专利名称：微生物酶法拆分dl-精氨酸制备d-精氨酸盐酸盐和l-鸟氨酸盐酸盐的方法
技术领域：
本发明属于生物技术生产氨基酸的技术领域，涉及通过微生物酶法拆分DL-精氨酸生产D-精氨酸盐酸盐和L-鸟氨酸盐酸盐的方法。
背景技术：
D-精氨酸(D-arginine，D-Arg)作为一种非蛋白质氨基酸，是一种重要手性试剂和医药中间体。研究表明D-精氨酸具有抗高血压的功效，作为多肽的组成氨基酸，D-精氨酸的重要生理功能还表现在可抑制癌症扩散，治疗生长激素过多释放造成的紊乱、抑制DNA 合成和抑制前列腺癌细胞增殖等方面。目前D-精氨酸的制备方法主要有(1)化学法化学法是将DL-精氨酸先与光学活性拆分剂反应生成具有旋光性的氨基酸衍生物，再水解，调节PH至氨基酸等电点，即可析出晶体。化学拆分法通常工艺路线复杂，都要先转化成氨基酸衍生物，因此步骤多、收率低，且存在拆分剂的选择、回收等问题；(2)生物转化法。生物转化法是以微生物细胞或从微生物中提取的酶作为生物催化剂，利用酶的立体选择性拆分得D-精氨酸和另一副产物，反应条件温和，转化体系中杂质较少、提取工艺简单，不产生有毒物质。已有报道的李加友等利用粪球链菌菌体内精氨酸脱亚胺酶对L-精氨酸的转移脱亚胺作用，获得D-精氨酸，同时获得附加产物L-瓜氨酸；刘均忠等采利用固定化精氨酸脱亚胺酶细胞的方法拆分DL-精氨酸，提高了酶的稳定性和重复使用批次；Makryaleas等用动物来源的精氨酸酶催化DL-精氨酸转化制备D-精氨酸与 L-鸟氨酸，但是由于他采用的精氨酸酶活力较低，且受来源限制，不能规模制备，因此不具有产业化价值。L-鸟氨酸(L-Ornithine)是生物体内普遍存在的氨基酸之一，1877年杰弗在喂养安息香酸的鸟类的尿液水解产物中发现了鸟氨酸，因此得名。鸟氨酸在生物体代谢中起到重要的作用。它是尿素形成过程中出现的氨基酸，是精氨酸、瓜氨酸等多种氨基酸代谢的前体物质，主要参与产尿毒的鸟氨酸循环，对体内聚集的氨具有解毒作用，因此鸟氨酸对人体肝脏细胞具有重大意义。在近代医药行业，L-鸟氨酸除用于制备保肝、护肝、抗疲劳、抗虚弱等各种复方氨基酸输液外，还常与精氨酸一起用于配制恢复疲劳的发泡饮料。近几年研究发现，L-鸟氨酸还可刺激脑垂体分泌生长激素，促进蛋白质合成及糖与脂肪的分解代谢，在结合运动情况下摄食鸟氨酸可减少体内脂肪堆积，增强肌肉，起到减肥保健的作用。此外， L-鸟氨酸能增加聚乙烯胺的合成，促进细胞增殖，具有提高免疫功能、抗癌功能的作用。因此，L-鸟氨酸因其多功能的保健作用而引起世人的关注。而以L-鸟氨酸为原料制备的依氟鸟氨酸，能抑制多胺合成，延缓肿瘤细胞增长，是一种很有前景的新型抗癌药物。目前，制备L-鸟氨酸的方法主要有提取法、化学法、微生物发酵法和酶法。其中(1)提取法是从细菌的膜成分及多肽类抗生素物质中提取，但是该法提取制备鸟氨酸的成本太高，且提取工艺繁琐。
(2)化学法分为有机合成法和精氨酸水解法，此法大量使用有机溶剂，且得到的 DL型混合物，回收率低，分离提纯困难。(3)微生物发酵法主要是利用L-鸟氨酸是L-精氨酸合成途径中的中间产物之一， 通过筛选精氨酸或瓜氨酸的营养缺陷性突变株来积累L-鸟氨酸。可用于鸟氨酸发酵生产的菌株主要是谷氨酸生产菌，通过谷氨酸的积累可以使代谢途径向合成精氨酸方向进行， 这样利于鸟氨酸的积累。用发酵法生产鸟氨酸原料成本低廉，但是产量不高，且发酵生产周期较长，同时由于发酵液中的成分复杂，后续分离较为困难，给实际推广应用带来了很大困难(4)酶法生产鸟氨酸就是利用动植物或微生物体内的精氨酸酶作催化剂，水解精氨酸，生成鸟氨酸和尿素，反应式如下
权利要求
1.一种微生物酶法拆分DL-精氨酸制备D-精氨酸盐酸盐和L-鸟氨酸盐酸盐的方法， 其特征在于该方法包括以表达L-精氨酸酶的基因工程重组菌的发酵菌体细胞或喷雾干燥固体酶制剂为酶源，以DL-精氨酸为底物，在30至45 °C下，pH7至11，经酶法转化反应4 至对h，产生D-精氨酸和L-鸟氨酸；将酶促生成液经减压浓缩后，加入与浓缩液中L-鸟氨酸等物质的量的浓盐酸，使产生的L-鸟氨酸转变成L-鸟氨酸单盐酸盐，然后加入3-5倍体积无水乙醇，使L-鸟氨酸单盐酸盐结晶析出，收集沉淀，得L-鸟氨酸盐酸盐；对乙醇析出结晶后的上清液，采用201X4树脂去除其中残留的尿素，经0. 1 N盐酸洗脱、减压浓缩干燥， 获得D-精氨酸盐酸盐。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，酶促反应液中，底物DL-精氨酸的加入量为20至200 g/L，酶源的添加量为500至2000 U/L。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于酶促反应液中，底物DL-精氨酸的用量优选为100 g ；酶源的添加量优选为1000 U，优选转化温度为37 °C，优选转化pHIO，优选转化时间24 h。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的表达L-精氨酸酶的基因工程重组菌的宿主菌为大肠杆菌BL21，表达载体为pET21a(+)-Arg重组表达载体。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的表达L-精氨酸酶的基因工程重组菌体细胞的喷雾干燥固体酶制剂的制备条件为保护剂为脱脂奶粉、谷氨酸钠或阿拉伯胶， 浓度范围为100-200 g/L，进口温度为140-180 °C，雾化速度范围为0. 2-0. 6 L/h，进料菌浓范围为 100-200 g/L。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于最佳喷雾干燥条件为100g/L的脱脂奶粉、谷氨酸钠或阿拉伯胶作为保护剂，进口温度为160 °C，雾化速度为0.4 L/h，进料菌浓为 100 g/L。
全文摘要
一种微生物酶法拆分DL-精氨酸制备D-精氨酸盐酸盐和L-鸟氨酸盐酸盐的方法。本发明利用高效表达L-精氨酸酶的重组大肠杆菌的发酵菌体或其喷雾干燥制剂作为酶源，以DL-精氨酸为底物，经酶促反应拆分DL-精氨酸生产D-精氨酸和L-鸟氨酸。生成液通过加入盐酸使L-鸟氨酸变成L-鸟氨酸单盐酸盐，再加入一定体积的乙醇使其析出，收集沉淀得L-鸟氨酸盐酸盐；上清中D-精氨酸的纯化方法是经离子交换树脂吸附洗脱、减压浓缩干燥，获得D-精氨酸盐酸盐；本专利提供了一种新的D-精氨酸盐酸盐和L-鸟氨酸盐酸盐的绿色生产工艺路线。
文档编号C12R1/19GK102286602SQ20111027498
公开日2011年12月21日 申请日期2011年9月16日 优先权日2011年9月16日
发明者刘磊, 王文芳, 高智慧 申请人:天津启仁医药科技有限公司