行线性梯度洗脱，以便在步骤3)的 基础上进一步分离乙酸乙酯部位浸膏中的成分，收集包含抗A型流感病毒的活性部位的甲 醇流份。申请人经研宄发现：甲醇体积百分数