天然存在的、异质组区分开。
[0046] 如本文使用，"益生菌"指通常被医学界认为非致病性并赋予宿主健康益处的细 菌。例如，表现为具有高的ADS活性并因此促进具有龋齿的减少的发生的口腔环境，并对宿 主无毒的细菌将是本公开内容中的益生菌的非限制性实例。
[0047] 如本文使用"ADS活性"指细菌菌株经由精氨酸脱亚胺酶系统（ADS)生成呈氨的 形式的碱的能力。"ADS活性水平"指细菌菌株可经由ADS系统生成氨的量。在实施方案 中，ADS活性水平被确定为生成的瓜氨酸的纳摩尔（分钟X mg蛋白）^ "表达ADS的活性" 或"表达足够ADS的活性"指一些细菌菌株在标准生长条件下，或在一个或更多个不利环境 因素诸如，但不限于，非酸性pH、低环境精氨酸、高碳水化合物条件（例如，在葡萄糖的存在 下）、或有氧条件（例如，氧气的存在）下生长经由ADS代谢精氨酸的能力。在实施方案中， 在相同环境测定条件（例如，在"标准生长条件"或生长条件的一些其他变化）下，相对于 已知的、良好表征的ADS阳性菌株（例如，戈登链球菌DL1)的ADS活性确定菌株表达ADS 活性的能力。在实施方案中，如果在相同测定条件下，相对于戈登链球菌DLl，菌株表达大约 相同的活性、更大的活性、或ADS活性的一个设定百分比，则菌株"表达足够ADS活性"。在 其他实施方案中，在一定环境条件下，菌株表达ADS活性的能力可相对于相同菌株的ADS活 性来确定。在一些这样的实施方案中，如果，与该菌株在标准生长条件下的ADS活性比较， 其具有一定百分比的ADS活性（例如，至少约25% ADS活性，至少约40% ADS活性，至少约 50 % ADS活性，至少约75 % ADS活性等），则称菌株在环境测定条件下"表达ADS活性"。在 本公开内容中，"标准生长条件"是包含25mM半乳糖和IOmM补充精氨酸的TY培养基（胰蛋 白胨-酵母提取物肉汤），在5% 0)2下，在37°C下至在0D600+0. 5-06下的光密度。
[0048] 术语"治疗（treat) "、"治疗（treating) "和"治疗（treatment) "是用于获得有益 或期望的临床结果的方法。具体地，有益的或期望的临床结果包括，但不局限于，症状的缓 解、疾病的程度的降低、疾病的稳定化（例如，不恶化）、疾病进程的延迟、减慢或阻止、疾病 的基本上阻止传播、疾病状态的减低、改善或缓和、以及缓解（部分的或全部的），无论是可 检测的或不可检测的。另外，"治疗（treat) "，"治疗（treating)"和"治疗（treatment)" 还可以是在部分或完全治愈疾病和/或由疾病引起的副作用方面的疗法。关于龋齿，"治 疗"包括减少龋齿损伤的外观和减缓或阻止龋齿损伤的进展（例如，减缓或停止损伤的生长 或严重性）。"治疗"还包括"预防"/ "预防性治疗"。如本文所用，术语"预防"、"预防性治 疗（prophylactically treat) "或"预防性治疗（prophylactically treating) "指在宿主 中完全地、基本上、或部分预防疾病/状况或其一种或更多种症状。同样地，"延迟状况的发 作"还可以包含在"预防性治疗"中，并指增加状况在易患状况的患者中实际发作前的时间 的行为。关于龋齿，"预防"或"预防性治疗"可包括预防宿主中新龋齿损害的外观。
[0049] "施用"意指将本公开内容的化合物引入进受试者；其还可指向受试者提供本公开 内容的组合物的行为（例如，通过处方）。本公开内容的组合物的施用的优选的途径是口 月艮。然而，可使用将有助于组合物治疗宿主的口腔状况的任何施用途径。
[0050] 术语"生物体"、"受试者"或"宿主"指需要治疗的任何活的实体，包括人、哺乳动物 (例如，猫、狗、马、鸡、猪（pigs)、阉猪（hogs)、牛和其他家畜），以及需要治疗的其他活的物 种。特别是，该术语"宿主"包括人。如本文使用，术语"人宿主"或"人受试者"通常用于指 人宿主。在本公开内容中，术语"宿主"通常指人宿主，所以当在本公开内容中单独地使用 时，该词"宿主"指人宿主，除非上下文清楚地指明意图指示非人宿主。"易患"状况的宿主 可定义为不显示这些状况的一个或更多个的明显症状，但在遗传上、生理上或以其他方式 处于发展这些状况的一个或更多个的风险的宿主。
[0051] 如本文使用，以下术语具有归于它们的含义，除非另有说明。在本公开内容中，"基 本上由......组成"或"基本上包括"或类似的，当应用于被本公开内容包括的方法和组合 物时，指像本文公开的那些的组合物，但其可包含另外的结构基团、组合物组分或方法步骤 (或其类似物或衍生物，如以上讨论的）。然而，与本文公开的相应组合物或方法的那些比 较，这样的另外的结构基团、组合物组分或方法步骤等，实质上不影响组合物或方法的基本 和新颖特征。"基本由......组成"或"基本上包括"或类似的，当应用于被本公开内容包 括的方法和组合物时，具有归于美国专利法的含义，且术语是开放式的，允许比被提及的更 多的存在，只要被提及的基本或新颖特征不被被提及的更多的存在改变，但不包括现有技 术实施方案。具体地，关于本公开内容的精氨酸分解细菌菌株的混合物，"基本上由...组 成"指示，除了具有列出的标准的那些以外，较少量的其他细菌菌株可以以较少量存在，但 它们不影响混合物的总体功能，且不影响混合物的精氨酸分解活性。
[0052] 讨论
[0053] 本公开内容的实施方案包括益生、精氨酸分解口服组合物，制备用于口服用途的 精氨酸分解细菌菌株的混合物的方法，用于在患者中治疗和/或预防口腔龋齿和减慢和/ 或阻止龋齿损伤的进展的方法，以及用于增加宿主的口腔中精氨酸分解细菌的量和增加宿 主的口腔中氨生成的方法和组合物。本公开内容的实施方案包括包含精氨酸分解细菌菌株 的混合物的组合物。在实施方案中，组合物是益生口服组合物。
[0054] 支持碱生成在口腔生态和抑制口腔龋齿的作用的体外和临床观察的证据继续累 积（Dawes 和 Dibdin, 2001 ;Margolis 等人，1988b ;Nascimento 等人，2009a ;Peterson 等人， 1985 ;Shu等人，2007a ;Wijeyeweera和Kleinberg, 1989a)。口服精氨酸代谢和離齿活跃的 不存在之间的正相关性已在成人中（Nascimento等人，2009a)，且最近在儿童中被临床证 实（Nascimento等人，2012)。具体地，与来自龋齿活跃受试者的那些比较，来自无龋齿受 试者的牙菌斑的口腔细菌呈现较高的ADS活性。在个体间在氨生成速率方面存在高度变异 性，在一些情况中大于1000倍。使用口腔链球菌的实验室菌株的在先研究表明，ADS基因 的表达是底物可诱导的，对碳分解代谢物阻遏（CCR)敏感的，以及在低pH下和厌氧条件茁 壮生长。特定和全局转录调节因子，多个双组分系统（TCS)和其他因素已显示通过转录和 转录后机制来调节ADS活性（Burne, 1991 ;Dong等人，2004 ;Liu和Burne, 2009 ;Liu等人， 2008)。体外研究表明，龋齿病菌变形链球菌的遗传修饰菌株的氨生成能力中少至五倍的减 少导致通过糖酵解抵消环境酸化的能力的损失（Clancy等人2000)。因此，许多个体可缺乏 足够的ADS活性，以中和禁食期间或在致龋挑战后的牙菌斑。因此，菌斑细菌的ADS活性可 影响静止和碳水化合物挑战菌斑的pH曲线，并且因此，龋齿发展的风险。
[0055] 口腔生物膜的微生物组成中的差异和ADS的差异表达是影响来自不同个体的口 腔样品代谢精氨酸的能力的最可能的因素。在先临床研究中qPCR的使用（Nascimento等 人，2009a)未揭示两种公认的精氨酸分解物种血链球菌和戈登链球菌的比例与成人龋齿状 态之间统计上显著的相关。这些结果表明，与龋齿经历相关的ADS活性的减少可以不是简 单由于减少已知ADS阳性细菌的比例，且还提高除了检查的那些以外的物种可有助于整体 口腔ADS活性的可能性。环境条件和宿主因素支持在龋齿活跃与无龋齿受试者中ADS的差 异表达也是可能的。因此，在本公开内容中，有助于口腔中精氨酸分解的生物体被更彻底地 表征和研究。鉴于对口腔精氨酸分解细菌群落的基本微生物学和生态学以及其与口腔健康 和口腔龋齿的关系的新的洞察，以下实施例显示来自无龋齿和龋齿活跃成人受试者的龈上 牙菌斑的精氨酸分解细菌菌株的分离和表征，以及这些分离株对环境刺激的响应。
[0056] 如以上简要和以下更详细讨论的，一些细菌具有经由精氨酸脱亚胺酶系统（ADS) 生成氨的能力。当在宿主（特别是宿主的口腔）中发现时，这样的"精氨酸分解"细菌，可有 益于增加宿主的口腔中的氨生成，从而提供用于减少龋齿的发生的环境因素。在无龋齿个 体的口腔生物膜中更普遍地发现了一些这样的细菌菌株。如以下所述，实施例中的研究鉴 定能够ADS活性的多种细菌菌株并描述用于鉴定能够ADS活性的多种菌株的方法。另外， 以下实施例中描述的研究进一步鉴定并描述在传统上与ADS活性减少相关的条件的存在 下如何鉴定能够保持ADS活性的细菌菌株。许多这样的条件还与龋齿的较高发生率相关。 因此，鉴定满足一定标准并在一定条件的存在下表达ADS活性的菌株的能力有益于增加宿 主中这些细菌的水平，以及用于治疗、预防、减缓或阻止患者中龋齿的发生的方法。在实施 方案中，鉴定为具有ADS活性并在一定条件下表达ADS活性的一些菌株可被包括在益生口 服组合物中。这样的组合物可用于以下实施方案中：本公开内容的增加生成氨细菌在宿主 的口腔中的量的方法，治疗或预防龋齿的方法，和/或减缓或阻止具有龋齿的患者中的龋 齿损伤的进展的方法。
[0057] 益牛口服组合物:
[0058] 因此，本公开内容提供了包含细菌菌株的混合物的益生口服组合物，其中该混合 物包含至少两种不同的分离的精氨酸分解细菌菌株。混合物中至少两种分离的精氨酸分解 细菌菌株的每个能够经由精氨酸脱亚胺酶系统（ADS)生成氨，并且每个菌株满足至少一个 ADS相关的标准。在实施方案中，ADS相关的标准包括但不限于，以下：在补充精氨酸的不存 在下表达ADS活性（其中"补充精氨酸"是加入基本生长培养基的精氨酸（除了生长培养 基中天然存在的精氨酸以外），（例如，大于约5mM的精氨酸）），在葡萄糖的存在下表达ADS 活性（例如，将葡萄糖加入至基本生长培养基），在非酸性pH中表达ADS活性（例如，至少 约7的pH)，在有氧条件下表达ADS活性（例如，在另外的氧气的存在下），抑制与口腔龋齿 相关的至少一种细菌菌株的生长，和抵抗由与口腔龋齿相关的至少一种细菌菌株对生长的 抑制。在本公开内容的益生口服组合物的实施方案中，以上标准的至少两个由细菌菌株的 混合物来满足，并且混合物中的每个细菌菌株可满足多于一个的标准。
[0059] 由于与口腔龋齿相关的大多数细菌物种不是精氨酸分解性的，在这样的物种之间 将不可能存在大量的重叠。然而，为了澄清，在实施方案中，分离的精氨酸分解细菌菌株的 混合物特别排除来自与口腔龋齿相关的细菌物种的任何细菌菌株（例如，变形链球菌等）。 在本公开内容的口服组合物的组成的实施方案中，混合物由至少两种不同的分离的精氨酸 分解细菌菌株组成，每个菌株能够经由ADS生成氨，且每个菌株满足以上列出的标准的至 少一个。
[0060] 本公开内容的益生组合物还可包括药学上可接受的口服载体，诸如，但不限于， 水，其他药学上可接受的液体、凝胶、粉末，等。组合物可配制为口服制剂，诸如，但不限于， 液体漱口水、口腔喷剂、凝胶剂、糊剂（例如，牙膏），某些食品，糖果/薄荷糖、口香糖或咀嚼 片，等。制备这样的制剂的方法是药理学和/或配料领域技术人员已知的。
[0061] 在实施方案中，用于混合物的细菌菌株可选自被鉴定或能够通过在下面描述的显 示ADS活性的本公开内容的方法鉴定的任何ADS阳性细菌。在实施方案中，精氨酸分解细 菌菌株可选自，诸如，但不限于，在显示ADS活性的以下表1和2中鉴定的那些菌株。在实 施方案中，ADS活性是至少约225单位（mg蛋白）\至少约250单位（mg蛋白）\至少约 275单位（mg蛋白）\至少约300单位（mg蛋白）\等，如通过ADS测定法在标准生长条件 下，诸如下面实施例1中所述的ADS测定测量的。简言之，ADS测定的实施方案包括通过监 测从精氨酸生成的谷氨酸来测量活性，如在下面实施例1中所述的。细胞通过离心收获，用 IOmM Tris-马来酸盐缓冲液（pH6. 8)洗涤并使用在同样的缓冲液中的1/10原培养物体积 重新悬浮。细胞通过用甲苯涡旋它们来透化，并通过以18, OOOx g离心来收集。将上清液 丢弃，并将沉淀重悬于IOmM Tris-马来酸盐缓冲液中，并用于在包含20nM精氨酸、IOmM己 酸、和50mM Tris-马来酸盐缓冲液（pH 6.0)的反应混合物中测量AD活性。确定每个测定 中使用的蛋白的浓度，如实施例1中所述。
[0062] 在一些实施方案中，ADS活性与在标准生长条件下良好表征的实验室菌株戈登链 球菌 DLl (戈登链球菌（Streptococcus gordonii)(菌株 Challis/ATCC 35105/CH1DL1/ V288))在标准生长条件下的ADS活性至少约相同。在一些实施方案中，ADS活性是在标准 生长条件下至少约300nmol的瓜氨酸（分钟X(mg的蛋白）） 1 (见表1:约339. 3+/-33. 0的 戈登链球菌DLl的ADS活性）。在一些实施方案中，用于混合物的细菌菌株具有戈登链球 菌DLl在标准生长条件下的活性的约50%至约100%的ADS活性。在一些实施方案中，细 菌菌株的ADS活性小于戈登链球菌在标准生长条件下的ADS活性，但大于戈登链球菌在其 他环境条件下的ADS活性，如在下面更详细描述的。
[0063] 在本公开内容的益生口服组合物的一些实施方案中，细菌菌株选自来自以下物种 的细菌的精氨酸分解菌株：包括，但不限于，副血链球菌（Streptococcus parasanguinis)、 中间链球菌（Streptococcus intermedius)、戈登链球菌、澳大利亚链球菌、血链球菌、和嵴 链球菌（Streptococcus cristatus)。在实施方案中，细菌菌株选自与以下菌株具有至少 99 %的序列相似性的精氨酸分解菌株：副血链球菌PT010 (登录号⑶561390. 1)、中间链球 菌〇270(登录号0?003858.1)、戈登链球菌8廿.0^11丨8 813118廿.011(登录号48690250.1)、 戈登链球菌 str. Challis sbustr. CHl (登录号 NR_074516. 1)、戈登链球菌 ATCC 10558(登 录号AY485606. 1)、澳大利亚链球菌Al-I (登录号JX861483. 1)、血链球菌JCM 5708 (登录 号AB596946. 1)、和嵴链球菌R)329(登录号AY005047. 1)。在一些实施方案中，益生口服组 合物包括选自在下面表1 (实施例1)中鉴定的以下菌株的细菌菌株：副血链球菌AU中间 链球菌A2、中间链球菌A3、中间链球菌A5、戈登链球菌A7、戈登链球菌A8、戈登链球菌A9、 戈登链球菌AlO、戈登链球菌Al 1、澳大利亚链球菌Al 2、澳大利亚链球菌Al 3、血链球菌A41、 和嵴链球菌A55。
[0064] 在实施方案中，混合物中的至少一种菌株在葡萄糖（例如，葡萄糖（例如，约25mM 葡萄糖）代替生长培养基中的半乳糖）的存在下表达ADS活性。在实施方案中，为混合物 选择的在葡萄糖的存在下表达ADS活性的细菌菌株具有相同葡萄糖条件下戈登链球菌DLl 的ADS活性的至少大约水平、或更大，或在相同葡萄糖条件下戈登链球菌的ADS活性的至 少约50%、至少约75%、至少约90%、至少约100%。在一些实施方案中，在加入的葡萄糖 条件（例如，25mM葡萄糖代替半乳糖加入至生长培养基）下混合物中表达ADS活性的至少 一种菌株具有相同菌株在标准生长条件下的ADS活性的至少约25%。在实施方案中，在加 入的葡萄糖条件下表达ADS活性的菌株具有相同菌株在标准生长条件下的ADS活性的至 少约40%、至少约50%、至少约75%、等等。在实施方案中，在葡萄糖的存在下表达ADS活 性的菌株选自来自以下细菌物种的菌株，包括，但不限于：副血链球菌、中间链球菌、戈登链 球菌、和澳大利亚链球菌。在实施方案中，细菌菌株选自与以下菌株具有至少99 %的序列 相似性的精氨酸分解菌株：副血链球菌PT010 (登录号⑶561390. 1)、中间链球菌C270 (登 录号 CP003858. 1)、戈登链球菌 str. Challis sbustr. CHl (登录号 AB690250. 1)、戈登链 球菌 str. Challis sbustr. CHl (登录号 NR_074516. 1)、戈登链球菌 ATCC10558(登录号 AY485606. I)、和澳大利亚链球菌Al-I (登录号JX861483. 1)。在葡萄糖的存在下表达大于 DLl (例如，ADS&