gt;约52. 5单位）的ADS活性的一些代表性细菌菌株包括但不限于以下菌株： 副血链球菌Al、中间链球菌A2、中间链球菌A3、中间链球菌A5、戈登链球菌A7、戈登链球菌 A8、戈登链球菌A9、戈登链球菌AlO、戈登链球菌Al 1、澳大利亚链球菌A12、和澳大利亚链球 菌 A13。
[0065] 在实施方案中，混合物中的至少一种菌株在非酸性pH(例如，pH至少约7)中表达 ADS活性。在实施方案中，为混合物选择的在非酸性pH下表达ADS活性的细菌菌株具有相 同PH条件下与戈登链球菌DLl的ADS活性至少大约水平、或更大，或在相同pH条件下戈登 链球菌DLl的ADS活性的至少约75%。在实施方案中，在相同pH条件下细菌菌株具有戈 登链球菌DLl的ADS活性的至少约50%。在一些实施方案中，混合物中在非酸性pH下表 达ADS活性的至少一种菌株具有相同菌株在标准生长条件下，或在约5. 7的酸性pH下的 ADS活性的至少约50%。在实施方案中，在非酸性葡萄糖条件下表达ADS活性的菌株具有 相同菌株在标准生长条件下，和/或具有约5. 7的酸性pH下的ADS活性的至少约40%、至 少约50 %、至少约75 %等。在实施方案中，在非酸性pH下表达ADS活性的菌株选自来自以 下细菌物种的菌株，包括，但不限于：副血链球菌、中间链球菌、戈登链球菌、和澳大利亚链 球菌。在实施方案中，细菌菌株选自与以下菌株具有至少99%的序列相似性的精氨酸分解 菌株：副血链球菌PT010 (登录号⑶561390. 1)、中间链球菌C270(登录号CP003858. 1)、戈 登链球菌str. Challis sbustr. CHl (登录号NR_074516. 1)、和澳大利亚链球菌Al-I (登录 号JX861483. 1)。在非酸性pH下表达大于DLl: (ADS>约344. 5单位）的ADS活性的一些代 表性细菌菌株包括，但不限于以下菌株：副血链球菌AU中间链球菌A2、中间链球菌A3、戈 登链球菌A8、和澳大利亚链球菌A12。
[0066] 在实施方案中，混合物中的至少一种菌株在补充精氨酸（例如，少于约5mM精氨酸 加入至生长培养基）的不存在下表达ADS活性。在实施方案中，在补充精氨酸的不存在下 表达ADS活性的细菌菌株在相同精氨酸缺乏条件下具有如戈登链球菌DLl的ADS活性的至 少水平、或更大，或具有在相同精氨酸缺乏条件下戈登链球菌DLl的ADS活性的至少40%、 至少50%、至少75%等。在实施方案中，在补充精氨酸的不存在下表达ADS活性的菌株具 有相同菌株在标准生长条件下的ADS活性的至少约60%。在实施方案中，在补充精氨酸的 不存在条件下表达ADS活性的菌株具有相同菌株在标准生长条件下的ADS活性的至少约 40 %、至少约50 %、至少约75 %等。在实施方案中，在环境精氨酸的不存在下表达ADS活性 的菌株选自来自以下细菌物种的菌株，包括，但不限于：副血链球菌、中间链球菌、戈登链球 菌、和澳大利亚链球菌。在实施方案中，细菌菌株选自与以下菌株具有至少99%的序列相 似性的精氨酸分解菌株：副血链球菌PT010 (登录号⑶561390. 1)、中间链球菌C270 (登录 号 CP003858. 1)、戈登链球菌 str. Challis sbustr. CHl (登录号 NR_074516. 1)、和澳大利亚 链球菌Al-I (登录号JX861483. 1)。在环境精氨酸的不存在下表达大于DLl (ADS>约232. 5 单位）的ADS活性的一些代表性菌株包括，但不一定限于以下：副血链球菌AU中间链球菌 A2、中间链球菌A3、戈登链球菌A8、澳大利亚链球菌A12和澳大利亚链球菌A13。
[0067] 在实施方案中，混合物中的至少一种菌株在有氧条件（例如，在02的存在下，例如 由搅拌诱导的通气，诸如旋转振动器）下表达ADS活性。在实施方案中，在有氧条件下表 达ADS活性的细菌菌株具有相同氧合处理下戈登链球菌DLl的ADS活性的至少水平、或更 大，或在相同氧合处理下具有戈登链球菌DLl的ADS活性的至少60%、75%、90%等。在实 施方案中，在有氧条件下表达ADS活性的菌株具有相同菌株在标准生长条件下无通气（例 如，在厌氧室中）的ADS活性的至少约60%。在实施方案中，在有氧条件下表达ADS活性 的菌株具有相同菌株在标准生长条件下无通气的ADS活性的至少约40%、至少约50%、至 少约75%、至少约100%等。在实施方案中，在有氧条件下表达ADS活性的菌株选自来自以 下细菌物种的菌株，包括，但不限于：副血链球菌、中间链球菌、戈登链球菌、澳大利亚链球 菌、血链球菌、和嵴链球菌。在实施方案中，细菌菌株选自与以下菌株具有至少99%的序列 相似性的精氨酸分解菌株：副血链球菌PTOlO (登录号⑶561390. 1)、中间链球菌C270 (登 录号0?003858.1)、戈登链球菌8廿.0^11丨8 813118廿.011(登录号冊_074516.1)、澳大利亚 链球菌Al-I (登录号JX861483. 1)、血链球菌JCM 5708 (登录号AB596946. 1)、和嵴链球菌 R)329 (登录号AY005047. 1)。在有氧条件下表达ADS活性大于DLl (例如，ADS>14. 4单位） 的代表性细菌菌株包括，但不限于以下：副血链球菌AU中间链球菌A2、中间链球菌A3、中 间链球菌A5、戈登链球菌A8、澳大利亚链球菌A12、血链球菌A41、和嵴链球菌A55。
[0068] 在本公开内容的益生口服组合物的实施方案中，其中细菌菌株抑制与口腔龋齿相 关的至少一种细菌菌株的生长，和/或抵抗由与口腔龋齿相关的至少一种菌株对生长的抑 制，与口腔龋齿相关的细菌菌株可以是，但不限于，变形链球菌的一种或更多种菌株。与口 腔離齿相关的其他细菌菌株包括，但不限于，远缘链球菌（Streptococcus sobrinus)、各种 乳杆菌属物种、某些Scardovia物种和一些放线菌属物种。
[0069] 在本公开内容的实施方案中，益生组合物还可包括一种或更多种化合物以增加细 菌菌株的ADS活性。例如，这样另外的化合物可以是可改变口腔环境的一个方面，以使环境 更有利于ADS活性的物质。在实施方案中，增加细菌菌株的ADS活性的一种或更多种化合 物可包括，但不限于：半乳糖、精氨酸、包含精氨酸多肽类和蛋白（例如源于食品的那些）或 酸性化合物。在本公开内容的实施方案中，益生组合物包括精氨酸。将理解，由于这些组合 物将口服施用至宿主，组分应该是药学上和生物学上可接受的（例如，通常认为是安全、无 毒的，等）。
[0070] 其他组分可被括在本公开内容的口服益生组合物中，以改进组合物的性能或其他 方面的（诸如味道、气味、口感等）。将理解，包括在本公开内容的组合物的实施方案中的细 菌菌株是分离的菌株且不仅仅是从天然环境获得且直接放置在口腔组合物中的样品。
[0071] 诜择用于口服用涂的精氨酸分解细菌菌株的方法:
[0072] 本公开内容还提供了鉴定并选择精氨酸分解细菌菌株的方法以及制备用于在宿 主中口服使用的精氨酸分解细菌菌株的混合物的方法。在实施方案中，方法包括获得从口 腔样品（例如，从宿主，诸如无龋齿宿主采集的样品）分离的多个细菌菌株。由多个细菌菌 株，进行测定以鉴定并分离能够经由精氨酸脱亚胺酶系统（ADS)生成氨的精氨酸分解细菌 菌株。这样的方法的实施方案描述在下面的实施例中。分离和选择ADS阳性菌株后，可进行 一个或更多个另外的测定，以鉴定能够在通常不利于宿主中精氨酸生成和/或有利于龋齿 的环境条件中表达ADS活性的精氨酸分解细菌菌株。在实施方案中，使用测定以模拟这样 的环境条件用于鉴定和选择在这样的条件下表达ADS活性的细菌分离株。在实施方案中， 环境测定条件包括，但不限于，环境精氨酸的不存在、葡萄糖的存在、非酸性PH、有氧条件、 以及与口腔龋齿相关的至少一种细菌菌株的存在。在实施方案中，与口腔龋齿相关的细菌 菌株是变形链球菌。在实施方案中，为这样的条件，对在前述步骤中鉴定的ADS阳性细菌的 菌株单独地进行一种或更多种测定。方法还包括，选择在环境条件测定步骤中鉴定的至少 两种不同的分离的精氨酸分解细菌菌株，以及使用选择的菌株制备在至少两种选择的环境 条件下表达ADS活性的精氨酸分解细菌的混合物。
[0073] 如前所述确定了菌株的ADS活性和菌株在各种条件下表达ADS活性的能力（例 如，相对于相同菌株在标准生长条件下的ADS活性的某一％和/或相对于实验室菌株戈登 链球菌DLl在与选择的菌株相同的环境条件的ADS活性）。
[0074] 选择菌株后，可制备在不同环境条件下具有ADS活性的菌株的各种混合物。然后 这样的混合物可用于制备以上描述的本公开内容的益生口服组合物。混合物可与能够增加 细菌菌株的ADS活性的一种或更多种化合物（例如，精氨酸、半乳糖、酸性化合物等）组合。
[0075] 伸用方法
[0076] 以上描述的组合物可以影响宿主的口腔环境的多种方式使用。在实施方案中，组 合物可用于增加生成氨的细菌在宿主的口腔中的量，以增加宿主的口腔中的氨生成，和/ 或以治疗患者，包括儿童和成人两者中的口腔龋齿。
[0077] 例如，在实施方案中，本公开内容的组合物可施用至宿主，以增加生成氨的精氨酸 分解细菌在宿主的口腔中的量。在实施方案中，可在当宿主的口腔环境最不可能有利于ADS 活性时的时间期间施用组合物，以增加 ADS活性的潜力和减少产生有利龋齿的环境的潜 力。例如，可在餐（例如，高碳水化合物餐）后，或睡前施用组合物。在实施方案中，施用益 生口服组合物增加生成氨的细菌的量至大于在施用组合物前宿主的口腔中存在的量。生成 氨的细菌的增加的量可维持仅短的时间段（例如，几小时），或其可持续较长时间（例如，几 小时至几天）。时间长度可取决于组合物的制剂（例如，应用至口腔/牙齿表面的口腔清洗 剂或口腔喷雾与耐唾液凝胶或糊剂或持久的口香糖或锭剂）。即使生成ADS的细菌的较高 水平持续相对短的时间，以最佳时机，这应该仍足以在提供更健康的口腔环境以阻止龋齿 生长方面向宿主提供益处。
[0078] 在实施方案中，相对于在施用益生口服组合物之前氨生成的量，增加生成氨的细 菌在宿主的口腔中的量的方法还增加了宿主的口腔中的氨生成。
[0079] 在其他实施方案中，组合物可施用至已具有口腔龋齿的历史，或具有口腔龋齿的 活跃情况的易患口腔龋齿的患者以帮助治疗或预防患者中的口腔龋齿。在实施方案中，组 合物可施用至具有活跃口腔龋齿的宿主以减缓或阻止龋齿损伤的进展。
[0080] 本公开内容的组合物可根据由他们的牙齿护理提供者所确定的方案施用至患者。 在本公开内容的实施方案中，组合物可以以单一剂量施用或其可以以定期重复时间表施 用。在一些实施方案中，组合物可在常规牙科就诊期间，诸如当用于预防时来施用。在又其 他实施方案中，组合物可以以用于在定期的基础上施用持续时间段，诸如每日、每周，或一 些其他定期时间表持续时间段诸如数周、数月等的自施用口服制剂的形式提供至患者。在 一些实施方案中，这样的方案可实施用于具有活跃龋齿、龋齿的历史、或认为处于龋齿发展 的风险的患者。本公开内容的组合物的量、时机、和给药可由患者的口腔健康提供者为每个 患者来确定，或由口腔健康协会或指南建议。
[0081] 在下面的实施例中提供了有关本公开内容的测试和方法的另外的详细内容。下面 的具体实施例将被解释为仅说明性的，并不以任何方式限制本公开内容的其余部分。无需 进一步详尽说明，认为本领域的技术人员可基于本文的描述，利用本公开内容至其最大程 度。本文中列举的所有出版物通过引用以其整体并入本文。
[0082] 应该强调，本公开内容的实施方案，特别是，任何"优选的"实施方案，仅是实施的 可能示例，仅阐述用于本公开内容的原理的清楚理解。可对本公开内容的以上描述的实施 方案进行许多变化和修改，而基本上不偏离本公开内容的精神和原则。所有这样的修改和 变化意图在本文中被包括在本公开内容的范围内，并受以下实施方案保护。
[0083] 提出以下实施例，以便对本领域普通技术人员提供如何进行本文公开的组合物和 化合物的方法和用途的完整的公开内容和描述。已经做出努力以确保关于数字（例如量、 温度等）的准确性，但应该考虑某些误差和偏差。除非另外指明，否则份数是重量份数，温 度是以°C，并且压力是在大气压或接近大气压。标准温度和压力定义为20°C和1个大气压。
[0084] 应注意，比率、浓度、量和其他数值数据可以以范围格式在本文中表示。应该理解， 为方便和简洁，使用这样的范围格式，并且因此，应该以灵活的方式解释为不仅包括明确列 举作为范围的界限的数值，而且还包括在该范围内包括的所有单独的数值或子范围，如同 每个数值和子范围被明确地列举。为了说明，"约〇. 1%至约5%"的浓度范围应被解释为不 仅包括约〇. lwt%至约5wt%的明确列举的浓度，而且还包括在指示的范围内的单独的浓 度（例如，1%、2%、3%、和4%)以及子范围（例如，0·5%、1· 1%、2.2%、3.3%、和4.4%)。 在一个实施方案中，术语"约"可根据数值的有效数字包括传统四舍五入。 实施例
[0085] 现在已大体上描述了本公开内容的实施方案，以下实施例描述本公开内容的一些 另外的实施方案。尽管本公开内容的实施方案结合以下实施例和相应的文字和附图进行描 述，但不意图限制本公开内容的实施方案至本说明书。相反，意图覆盖在本公开内容的实施 方案的精神和范围内包括的所有的替换、修改、以及等同物。
[0086] 实施例1
[0087] 人口腔生物膜的精氨酸分解微生物群落的表征
[0088] 引言
[0089] 本实施例描述了来自无龋齿和龋齿活跃受试者的精氨酸分解细菌物种的分离和 表征。通常与口腔健康相关的口腔细菌的选择的组能够经由精氨酸脱亚胺酶系统（ADS)以 氨的形式生成碱，其具有对人口腔生物膜的PH的深远影响。口腔龋齿的增加的风险已与口 腔生物膜中细菌的减少的ADS活性相关。在本实施例中，来自无龋齿（CF)和龋齿活跃（CA) 成人的牙菌斑样品的精氨酸分解细菌菌株被分离和表征，以研究个体之间的菌斑ADS活性 中的差异基础。五十种ADS阳性细菌菌株通过16S rRNA基因测序来鉴定，并在标准生长条 件下比较它们的ADS活性水平。细菌的AD活性谱范围从45. 2至688. 0单位（mg蛋白）、 血链球菌是最普遍的物种/进化型。在诱导或抑制ADS基因表达的条件下使用27个ADS 阳性菌株进行生物化学测定，显示响应pH、氧气、和碳水化合物或精氨酸的可用性的精氨酸 分解活性中的差异。本研究揭示了，在临床分离株中观察到的广谱精氨酸分解表达的基础 至少部分地可归因于物种内或之间的ADS的表达调控的差异。结果提供了对口腔生物膜的 ADS能力中受试者间差异的微生物学基础的深刻理解，并提高我们对口腔龋齿为生态驱动 疾病的理解，其中精氨酸代谢缓和菌斑PH且促进口腔健康，并且提供了用于鉴定用于益生 组合物和用途的细菌的方法。
[0090] 材料和方法
[0091] 细菌菌株的分离。
[0092] 从没有现在或过去龋齿经历的临床或报道的证据[腐烂、缺失和填充的牙齿 (DMFT) =0]的11个无龋齿（CF)受试者和具有至少四个活跃、形成空洞的（牙质水平） 和未恢复的龋齿损伤（DT多4, MFT多0)的3个龋齿活跃（CA)受试者收集龈上牙菌斑，如 Nascimento等人，（2009a)和Schulte等人，（2009)所述的。離齿损伤的活性通过临床表现、 菌斑停滞、和触觉来确定。为了获得多种可培养的微生物群落，菌斑样品通过外部超声处理 (W375, Sonicator Heat Systems-Ultrasonics Inc，Farmingdale, NY, USA) 15秒的 2个循环 来分散，在间隔期间在冰上冷却。然后样品以IOmM磷酸钠缓冲液（PH7.0)连续地稀释，并 且100 μ 1的10 4至10 7稀释的样品在绵羊血琼脂（She印Blood Agar)平板（包含5%的 抗凝结绵羊血的哥伦比亚琼脂（Columbia Agar)，Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) 上和脑心浸液（BHI)琼脂平板（Difco Laboratories，Detroit, MI, USA)上培养。平板在 37°C下在厌氧罐（BBL GasPak? Systems, BD, Sparks, MD, USA)中温育 3 天，随后在 37°C 下 在5% CO2中有氧温育2天。温育阶段后，代表所有形态类型的临床分离株的菌落在相同培 养基上再次培养直到获得纯的菌落。
[0093] ADS阳性菌株的筛选
[0094] 以基于微量滴定的测定筛选细菌菌株从精氨酸释放氨的潜力（Schulte等人， 2009)。简言之，菌株在包含具有2%半乳糖和IOmM精氨酸的基于胰蛋白胨-维生素（TV) 的肉汤的透明的聚苯乙稀微量滴定板（Fisher