由小分子靶向人癌症中的gli蛋白的制作方法
【专利说明】由小分子靶向人癌症中的GLI蛋白
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 按照美国法典第35篇第119条（e)款，本申请要求2013年1月23日提交的美国 临时专利申请序列号61/755, 878的申请日的优先权；所述申请的公开内容以引用的方式 并入本文。
[0003] 引言
[0004] Hedgehog (Shh或Hh)、WNT、FGF和BMP信号传导途径在胚胎发生、组织再生和癌 发生期间相互连接在一起。Hh信号传导途径的异常活化在多种人肿瘤中导致病理学后果。 Hedgehog是通过结合包含PATCHEDl(ptchl)和SMOOTHENED(smo)的跨膜蛋白质复合物且 引发胞质信号转导事件级联（包括导致GLI锌指转录因子的转录的蛋白激酶A的抑制）来 起始Hh信号转导的分泌的糖蛋白。锌指转录因子的GLI家族然后将细胞外Hh刺激物以背 景依赖性和细胞类型特异性方式翻译成所定义的转录程序（Ruiz I Altaba等，2002, Nat. Rev. Cancer 2:361-72)〇
[0005] 几种蛋白质（包括GLI蛋白）参与介导Hh信号传导（Katoh和Katoh, 2005, Cancer Biol. Ther. 4:1050-4)。脊椎动物具有至少三种不同的GLI蛋白，GLI (还被称为GLIl)、 GLI2和GLI3。这些蛋白质是锌指转录因子的GLI家族的成员，并且与果蝇（Drosophila) 翅脉中断（Cubitus interruptus) (Ci)和秀刚隐杆线虫（Caenorhabditis elegans)性 别决定基因 tra-Ι共有高度保守的C2-H2锌指结构域（具有五个锌指DNA结合基序）（Hui 等，1994, Dev. Biol. 162:402-13)。
[0006] 虽然关于果蝇和鼠发育中的Hh信号传导已有许多了解，但是对于在人癌症中响 应于Hh信号传导和GLI活性而活化的分子机制和肿瘤发生程序的了解仍然十分有限。Hh 相关癌症的共同特性是一种或多种GLI蛋白的升高的表达水平。
【发明内容】
[0007] 本公开总体上涉及抑制肿瘤发生、肿瘤生长和肿瘤存活的组合物和方法。所述组 合物包含抑制Hedgehog和GLI信号传导途径的小分子化合物。所述组合物适用于治疗其 中过量表达GLI蛋白的癌症。
[0008] 所述实施方案提供适用于检测和治疗其中过量表达GLI蛋白的多种癌症的化合 物、药物组合物、试剂盒和方法。所述癌症包括肺癌、NSCLC、乳癌、结肠癌、间皮瘤、黑色素 瘤、肉瘤、前列腺癌、卵巢癌、肾癌、食道癌、胃癌、肝细胞癌、鼻咽癌、胰腺癌、神经胶质瘤以 及其他。
[0009] 本公开的方面包括一种式（I)的化合物以及其盐、水合物、溶剂化物、立体异构体 和前药：
[0010]
[0011] 其中
[0012] X1和X 2各自独立地是N或C，其中X 1和X 2中的一个是N并且X 1和X 2中的一个是 C，以使得环N在X1和X 2中的任何一个为C的情况下形成双键；
[0013] R1是芳基或取代的芳基；
[0014] R2选自芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基以及烷基；
[0015] R3是芳基或取代的芳基；
[0016] Y是直接键或C1-C4烷基；
[0017] Z是C1-C4烷基或芳基；
[0018] R4是-OH ;以及
[0019] R5是氛或C f C6烷基。
[0020] 在所述化合物的一些实施方案中，X1是N并且X2是C。
[0021] 在所述化合物的一些实施方案中，X1是C并且X2是N。
[0022] 在所述化合物的一些实施方案中，R1是芳基。
[0023] 在所述化合物的一些实施方案中，R2选自芳基、取代的芳基、杂芳基以及烷基。
[0024] 在所述化合物的一些实施方案中，R2选自杂芳基和烷基。
[0025] 在所述化合物的一些实施方案中，R3是芳基。
[0026] 在所述化合物的一些实施方案中，R3是取代的芳基。
[0027] 在所述化合物的一些实施方案中，R5是氢。
[0028] 在所述化合物的一些实施方案中，Y是(；-(：4烷基并且Z是C i-C4烷基。
[0029] 在所述化合物的一些实施方案中，Y是(；-(：4烷基并且Z是C ^C4烷基，以使得Y和 Z 形成-(CH2)3-C(CH3)2-CH 2 -。
[0030] 在所述化合物的一些实施方案中，Y是(；-(：4烷基并且Z是芳基。
[0031] 在所述化合物的一些实施方案中，Y是(；-(：4烷基并且Z是芳基，以使得Y和Z形
[0032] 在所述化合物的一些实施方案中，R1是芳基，R2是杂芳基，并且R 3是芳基。
[0033] 在所述化合物的一些实施方案中，R1是芳基，R2是烷基，并且R 3是取代的芳基。
[0034] 在所述化合物的一些实施方案中，R1是芳基，R2是芳基，并且R 3是芳基。
[0035] 在所述化合物的一些实施方案中，R1是芳基，R2是取代的芳基，并且R 3是取代的芳 基。
[0036] 在所述化合物的一些实施方案中，所述化合物是1，3-二苯基-5-噻 吩-3-基-4, 5-二氢-IH-吡唑-4-甲酸（5-羟基-4, 4-二甲基-戊基）-酰胺，其具有结 构：
[0037]
[0038] 在所述化合物的一些实施方案中，所述化合物是1，3-二苯基-5-噻 吩-3-基-4, 5-二氢-IH-吡唑-4-甲酸（5-羟基-4, 4-二甲基-戊基）-酰胺，其具有结 构：
[0039]
[0040] 在所述化合物的一些实施方案中，所述化合物是3- (4-氟-苯基）-1-苯基-5-丙 基-4, 5-二氢-IH-吡唑-4-甲酸（5-羟基-4, 4-二甲基-戊基）-酰胺，其具有结构： [0041 ]
[0042] 在所述化合物的一些实施方案中，所述化合物是1，3, 5-三苯基-4, 5-二 氢-1H-吡唑-4-甲酸4-羟基-苄基酰胺，其具有结构：
[0043]
[0044] 在所述化合物的一些实施方案中，所述化合物是3-(4-氟-苯基）-5-(3-氟-苯 基）-1-苯基-4, 5-二氢-IH-吡唑-4-甲酸（5-羟基-4, 4-二甲基-戊基）-酰胺，其具有 结构：
[0045]
[0046] 在所述化合物的一些实施方案中，所述化合物选自：
[0047]
(1-(5-氯-2-甲基-苯基）-5-(2,6-二甲基-苯 基）-3- (2- m -苯基）-4, 5-二a -IH-吡唑-4-甲酸[2- (4-羟基-苯基）-乙基]-酰胺， 化合物3)，以及
[0048]
(3- (4-氟-苯基）-1，5-二苯基-4, 5-二氢-IH-吡 唑-4-甲酸（5-羟基-4, 4-二甲基-戊基）-酰胺，化合物5)。
[0049] 本公开的方面包括一种药物组合物，其包含如上所述的式（I)的化合物和药学上 可接受的载体。
[0050] 本公开的方面包括一种药物组合物，其包含如上所述的式（I)的化合物和化学治 疗剂。
[0051] 本公开的方面包括一种药物组合物，其包含如上所述的式（I)的化合物以及选自 埃罗替尼、培美曲塞、LY294002、SB431542和顺铂的化学治疗剂。
[0052] 所述实施方案还提供用于使用式（I)的化合物的方法。在某一实施方案中，提供 一种用于治疗患有癌性病状的受试者的方法。所述方法包括以下步骤：向所述受试者施用 治疗有效量的式（I)的化合物或包含式（I)的化合物的药物组合物，其中所述癌性病状特 征在于表达GLI多肽并且其中所述施用步骤产生所述受试者的治疗。
[0053] 此外，所述实施方案提供式（I)的化合物或包含式（I)的化合物的药物组合物用 于在医学疗法中使用。此外，所述实施方案提供式（I)的化合物或包含式（I)的化合物的 药物组合物用于在癌症的治疗中使用。此外，所述实施方案提供式（I)的化合物或包含式 (I)的化合物的药物组合物在制造用于治疗癌症的药剂中的用途。
[0054] 附图简述
[0055] 图1示出根据本公开的实施方案，使用小鼠异种移植物模型（黑色素瘤Meljuso)， 化合物1、2、4和6的体内功效研究。在用所施用的化合物治疗之后，肿瘤重量显著降低。结 果是平均值土 SD (误差线）。箭头指示注射周期。
[0056] 图2示出根据本公开的实施方案，使用小鼠异种移植物模型（间皮瘤MS-1)，化合 物1和4的体内功效研究。在用所施用的化合物治疗之后，肿瘤重量显著降低。结果是平 均值土 SD (误差线）。箭头指示注射周期。
[0057] 图3示出根据本公开的实施方案，使用小鼠异种移植物模型（肺癌A549)，化合物 1和4的体内功效研究。在用所施用的化合物治疗之后，肿瘤重量显著降低。结果是平均值 土 SD (误差线）。箭头指示注射周期。
[0058] 图4示出根据本公开的实施方案，通过化合物1、2、4和6调控hGlil、hGli2、 hGli3、hHHIP、hWnt2、hAxin2、hEGFR 和 hCyclin Dl 活性。
[0059] 图5示出根据本公开的实施方案，在体内治疗之后化合物1、2、4和6对小鼠的白 细胞群体的作用。在完成体内研究之后，收集来自所有治疗组的每个动物的白细胞（WBC: 白细胞，NE :中性粒细胞，LY :淋巴细胞，MO :单核细胞，EO :嗜酸性粒细胞，BA :嗜碱性粒细 胞），并且通过血细胞计数器对白细胞群体进行计数。结果是平均值土 SD (误差线）。
[0060] 图6示出根据本公开的实施方案，在体内研究的药物施用周期期间，化合物1、2、4 和6对小鼠的体重的作用。
[0061] 图7示出根据本公开的实施方案，在毒性研究中不同剂量的化合物4和6对小鼠 的体重的作用。将所述化合物以3种不同剂量：25、50和100mg/kg体重在腹部中腹膜内注 射至动物，进行连续6天。每个给药组包含3只小鼠。使用天平测量小鼠的体重。结果是 平均值土 SD (误差线）。
[0062] 图8示出根据本公开的实施方案，使用细胞毒性测定和来自小鼠的肝细胞、脾细 胞、肾细胞和心脏细胞筛选化合物2。
[0063] 图9示出根据本公开的实施方案，使用细胞毒性测定和来自小鼠的肝细胞、脾细 胞、肾细胞和心脏细胞筛选化合物1。
[0064] 图10示出根据本公开的实施方案，使用细胞毒性测定和来自小鼠的肝细胞、脾细 胞、肾细胞和心脏细胞筛选化合物4。
[0065] 图11示出根据本公开的实施方案，使用细胞毒性测定和来自小鼠的肝细胞、脾细 胞、肾细胞和心脏细胞筛选化合物6。
[0066] 图12示出根据本公开的实施方案，埃罗替尼（特罗凯）和化合物4在肺癌细胞中 的协同作用。
[0067] 图13示出根据本公开的实施方案，埃罗替尼（特罗凯）和化合物4在间皮瘤细胞 中的协同作用。
[0068] 图14示出根据本公开的实施方案，PI3K抑制剂LY294002和化合物6在肺癌细胞 中的协同作用。
[0069] 图15示出根据本公开的实施方案，PI3K抑制剂LY294002和化合物6在间皮瘤细 胞中的协同作用。
[0070] 图16示出根据本公开的实施方案，TGF β抑制剂SB431542和化合物6在肺癌细 胞中的协同作用。
[0071] 图17示出根据本公开的实施方案，培美曲塞（爱宁达）和化合物6在间皮瘤细胞 中的协同作用。
[0072] 图18示出根据本公开的实施方案，对于不同癌细胞系，Gli抑制剂化合物4以及 其两种纯化对映体（Pl和Ρ2)中的每一种的细胞毒性IC 5。值（μ Μ)。
[0073] 图19示出根据本公开的实施方案，Gli抑制剂化合物4的功效与非小细胞肺癌 (NSCLC)细胞中的Gli表达的相关性的图。
[0074] 图20示出根据本公开的实施方案，Gli抑制剂化合物4-对映体P2的功效与癌细 胞中的Gli表达的相关性的图。
[0075] 图21示出根据本公开的实施方案，荧光素酶活性（％)的图，其示出Gli抑制剂化 合物4-对映体P2在体外抑制NCSLC细胞系A549中的Gli/TAF依赖性转录活性。
[0076] 图22示出根据本公开的实施方案，Gli下游靶标的表达水平的图，其示出Gli抑 制剂化合物4-对映体P2在体外抑制NSCLC细胞中的Gli下游靶标。
[0077] 图23示出根据本公开的实施方案，基因表达的图，其示出Gli抑制剂化合物4-对 映体P2在体外抑制间皮瘤细胞中的Gli下游靶标。
[0078] 图24示出根据本公开的实施方案，示出Gli抑制剂化合物4-对映体P2在体外 (小鼠异种移植物模型：间皮瘤MS-1)抑制肿瘤中的间皮瘤细胞中的Gli下游靶标的免疫 组织化学图像。
[0079] 图25示出根据本公开的实施方案，示出⑶C0449 (Smo抑制剂）与Gli抑制剂化合 物4-对映体P2在体外抑制间皮瘤细胞的生长中的协同作用。
[0080] 详述
[0081] 本公开的方面包括适用于检测和治疗其中过量表达GLI蛋白的多种癌症的化合 物、药物组合物、试剂盒和方法。所述组合物包含抑制Hedgehog和GLI信号传导途径的小 分子化合物。
[0082] 在描述本发明和本发明的具体示例性实施方案之前，应当理解本发明不限于所述 的具体实施方案，因而，当然也可有所变化。还应了解本文所用的术语仅出于描述具体实施 方案的目的，并且不意图具有限制性，因为本发明的范围将仅受限于随附权利要求。
[0083] 如果提供一定范围的值，那么应理解除非上下文另外清楚地规定，否则所述实施 方案内涵盖所述范围的上限与下限之间的各插入值（至下限单位的十分之一）和在所陈述 的范围中的任何其他陈述值或插入值。所述实施方案内还涵盖可独立地包括于较小范围中 的这些较小范围的上限和下限，从属于所陈述的范围中的任何具体排除的限值。当所述范 围包括一个或两个限值时，排除那些所包括的限值之一或两者的范围也包括在所述实施方 案中。
[0084] 除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域中 的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管在实践或测试本发明中还可使用与本文所述 的那些方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但是现在描述示例性方法和材料。
[0085] 在本说明书中引用的所有公布和专利都以引用的方式并入本文，所述引用的程度 就如同已具体地和个别地指示将各个别公布或专利以引用的方式并入一般，并且以引用的 方式并入本文来公开和描述与所述公布引用的内容相关的方法和/或材料。引用任何公布 都是因为它的公开内容在提交日期之前，而不应解释为认可本发明由于先前发明而无权先 于所述公布。此外，所提供的公布日期可不同于可能需要独立确认的实际公布日期。
[0086] 应注意，除非上下文另有明确规定，否则本文中和所附权利要求中使用的单数形 式"一个"、"一种"和"所述"包括复数个指示物。因此，例如，提及一种"化合物"包括本领 域的技术人员已知的多种这类化合物及其等效物等。
[0087] 术语
[0088] 除非另外定义，否则本文所使用的所有技术性和科学性术语具有本发明所属领 域中的普通技术人员通常所理解的含义。以下参考文献向技术人员提供在本发明中使用 的许多术语的一般定义：Singleton 等，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(第 2 版1994) ；The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker 编辑，1988) ;The Glossary of Genetics,第 5 版，R. Rieger 等（编辑），Springer Verlag(1991);以及Hale和Marham，The Harper Collins Dictionary of Biology(1991) 〇 如本文所用，除非另外指明，以下术语具有赋予其的含义。
[0089] 如本文所用，术语"烷基"是指直链或支链烃基，并且可包括具有指定数目的碳原 子的二价和多价基团（即，C 1-C1。意指一至十个碳）。饱和烃基的实例包括如甲基、乙基、正 丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、其同系物和异构体（例如正戊基、正己基、 正庚基、正辛基等）的基团。
[0090] 如本文所用，术语"烯基"是指具有一个或多个双键的不饱和烷基。烯基的实例包 括乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-( 丁二烯基）、2, 4-戊二烯基以及3-(1，4-戊 二烯基），以及高级同系物和异构体。
[0091] 如本文所用，术语"炔基"是指具有一个或多个三键的不饱和烷基。炔基的实例包 括乙炔基（ethynyl/acetylenyl)、l-丙炔基、1-和2-丁炔基，以及高级同系物和异构体。
[0092] 如本文所用，术语"芳基"是指具有5-12个环成员的多不饱和的芳香族烃取代基， 其可以是单个环或稠合在一起或共价连接的多个环（最多三个环）。芳基的非限制性实例 包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基和苄基。其他芳基也适用于所述实施方案中。
[0093] 如本文所用，术语"环烷基"是指具有3至15个碳和可稠合或共价连接的1至3个 环的饱和环烃。适用于所述实施方案中的环烷基包括但不限于环戊基、环己基、环庚基和环 辛基。适用于所述实施方案中的双环烷基包括但不限于[3.3.0]双环辛烷基、[2.2.2]双 环辛烷基、[4. 3. 0]双环壬烷、[4. 4. 0]双环癸烷（萘烷）、螺[3. 4]辛烷基、螺[2. 5]辛烷 基等。
[0094] 如本文所用，术语"环烯基"是指具有3至15个碳和可稠合或共价连接的1至3个 环的不饱和环烃。适用于所述实施方案中的环烯基包括但不限于环戊烯基、环己烯基、环庚 烯基和环辛烯基。双环烯基也适用于所述实施方案中。
[0095] 如本文所用，术语"卤素"是指包括氟（F)、氯（Cl)、溴（Br)和碘⑴的元素。
[0096] 如本文所用，术语"杂芳基"是指具有5-12个环成员的多不饱和的芳香族烃取代 基，其可以是单个环或稠合在一起或共价连接的多个环（最多三个环），并且其在环中具有 至少一个杂原子，如N、0或S。杂芳基可通过杂原子连接至分子的其余部分。杂芳基的非 限制性实例包括1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、 2- 噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑 基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、 3- 吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚 基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。适用于所 述实施方案中的另外杂芳基包括吡啶基N-氧化物、四唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲唑 基或取代的任何基团，尤其是单-或二-取代的。
[0097] 如本文所用，术语"杂环基"是指饱和环烃，其具有3至15个环成员和可稠合或共 价连接的1至3个环，并且其在环中具有至少一个杂原子，如N、0或S。另外，杂原子可占据 杂环连接至分子的其余部分所处的位置处。杂环基的实例包括1-(1，2, 5, 6-四氢吡啶基）、 1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、 四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。
[0098] 如本文所用，术语"立体异构体"是指所述实施方案的具有不对称碳原子（光学中 心）或双键的化合物。外消旋体、非对映体、对映体、几何异构体（即，顺式/反式异构体） 和各个立体异构体全部意图涵盖在所述实施方案的范围内。
[0099] "标记"或"可检测部分"是可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其他 物理方式检测的组合物。例如，有用的标记包括1 1251、3￥、荧光染料、电子致密试剂、酶（例 如，如在ELISA中常用的）、生物素、地高辛或半抗原和蛋白质或可例如通过将放射性标记 并入至小分子化合物而可检测的其他实体。标记可在任何位置处并入化合物中。
[0100] 术语"药学上可接受的"是指当向受试者（如人受试者）施用时是生理上可耐受 的并且通常不会产生过敏或类似不良反应的组合物。例如，术语"药学上可接受的"还可意 指由联邦或州政府的监管机构批准或在美国药典或其他通常认可的药典中列出以用于动 物（如人）的。
[0101] 术语"多肽"、"肽"和"蛋白质"在本文中可互换使用，以指代氨基酸残基的聚合物。 所述术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物 的氨基酸聚合物，并且适用于天然存在的氨基酸聚合物、含有修饰的残基的那些和非天然 存在的氨基酸聚合物。
[0102] 如本文所用，术语"前药"是指容易在生理条件下发生化学变化以提供所述实施方 案的化合物的化合物。另外，前药可在离体环境中通过化学或生物化学方法转化成所述实 施方案的化合物。例如，当放置在具有适合的酶或化学试剂的经皮贴剂贮库中时，前药可缓 慢地转化为所述实施方案的化合物。
[0103] 如本文所用，术语"盐"是指取决于在本文所述的化合物上发现的取代基用相对 无毒的酸或碱制备的化合物的盐。当所述实施方案的化合物含有相对酸性的官能度时，可 通过纯净地或在适合的惰性溶剂中使中性形式的所述化合物与足量的所需碱相接触来获 得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐的实例包括钠、钾、钙、铵、有机氨基或镁盐，或类似 盐。当所述实施方案的化合物含有相对碱性的官能度时，可通过纯净地或在适合的惰性溶 剂中使中性形式的所述化合物与足量的所需酸相接触来获得酸