益生精氨酸分解口服组合物以及制备和使用益生精氨酸分解口服组合物的方法
【专利说明】益生精氨酸分解口服组合物以及制备和使用益生精氨酸分 解口服组合物的方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于 2013 年 2 月 14 日提交、题为"Probiotic Oral Compositions and Methods of Using Probiotic Oral Compositions"、具有系列号 61/764, 579 的美国临时 申请的优先权，其通过引用整体并入本文。
[0003] 关于联邦政府赞助的研究或开发的声明
[0004] 本发明用由美国国立口腔与颜面研究所（National Institute of Dental and Craniofacial Research)授予的合约号DE10362在政府支持下进行。政府具有该发明中的 某些权利。
[0005] 序列表
[0006] 本申请包括序列表，其已随本申请经由EFS-Web提交。序列表文件被命名为 01974537. txt，大小为794字节，并且通过引用以其全部并入本文。
[0007] 背景
[0008] 口腔龋齿是世界范围内影响人类的最普遍的传染性和慢性疾病，并且与昂贵的治 疗有关。口腔健康向口腔龋齿的转换以口腔生物膜的复合微生物群落的组成和代谢的变化 为特征。通常称为牙菌斑的口腔生物膜不断地在所有的牙齿表面上形成并生长。尽管口腔 生物膜中的细菌生成酸是口腔龋齿的直接原因，但是值得注意的是耐酸生物的比例增加表 现为发生，以较少酸耐性的（即较不"耐酸的"）物种为代价。特别注意的是，较不耐酸生物 的子集通过碱生成得到保护免受菌斑酸化的影响，所述碱生成显示出与口腔健康正相关。
[0009] 口腔细菌的碱生成的主要路径之一是精氨酸脱亚胺酶系统（ADS)，通过精氨酸脱 亚胺酶系统精氨酸被分解代谢成鸟氨酸、氨和CO 2，伴随着ATP生成。因此，在细菌中ADS发 挥着关键的生理功能，对生长和维护提供保护免受低pH和ATP的有害影响。口腔生物膜中 的ADS活性能通过经由氨生成缓和pH来影响口腔微生物群落的生态。
[0010] 定殖于牙齿和口腔软组织并形成口腔生物膜的多种细菌表达ADS。口腔龋齿增加 的风险已与口腔生物膜经由精氨酸脱亚胺酶系统（ADS)从精氨酸生成碱的降低的能力有 关。特别地，来自无龋齿的受试者的菌斑细菌当与来自龋齿活跃的受试者的菌斑细菌相比 展示较高的ADS活性水平。而且，在个体间在碱生成速率方面存在高度变异性，在一些情况 中大于1000倍。对受试者间ADS活性差异的微生物基础的更好的理解以及为了改进口腔 健康提高ADS活性会是有益的。
[0011] 概述
[0012] 简单地描述，本公开内容的实施方案提供了益生（probiotic)精氨酸分解 (arginolytic) 口服组合物，制备益生精氨酸分解口服组合物的方法，以及使用益生精氨酸 分解口服组合物以增加口腔中的精氨酸分解活性和/或以治疗和/或预防龋齿的方法。
[0013] 本公开内容的精氨酸分解益生口服组合物的实施方案包括分离的细菌菌株的混 合物和药学上可接受的口服载体。在实施方案中，混合物包括至少两种不同的分离的精氨 酸分解细菌菌株，每种菌株能够经由精氨酸脱亚胺酶系统（ADS)生成氨并且每种菌株满足 以下标准中的至少一个：在环境精氨酸不存在下表达ADS活性，在葡萄糖的存在下表达ADS 活性，在非酸性pH下表达ADS活性，在有氧条件下表达ADS活性，抑制与口腔龋齿有关的至 少一种细菌菌株的生长，和抵抗由与口腔龋齿有关的至少一种细菌菌株对生长的抑制，其 中细菌菌株的混合物满足标准的至少两个。
[0014] 制备用于口服使用的精氨酸分解细菌菌株的混合物的方法的实施方案包括至少 以下步骤：(a)获得从口腔样品分离的细菌菌株的混合物；(b)分离并鉴定能经由精氨酸脱 亚胺酶系统（ADS)生成氨的精氨酸分解细菌菌株；（c)进行一种或更多种单独的测定以鉴 定能够在以下测定条件中的至少一个下表达ADS活性的精氨酸分解细菌菌株：在环境精氨 酸不存在下，在葡萄糖的存在下，在非酸性PH下，在有氧条件下，以及在与口腔龋齿相关的 至少一种细菌菌株的存在下；（d)选择至少两种不同的分离的在步骤（c)中鉴定的精氨酸 分解细菌菌株以制备精氨酸分解细菌的混合物，其中混合物在所述条件中的至少两个下表 达ADS活性。
[0015] 在实施方案中，本公开内容提供了预防或减少宿主的口腔龋齿的发生的方法以及 减缓或阻止宿主中的口腔龋齿损伤的进展的方法。方法包括向宿主施用包含分离的细菌菌 株的混合物和药学上可接受的口服载体的益生口服组合物，其中混合物包括至少两种不同 的分离的精氨酸分解细菌菌株，每种菌株能经由精氨酸脱亚胺酶系统（ADS)生成氨并且每 种菌株满足以下标准中的至少一个：在环境精氨酸不存在下表达ADS活性，在葡萄糖的存 在下表达ADS活性，在非酸性pH下表达ADS活性，在有氧条件下表达ADS活性，抑制与口腔 龋齿有关的至少一种细菌菌株的生长，和抵抗由与口腔龋齿有关的至少一种细菌菌株对生 长的抑制，其中细菌菌株的混合物满足标准的至少两个。
[0016] 本公开内容还提供了增加生成氨的细菌在宿主的口腔中的量的方法的实施方案， 方法包括向宿主施用包含分离的细菌菌株的混合物和药学上可接受的口服载体的益生口 服组合物，其中混合物包括至少两种不同的分离的精氨酸分解细菌菌株，每种菌株能经由 精氨酸脱亚胺酶系统（ADS)生成氨并且每种菌株满足以下标准中的至少一个：在环境精氨 酸不存在下表达ADS活性，在葡萄糖的存在下表达ADS活性，在非酸性pH下表达ADS活性， 在有氧条件下表达ADS活性，抑制与口腔龋齿有关的至少一种细菌菌株的生长，和抵抗由 与口腔龋齿有关的至少一种细菌菌株对生长的抑制，其中细菌菌株的混合物满足标准的至 少两个。
[0017] 本公开内容的其他方法、组合物、植物（plants)、特征和优势对于本领域技术人员 在检查以下附图和详细描述之后将会清楚或变的清楚。意图所有此类另外的组合物、方法、 特征和优势包括于该说明书中，并且在本公开内容的范围内。
[0018] 附图简述
[0019] 回顾以下描述的本公开内容的多种实施方案的详细描述连同附图后，本公开内容 的另外的方面将更容易地被理解。
[0020] 图1示出了从牙菌斑筛选ADS阳性细菌菌株的数字图像。当奈斯勒（NessleW s) 试剂检测生成的氨时，ADS阳性表型通过黄-橙色显示。
[0021] 图2A-2D表示了一系列条形图，所述条形图示出了戈登链球菌（S. gordonii)DLl 和ADS阳性分离株在不同环境条件下的ADS活性水平。图示出了响应不同糖（图2A)、不同 pH (图2B)、精氨酸的存在或不存在（图2C)、和有氧（w/02)或厌氧（w/o O2)条件（图2D) 的ADS活性。结果表示三个独立实验的平均和标准偏差（误差线）。
[0022] 图3A-3D为一系列条形图，所述条形图示出了在不同的环境条件：不同的糖（图 3A)、不同的pH(图3B)、精氨酸的存在或不存在（图2C)、和有氧与厌氧条件（图3D)下生 长的来自龋齿活跃的和无龋齿的受试者的精氨酸分解分离株的ADS活性水平的比较。结果 表示三个独立实验的平均和标准偏差（误差线）。
[0023] 图4A-4D为一系列条形图，所述条形图示出了显示戈登链球菌DLl (图4A)和ADS 阳性分离株戈登链球菌A8 (图4B)、澳大利亚链球菌（S. australis) A12 (图4C)和血链球菌 (S. sanguinis)A33(图4D)对生长的变形链球菌（S.mutans)UA159的抑制效应的测定。
[0024] 描述
[0025] 在更详细的描述本公开内容之前，要理解该公开内容并不局限于描述的特定实施 方案，并且当然像这样可变化。还理解的是，本文使用的术语仅为了描述特定的实施方案的 目的并且不被意图是限制性的。
[0026] 在提供值的范围的情况下，应理解，该范围的上限和下限之间的每个中间值，至下 限的单位的十分之一，除非上下文另外清楚地规定，和在该陈述的范围中的任何其他陈述 的或中间的值包括在本公开内容内。这些较小的范围的上限和下限可独立地包括于所述较 小的范围，并且还包括于本公开内容内，隶属于陈述的范围的任何特定的排除性限制。在陈 述的范围包括上限和下限之一或两者的情况下，排除这些包括的限值中的任一个或两者的 范围也被包括在本公开内容中。
[0027] 除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与由本公开内容属 于的领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然在本公开内容的实践或测试中还可 以使用与本文描述的那些类似或等效的任何方法和材料，但现在描述优选的方法和材料。
[0028] 通过引用并入的在该说明书中提及的任何出版物和专利通过引用并入本文以公 开并且描述出版物关于其被提及的方法和/或材料。任何出版物的引用是为了其在提交日 之前的公开内容，并且不应被理解为承认本发明由于之前的公开内容而无权先于此类出版 物。另外，提供的出版物的日期可能不同于实际出版日期，实际出版日期可能需要独立地确 认。
[0029] 如本领域技术人员阅读该公开内容之后将清楚的，本文描述并例证的个体实施方 案中的每个具有离散的组成部分和特征，其可容易地与其它若干实施方案中的任一个的特 征分开或组合而不偏离本公开内容的范围或精神。任何所提及的方法可以以事件提及的顺 序或以逻辑上可能的任何其他顺序来进行。
[0030] 除非另有指示，本公开内容的实施方案将使用医学、牙科学、生物学、微生物学、统 计学、生物化学、分子生物学、药物学等的技术，其在本领域的技术内。此类技术在文献中被 充分地解释。
[0031] 必须注意，如在说明书和所附的实施方案中使用的，单数形式"一个（a) "、"一个 (an) "和"该（the) "包括复数指代对象，除非上下文另有清楚的指示。因此，例如关于"细 胞（a cell)"包括多个细胞。在该说明书中以及在之后的实施方案中，将涉及许多术语，其 将被定义为具有以下含义，除非相反的意向是明显的。
[0032] 在描述多个实施方案之前，提供了以下定义并且应该被使用，除非另有指示。
[0033] 定义
[0034] 在描述公开的主题时，以下术语将根据以下陈述的定义被使用。
[0035] 如本文使用的术语"核酸"指任何核苷酸和核苷的任何天然的和合成的线性和连 续排列，例如cDNA、基因组0嫩、!^熟、丨1?熟、寡核苷酸、寡核苷及其衍生物。为了便于讨论， 本文中此类核酸可共同地被称为"构建体"、"质粒"、或"载体"。本公开内容的核酸的代表 性实例包括细菌质粒载体，所述细菌质粒载体包括表达载体、克隆载体、粘粒载体和转化载 体，诸如但不限于PBR322 ;动物病毒载体，诸如但不限于修饰的腺病毒、流感病毒、脊髓灰 质炎病毒、痘病毒、逆转录病毒、昆虫病毒（杆状病毒）等；源自噬菌体核酸的载体；以及合 成的寡核苷酸，如化学合成的DNA或RNA。术语"核酸"还包括修饰的或衍生的核苷酸和核 苷，诸如但不限于卤代核苷酸，所述卤代核苷酸诸如但不只是5-溴尿嘧啶，以及衍生的核 苷酸，诸如生物素标记的核苷酸。
[0036] 术语"分离的核酸"指具有（a)与任何天然存在的核酸不同或（b)与横跨多于三个 单独的基因的天然存在的基因组核酸的任何片段不同的结构的核酸，并且包括DNA、RNA或 其衍生物或变体。该术语涵盖例如但不局限于（a)这样的DNA:具有天然存在的基因组分 子的部分的序列但是两侧无基因组分子在其中天然地存在的物种的基因组中的分子的该 部分两侧的编码序列中的至少一个；(b)以一种方式掺入载体或掺入原核生物或真核生物 的基因组核酸的核酸，以使得得到的分子不同于任何载体或天然存在的基因组DNA ; (c)单 独的分子，诸如cDNA、基因组片段、通过聚合酶链式反应（PCR)、连接酶链式反应（LCR)或化 学合成生成的片段、或限制性片段；(d)重组核苷酸序列，即杂合基因的部分，例如编码融 合蛋白的基因，以及（e)重组核苷酸序列，即非天然存在的杂合序列的部分。本公开内容的 分离的核酸分子可包括例如天然等位基因变体以及通过核苷酸缺失、插入、倒位或取代修 饰的核酸分子。
[0037] 对一些目的有利的是核苷酸序列为纯化的形式。关于核酸的术语"纯化的"表示 序列具有相对于天然的环境增加的纯度。
[0038] 本文中术语"多核苷酸"、"寡核苷酸"和"核酸序列"可互换地使用，并且包括但不 限于编码序列（在置于适当的调控或控制序列的控制下时体外或体内转录并翻译成多肽 的多核苷酸或核酸序列）；控制序列（例如翻译起始和终止密码子、启动子序列、核糖体结 合位点、多腺苷酸化信号、转录因子结合位点、转录终止序列、上游和下游调控结构域、增强 子、沉默子等）；和调控序列（转录因子结合至其并正向地（诱导）或负向地（抑制）改变 基因的启动子的活性的DNA序列）。本文描述的术语没有暗示对长度或合成起点的限制。
[0039] 如本文使用的术语"多肽"和"蛋白"指通过肽键连接的连续排列的三个或更多个 氨基酸的氨基酸的聚合物。术语"多肽"包括蛋白、蛋白片段、蛋白类似物、寡肽等。术语"多 肽"涵盖如以上定义的多肽，其由核酸编码，通过重组技术（从适当来源诸如鸟分离）生成 或为合成的。术语"多肽"还涵盖如以上定义的多肽，其包含化学修饰的氨基酸或共价地或 非共价地连接至标签配体的氨基酸。
[0040] 如本文使用的术语"片段"指核酸（例如，cDNA)，所述核酸指人工（例如，通过化 学合成）构建的主题核酸，或通过使用限制性内切核酸酶或机械剪切切割天然产物为多片 的分离的部分，或通过PCR、DNA聚合酶或本领域熟知的任何其他聚合技术合成，或通过本 领域技术人员熟知的重组核酸技术在宿主细胞中表达的核酸的部分。如本文使用的术语 "片段"还可指多肽的分离的部分，其中所述多肽的部分从天然存在的多肽由至少一种蛋白 酶通过溶蛋白性裂解而切割，或是由本领域技术人员熟知的化学方法合成的天然存在的多 肽的部分。
[0041] 如本文使用的术语"基因（gene) "或"基因（genes) "指编码用于合成整个RNA、整 个蛋白、或这样的整个RNA或整个蛋白的任何部分的遗传信息的核酸序列（包括RNA或DNA 两者）。不是特定生物体的基因组的天然部分的基因称为"外来基因"、"异源基因"或"外源 基因"，且是特定生物体的基因组的天然部分的基因称为"内源基因"。术语"基因产物"指 由该基因编码的RNA或蛋白。"外来基因产物"是由"外来基因"编码的RNA或蛋白，且"内 源基因产物"是由内源基因编码的RNA或蛋白。"异源基因产物"是通过"外来、异源或外源 基因"编码的RNA或蛋白，并因此，不在细胞中天然地表达。
[0042] 如本文使用的术语"微生物组"指微生物在宿主生物体内的生存环境。如本文使 用，"微生物组"通常指微生物（例如，细菌）生活在宿主生物体内，诸如在宿主生物体的口 腔内的群落。术语"微生物群落"同样指生活在微生物组内的集体生物体，这些术语可在本 公开内容中互换使用。术语天然微生物组还指未通过（或在改变之前）施用意图改变天然 细菌群落的组成的药物（例如抗生素或益生菌）或程序改变的宿主的细菌群落。宿主的天 然细菌群落可由于各种天然和合成的原因（例如，疾病、饮食习惯的改变、药物、医疗程序， 等）随着时间的推移发生变化。
[0043] 如本文使用的术语"分类范畴"或"分类类别"或"类别"指将生物体分类为科学确 定的分类范畴，其中它们已被分配（例如，界、门、纲、目、科、属、种、品系），或在先前未经确 认的生物体的情况下，它们将可能基于遗传学或特征的相似性根据确定的科学程序分配的 分类。"分类范畴"可以是广泛的范畴（例如，门、纲）或更窄的类别（例如，属、种），且分 类的行为可涉及多个生物体或仅一个。"类别"还可涉及将个体基于相似特征分组为范畴的 行为，但通常，在本公开内容中"分类"指分类类别，除非上下文另有指示。
[0044] 如本文使用的"品系"是指在物种水平内的分类学亚分组，其中品系是在物种内的 遗传变异体或亚型。在本公开内容中，"品系"可指具有与已知物种紧密序列同一性（例如， 约95%序列同一性，约99%序列同一性等），但可在一个或更多个特性方面不同，诸如，但 不限于，某些环境条件中的ADS活性水平的临床分离株。
[0045] "分离的细菌菌株"或"细菌分离株"指已由从天然、异质环境（例如，宿主口腔） 或微生物群体分离的细菌生物体生成并通过已知微生物学技术从它的起源环境中的其他 微生物群落分开的细菌菌株或培养物。然后分离的菌株可生长在培养基中。分离的细菌菌 株或分离的细菌菌株的培养物不一定不含所有可能的杂质，但它是细菌分离株的基本上同 质的培养物，并且可以从微生物的