Scientific Inc.，USA)中生长。板在37°C 下在厌氧条件（85% N2、5% C02、10% H2、80%相对湿度）下温育48小时。细菌细胞通过在 冷冻微型离心机中以10, OOOx g离心板3min来收集，用IOmM Tris-马来酸盐（pH 7.0)洗 涤一次，并重悬于100 μ 1的50mM Tris-马来酸盐缓冲液（pH 6. 0)中。通过使用奈斯勒试 剂（Sigma-Aldrich Inc.，USA)检测在37°C下在50mM盐酸精氨酸的存在下温育细菌2小 时生成的氨来鉴定ADS阳性表型（图1)。用于背景和干扰的对照常规地包括在各反应中。 ADS阳性菌株的文库存储在-80°C下用于进一步分析。从该文库，从在本研究中待通过16S rRNA基因测序来鉴定和表征的各种CF和CA受试者的菌斑随机选择56个ADS阳性菌株。
[0095] 16S rRNA基因通过PCR的扩增和测序。
[0096] 来自ADS阳性细菌的基因组DNA使用QIAamp DNA微型试剂盒（Qiagen Inc.， CA, USA)根据供应商的说明来分离。16S rRNA基因在标准条件下使用通用引物组来扩增 (正向：5' -AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'（SEQ ID NO: 1)、反向 5' -TAC GGG TAC CTT GTT ACG ACT-3(SEQ ID N0:2))<a6S rRNA插入物的纯化的PCR产物使用ABI PCR条件来测 序，数据分析如Aas等人，（2005) ;Paster等人，（2001)中描述的。将PCR序列与在人口腔微 生物组数据库（Human Oral Microbiome Database) (HOMD)、核糖体数据库项目（Ribosomal Database Project)、和GenBank数据库储存的16S rRNA序列比较。本研究中生成的完整 16S rRNA基因序列从EMBL、GenBank、和DDBJ核苷酸序列数据库进行电子检索可获得。
[0097] ADS活性、生长条件和试剂。
[0098] 为确保新颖的进化型和以前未报道为ADS阳性的已知的细菌物种事实上能够代 谢精氨酸，细菌分离株的ADS活性通过使用由Liu等人（2008)验证的方案监测来自精氨酸 的瓜氨酸生成来测量。细菌分离株在BHI琼脂的新鲜培养物上保持，并在37°C下在胰蛋白 胨-酵母（TY)提取物肉汤上接种24小时，然后用于确定ADS活性的生物化学测定。56个 选择的并鉴定的ADS阳性菌株的ADS活性在以下标准生长条件下确定：包含25mM半乳糖 和IOmM精氨酸的TY培养基，在37°C下在5% 0)2下，持续24小时，Liu等人（2008)。蛋白 的浓度使用Pierce BCA蛋白测定试剂盒（Waltham, MA, USA)用牛血清白蛋白用作标准来 确定。细菌分离株的ADS活性水平标准化为蛋白含量并定义为生成的瓜氨酸的nmol [分钟 X (mg 蛋白）]1。
[0099] 为了监测AD表达作为已知诱导或抑制ADS的环境条件的函数，将不同细菌物种的 27个代表生长在TY基础培养基中。对于比较响应于不同糖的ADS活性的测定，基础培养基 还包含IOmM精氨酸和25mM半乳糖或25mM葡萄糖（图2A和3A)。对于pH比较测定（图 2B和3B)，基础培养基还包含25mM半乳糖和IOmM精氨酸，其已用HCl被酸化至pH 5. 7,或 用50MM K2HPO4-KH2PO4缓冲液（TY/50mM KPB)在pH 7.0下缓冲。对于比较精氨酸的存在 或不存在的测定（图2C和3C)，基础培养基还包含25mM半乳糖，带有或不带有IOmM精氨 酸。对于氧气比较测定（图2D和3D)，基础培养基还包含25mM半乳糖和IOmM精氨酸，培 养物在有氧或厌氧条件下温育。对于有氧生长，将细胞接种进250-ml包含补充了半乳糖和 精氨酸的40ml的TY培养基的锥形瓶中并在旋转振荡器（50rpm)上在37°C下生长（Liu和 Burne, 2011)。对于厌氧生长，培养物在厌氧培养室（85% N2、5% C02、10% H2、80%相对湿 度）中在37°C下温育24小时。所有细胞在0D600 = 0. 5-0. 6下收集用于检测ADS活性。
[0100] 统计分析。
[0101] 对于描述性分析，当适当时，计算百分比和平均值的分布。student' s t检验 或ANOVA用于检验连续变量的差异；且卡方检验用于分类变量。使用两比例Z检验（Two Proportions Z-test)，分析ADS阳性细菌菌株与总的可培养的生物体的比例和受试者的離 齿状态之间的相关性。显著水平确定在P〈〇. 05。
[0102] 结果
[0103] 口腔生物膜的精氨酸分解细菌菌株。
[0104] 总计2328个细菌菌株从14个参加的受试者（11个CF和3个CA ;分离的166. 3 个菌株/受试者的比）的菌斑样品分离并通过检测ADS活性筛选精氨酸分解能力。这些 2328个菌株的288个是ADS阳性的，其表示20. 5个菌株/受试者，或15. 8个菌株/CF受试 者（在该龋齿组内的菌株5ADS+的最小值和51ADS+的最大值），以及38个菌株/CA受试 者（在该龋齿组内的菌株6ADS+的最小值和84ADS+最大值）的比。尽管在受试者内和龋 齿组内鉴定的ADS阳性分离株的数目之间相当大的变化，存在测试的菌株跨受试者的公平 或无偏的分布。在总的可培养的菌群中的ADS阳性菌株的比例与受试者的龋齿状态之间不 存在显著相关性。
[0105] 表1显示了从龈上牙菌斑分离的并由16S rRNA基因测序鉴定的精氨酸分解物种 的多样性。鉴定的所有56种ADS阳性菌株与它们的指定的细菌类群具有大于99%的序列 相似性。来自厚壁菌门（Firmicutes)门的总计6个不同的细菌类群检测如下：血链球菌 (38% )、戈登链球菌（9% )、中间链球菌（9% )、嵴链球菌（9% )、澳大利亚链球菌（3% ) 和副血链球菌（S. parasanguinus) (2% )。
[0106] 表1. ADS阳性分离株的鉴定和AD活性。
[0110] 鉴定的56种ADS阳性菌株与它们指定的细菌类群具有大于99%的序列相似性。 提供了数据库登录号。O来自人口腔微生物组数据库（HOMD)的人体口腔分类群ID(HOT); (*)细菌菌株的ADS活性水平高于戈登链球菌DLl的ADS活性水平；ADS活性表示为生成的 瓜氨酸的nmol [分钟X (mg的蛋白）]SCF :无龋齿受试者和CA :龋齿活跃受试者；SD :标准 偏差。
[0111] 当细菌细胞在标准生长条件下温育时，细菌AD活性的谱范围从45. 2至688. 0单 位（mg蛋白）^在龋齿组之中的细菌ADS活性平均值之间不存在统计学差异。
[0112] ADS表达为环境刺激的函数。
[0113] 为了检查ADS活性在高表达者中的调控，在已知影响ADS基因在口腔细菌中的表 达的生长条件，包括低PH、氧气、精氨酸和碳水化合物的可用性下，测量AD酶活性。观察到 ADS表达模式响应pH、氧气、以及精氨酸和碳水化合物的可用性中的实质变异，如图2和3 中示出。图2C示出了，对于大多数菌株，包括实验室菌株戈登链球菌DLl，ADS的最佳表达强 烈依赖于精氨酸的存在。然而，与戈登链球菌DLl比较，菌株诸如副血链球菌AU中间链球 菌A2、中间链球菌A3、戈登链球菌A8、澳大利亚链球菌A12、和澳大利亚链球菌A13显示了 较高ADS表达，甚至在精氨酸的不存在下。还值得注意，精氨酸的可用性对呈现较低ADS活 性水平的菌株的ADS表达没有明显效应，呈现较低ADS活性水平的菌株包括血链球菌A14、 血链球菌A16、和血链球菌A20。
[0114] 已知低pH环境提高戈登链球菌DLl中的ADS活性，然而副血链球菌AU中间链球 菌A2、中间链球菌A3、戈登链球菌A8、和澳大利亚链球菌A12能够表达ADS的高水平，甚至 当在中性pH下培养细胞时（图2B)，具有在pH 5. 7下观察到的较低倍诱导水平。
[0115] 戈登链球菌DLl的ADS活性还对CCR非常敏感（Dong等人，2004)，与半乳糖中培 养的细胞比较，在葡萄糖中的生长导致5倍更低的ADS活性（Dong等人，2004)，半乳糖比葡 萄糖较不有效引发CCR。同样地，当与半乳糖中的生长比较时，葡萄糖可在许多ADS阳性菌 株中将ADS活性降低了 8至10倍（图2A)。然而，在副血链球菌Al、中间链球菌A2、中间链 球菌A3、中间链球菌A5、戈登链球菌A7、戈登链球菌A8、戈登链球菌A9、戈登链球菌AlO、戈 登链球菌All、澳大利亚链球菌A12、和澳大利亚链球菌A13中没有检测到葡萄糖对ADS活 性的可观察的抑制。
[0116] 图2D示出了，戈登链球菌DLl的ADS表达被在有氧条件下的生长高度抑制，且在 其他临床菌株中观察到类似的氧气抑制。然而，一些菌株，诸如副血链球菌Al、中间链球菌 A2、中间链球菌A3、中间链球菌A5、戈登链球菌A8、澳大利亚链球菌A12、血链球菌A41、和嵴 链球菌A55的ADS活性水平，对通气的条件中生长的抑制效应不敏感。
[0117] ADS表达和離齿状态。
[0118] 如表1中所示，在从CF和CA受试者的菌斑分离的相同物种的菌种之中观察到不 同水平的ADS活性。例如，来自CF受试者的菌株血链球菌A24[45. 2单位（mg蛋白）_1]和 来自CA受试者的A48[221. 3单位（mg蛋白）?在标准生长条件下呈现显著不同的ADS表 达。为进一步探索口腔细菌的精氨酸分解能力是否与受试者的龋齿状态相关，将响应不同 环境条件的ADS表达与从不同龋齿组分离的相同物种的临床菌株比较（图3)。选择的菌 株包括与以下具有最高16S rRNA序列相似性的那些：戈登链球菌Challis substr. CHl (Α7 和 A8)、戈登链球菌 ATCC 10558 (A10 和 All)、血链球菌 JCM 5708 (A37、A41、A48 和 A50)。
[0119] 戈登链球菌和血链球菌菌株的菌株显示了由葡萄糖对ADS表达的相似抑制（图 3A)。在来自两种龋齿的戈登链球菌和血链球菌的菌株之中还观察到由酸性pH对ADS表达 和诱导的相似模式（图3B)。图3C示出了，相同物种的大多数菌株呈现响应精氨酸的ADS 表达中的可比较差异，独立于受试者的龋齿状态。例如，与精氨酸的不存在下的生长比较， 在精氨酸的存在下，来自CA受试者的戈登链球菌A7和来自CF受试者的戈登链球菌A8两 者显示2倍更高的ADS活性。大多数菌株显示ADS被氧气抑制（图3D);除了 CF受试者的 血链球菌A41以外。
[0120] 讨论
[0121] 从口腔生物膜中的精氨酸代谢的对牙齿的酸攻击的短期缓和和对牙菌斑中可期 望的细菌的持久性的长期效应的角度，它为开发新颖抗龋齿方法提供了机会。对于将要被 用于开发策略以评价龋齿风险和控制龋齿的精氨酸分解，需要对ADS在健康和疾病中口腔 生物膜中的分布、调控和功能的深刻理解。尽管基因组测序和其他分子技术已揭示致龋 微生物群落和单独细菌物种的性质中的复杂性新水平（Aas等人，2008 ;Corby等人，2005 ; Crielaard 等人，2011 ;Mager 等人，2003 ;Russell, 2008)，已作出有限的尝试（Sissons 等 人，1988a ;Sissons等人，1988b ;Sissons等人，1994)以鉴定和表征能够生成可潜在影响口 腔生物膜的致龋性的碱的临床相关口腔生物体。在本实施例中，开发快速和简单的方案用 于筛选从牙菌斑样品分离的可培养的精氨酸分解细菌。虽然鉴定的ADS阳性细菌物种的大 多数是血链球菌和戈登链球菌的菌株，我们能够披露有助于整个口腔精氨酸分解的另外的 可培养的分类群，诸如放线菌属、芽孢杆菌属（Bacillus)、和奈瑟氏菌属（Neisseria)的物 种。连同证明在此鉴定的共生链球菌的人口腔生物膜的丰度的在先微生物学的研究（Aas 等人，2008 ;Aas 等人，2005 ;Corby 等人，2005 ;Crielaard 等人，2011 ;Dewhirst 等人，2010 ; Gross等人，2010 ;Mager等人，2003)，这些实施例中的结果揭示了，这些丰富的链球菌可能 对人口腔生物膜的精氨酸分解能力具有显著影响。重要地，本研究清楚地表明，事实上，临 床菌株的ADS响应那些特定的环境因素被调控，所述特定的环境因素对龈上生物膜的组成 和生物化学活性具有最大影响；例如碳水化合物的可用性和来源、低pH和氧气，其还是可 影响龋齿的发展的环境因素。
[0122] 与健康和疾病相关的口腔微生物群的多样性仅开始通过高通量方法来描述（Aas 等人，2008 ;Corby 等人，2005 ;Crielaard 等人，2011 ;Gross 等人，2010 ;Mager 等人，2003)。 虽然该物种或类群级别鉴定是非常有价值的（Dewhirst等人，2010)，它没有解决在口腔细 菌的给定物种内存在显著异质性的事实。基于目前的测序工作，大部分ADS阳性口腔细菌 物种是可培养的，而且大多包含丰富的口腔链球菌。不可培养的生物体也可有助于在口腔 生物膜中测量的总的精氨酸分解活性。然而，该理论不由以上结果支持，其中生成碱的潜力 与生物体不存在相关，所述生物体在本实施例中使用的条件下不可能生长以培养菌斑样品 或通常被认为是不可培养的，例如某些螺旋体。因此，不可培养的生物体对总ADS的任何贡 献很可能是微不足道的。与可培养的物种比较，不可培养的细菌物种不仅以低得多的量展 现在菌斑中（Aas 等人，2008 ;Corby 等人，2005 ;Crielaard 等人，2011 ;Gross 等人，2010 ; Mager等人，2003)，而且许多或大多数不可培养的细菌不表现为携带ADS基因。本研究通过 突出更丰富的物种在它们的调整口腔生物膜的pH并因此致龋齿潜力的能力的方面在口腔 中的表型异质性提高了进行中的口腔微生物组的努力。本研究还提出了关于碱生成中异质 性的分子基础的新颖概念，而同时生成将推进用于评估和理解口腔微生物组的致病潜力的 现有方法的知识、菌株、探针和试剂。
[0123] 在口腔生物膜中关于碱生成已知的比关于糖代谢已知的显著更少。由Skphan 于1940年首次描述了由菌斑细菌的混合群的细菌糖代谢和酸生成之间的因果关系 (Stephan, 1940) jtephan还指出，在糖挑战后检测到菌斑pH中的下降，随后是菌斑pH的逐 渐上升，最终达到稳定水平。稍后，发现龋齿活跃菌斑的稳定水平、或静止pH比无龋齿菌斑 的更酸（Margolis等人，1988a)，进一步支持酸生成和口腔龋齿之间的相关性。随后的研究 表明，菌斑pH的升高主要由于由唾液和菌斑中存在的酸敏感生物体的子集从精氨酸或尿 素的氨生成（Wijeyeweera和Kleinberg, 1989b)。Marquis提出，来自口腔生物膜中氨生成 的缓冲能力缓和PH下降的速度并允许生成碱的细菌调整它们的用于存活的生理机能的时 间（Marquis, 1995)。Kleinberg表明，碳水化合物饥饿的菌斑比浸在唾液中的菌斑更碱性， 浸在唾液中的菌斑主要在较大唾液流的区域中（Kleinberg和Jenkins，1964)，所以提出， 菌斑细菌从唾液基底生成氨比扩散力可从牙菌斑清除它们更快（Kleinberg和Jenkins， 1964)。Kleinberg还表明，菌斑pH将通过菌斑生物体的酸碱代谢来确定，菌斑生物体的酸 碱代谢转而可受菌斑厚度、生成酸和碱的生物体在菌斑中的比例、以及氮和碳水化合物底 物的相对可用性影响（Kleinberg, 1970)。
[0124] 迄今的临床研究数据支持，龋齿易感性涉及碱生成中的缺陷，且不单独酸生成，如 已被传统上假定的（Nascimento等人，2009b ;Nascimento等人，2012 ;Shu等人，2007b)。在 本实施例中，我们检查了口腔细菌菌株的异质性、ADS基因表达水平中的组成性差别、和/ 或ADS基因对由环境因素诱导或抑制的差别灵敏度，是否可说明在口腔健康中并且当龋齿 活跃明显时检测到的碱生成中的高度可变性。尽管来自无龋齿受试者的ADS阳性菌株显示 比从龋齿活跃受试者分离的那些轻微更高水平的ADS活性，在细菌ADS活性的水平和宿主 的龋齿状态之间不存在显著相关。然而，本研究检查精氨酸分解菌斑细菌的集合，或更具体 地，在密切相关的但生理多样的共生链球菌中的ADS活性，揭示了 ADS响应多个环境刺激的 相当的和令人惊讶的谱。在其中许多变量可影响微生物行为的口腔生物膜的复杂环境中， 临床菌株的精氨酸分解表达可依赖于生长条件。因此，在无龋齿受试者和龋齿活跃受试者 之间观察到精氨酸分解中的差异的基础可与以下因子的组合相关是可能的：（i) 口腔生物 膜中在ADS受环境因素的调节中具有固有差异的菌株的携带；和/或（ii