燥颗粒。图5中黑色箭头所示的即为丝素蛋白颗粒，该颗粒均匀而紧固定地交联着细菌纤维素纤维，是一种化学键的结合。在其他的实施方式中，例如每500ml发酵培养基中含有经喷雾干燥获得的丝素蛋白颗粒含量选自4g，5g，7g，8g之一，并进行复合生物材料支架地制备。经过电镜扫描图分析，所得到的丝素蛋白复合生物材料支架的电镜结构显示丝素蛋白颗粒均匀而紧固定地交联着细菌纤维素纤维，是一种化学键的结合。
[0080]实施例12本发明培养过程中的pH变化情况及红外图谱分析
图6是利用本发明所述的制备方法将木醋杆菌在含有丝素蛋白的发酵培基中进行发酵培养时的PH值日变化图，从图中可以看到培养基会逐渐呈现酸性，pH值可达到3。在酸性环境下，非常有利于细菌纤维素中的羟基与丝素蛋白上的羧基发生缩合反应，从而使细菌纤维素和丝素蛋白间通过化学键形成稳定的结构。这进一步证实在含有丝素蛋白的培养基，木醋杆菌与培养基中的丝素蛋白一起培养，新生长出来的木醋杆菌的菌丝体会与天然的丝素蛋白通过化学反应相互交织在一起。所得丝素蛋白复合生物材料支架的含水量高，并且复合物是糖和蛋白的聚合物，因此具有特殊的生物功能，在生物矿化功能方面具有优良的生物学性能。
[0081]分别对本发明所述方法制备的丝素蛋白复合生物材料支架(例如实施例3制备得到的丝素蛋白复合生物材料支架，图中简称发酵复合膜(SF/BC))、蚕丝蛋白单体(即丝素蛋白，简称SF)、细菌纤维素(简称BC)、以物理方式将丝素蛋白和细菌纤维素混合的混合物(例如实施例8现有技术中所得复合膜，即图中蚕丝细菌纤维素混合物)。图7是上述材料的红外图谱，图8是图7在红外波数800至1500的放大。结果显示发酵复合膜(SF/BC)明显在1372cm 1出现了新的波峰，说明复合膜有新的聚合键的生成和复合材料中丝素蛋白酰胺III的波峰因原位聚合后受到两种材料间形成的氢键的影响而使原来1431 1和1337cm 1处的波峰发生位移，说明蚕丝蛋白与细菌纤维素在发酵过程中产生了交联聚合，形成了蚕丝蛋白细菌纤维素聚合物。即细菌纤维素中的羟基与丝素蛋白上的羧基或氨基发生的聚合反应，从而使细菌纤维素和丝素蛋白之间通过化学键形成了稳定的结构。
[0082]利用本发明所述的制备丝素蛋白复合生物材料支架的方法，选用以下能够生产细菌纤维素的菌，能生产出本发明所述的丝素蛋白复合生物材料支架。所述的能生产细菌纤维素的菌选自以下所列菌之一或它们的混合菌:木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)、葡糖酸醋杆菌属(Gluconacetobacter)、根瘤菌属(Rhizobium)、八叠球菌属(Sarcina)Jg单胞菌属(Preudomonas)、土壤杆菌属(Agrobaeterium)、无色杆菌属(Achromobacrer)、固氮菌属(Azotobacter)、气杆菌属(Aerobacter)或产喊菌属(Alcaligenes)。
[0083]本发明所述的方法制备丝素蛋白复合生物材料支架，其操作方法简便，劳动量少，使用的设备减少，降低了生产成本。通过强度试验、含水量试验、人体感知度试验等大量的验证试验，可以看出在培养基中添加丝素蛋白，使木醋杆菌与培养基中的丝素蛋白一起培养，因此新生长出来的木醋杆菌的菌丝体与天然的丝素蛋白通过化学反应相互交织在一起。所以用本发明所得丝素蛋白复合生物材料支架的含水量高，材料更牢固结实。所得复合生物支架是糖和蛋白的聚合物，因此又具有特殊的生物功能，在生物矿化功能方面具有优良的生物学性能。本发明制备得到的丝素蛋白复合生物材料支架是一种凝胶状，其光滑，触感好。本发明所得丝素蛋白复合生物材料支架的各种生物学功能均优于现有技术(培养基中不放丝素蛋白)所得的复合膜。
[0084]利用本发明所述的含有丝素蛋白的发酵培养基制备的丝素蛋白复合生物材料不仅可以用作面膜材料，并且具有特殊的生物学功能，在生物矿化等生物材料方面具有优良的生物学性能，可用于制备吸血棉、人工皮肤、血管等组织工程材料支架。
【主权项】
1.一种含细菌纤维素和丝素蛋白的复合生物材料，包括细菌纤维素和丝素蛋白，其特征在于，所述复合生物材料是由能产生细菌纤维素的菌和丝素蛋白共同培养，使细菌纤维素中的羟基与丝素蛋白上的羧基或氨基发生原位聚合反应形成化学键而制得。2.根据权利要求1所述的复合生物材料，其特征在于，所述的细菌纤维素来自以下所列菌之一或它们的混合菌:木醋杆菌、葡糖酸醋杆菌属、根瘤菌属、八叠球菌属、假单胞菌属、土壤杆菌属、无色杆菌属、固氮菌属、气杆菌属或产碱菌属。3.根据权利要求1所述的复合生物材料，其特征在于，以质量百分比计算，丝素蛋白的含量占复合生物支架的50%以上。4.制造含有细菌纤维素和丝素蛋白的复合生物材料的方法，包括:将能产生细菌纤维素的菌接种在含有丝素蛋白的发酵培养基中，所述菌与丝素蛋白共同培养，细菌纤维素中的羟基与丝素蛋白上的羧基或氨基发生原位聚合反应，使细菌纤维素与丝素蛋白之间形成化学键。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，发酵培养基以500ml计，包含选自以下之一:含4g-8g丝素蛋白的透析溶液、或经喷雾干燥获得的丝素蛋白粉末颗粒或者丝素凝胶干燥后物理粉碎的粉末。6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的丝素蛋白的制备方法包括取一定量的蚕茧，在质量体积比为0.5%的NaCO3溶液中，沸水I小时，脱胶丝，重复上述操作一次，风干即得丝素蛋白纤维，然后将丝素蛋白纤维在摩尔比为CaCl2:乙醇:水=2:1:8的溶液中溶解，80°C水浴I小时，使丝素蛋白纤维完全溶解，丝素蛋白纤维溶解后装入透析袋中透析，获得的丝素蛋白在制备发酵培养基时采用高温灭菌的方式。7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的丝素蛋白的制备方法包括取一定量的蚕茧，在质量体积比0.5%的他0)3溶液中，100°C，30分钟，然后60°C水洗6次脱去丝胶，脱胶丝风干即得丝素蛋白纤维，然后将丝素蛋白纤维在摩尔比为CaCl2:乙醇:7K=2:1:8的溶液中溶解，65 °C水浴I小时，使丝素蛋白纤维完全溶解，丝素蛋白纤维溶解后装入透析袋中透析，获得的丝素蛋白在制备发酵培养基时采用辐射灭菌的方式。8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养基选自以下之一:(I)按500ml 计算，30.0g-60.0g 的鹿糖，5.0g-l0.0g 的蛋白胨，0.5g-2.0g 的梓檬酸，0.5g-2.0g 的Na2HPO4*12H20,1.0g-2.5g 的 KH2PO4,0.05g-l.5g 的 MgS04*7H20 和丝素蛋白，其中所述的丝素蛋白选自含有4g-8g丝素蛋白的透析溶液或含有4g-8g丝素蛋白的喷雾干燥颗粒，其余为去离子水；或(2)按500ml计算，5.0g-13.0g的果糖，1.0g-4.0g的蛋白胨，0.lg-0.4g的柠檬酸，0.lg-0.4g 的 Na2HPO4.12H20，0.5g-0.8g 的 KH2PO4,0, lg-0.5g 的 MgSO4*7H20,4g-8g的丝素蛋白，其余为去离子水；或(3)按500ml计算，20g_30g的葡萄糖，2g_5g的蛋白胨，0.2g-0.6g 的柠檬酸，0.2g-0.6g 的 Na2HPO4* 12H20,1.0g-1.8g 的 KH2PO4,0.5g-0.8g的MgSO4*7H20，4g-8g的丝素蛋白，其余为去离子水。9.根据权利要求4至8之一所述的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)将木醋杆菌于斜面培养基进行活化，取活化后的菌种接种于种子培养基中，放置在摇床上进行培养，获得种子； (2)将步骤(I)培养所得的种子和液体培养基放入发酵培养基中继续培养，然后在28-30°C下静置培养7至15天，获得复合生物材料的初产物； (3)纯化步骤(2)中的复合生物材料的初产物后得到细菌纤维素和丝素蛋白的复合生物材料。10.根据权利要求4至8之一所述的方法，其特征在于，所述的纯化步骤包括取出复合生物材料的初产物，滤出水分后在蒸馏水中浸泡十分钟，去除表面的培养基和杂质，滤干蒸馏水浸泡过的复合生物材料的初产物的外周水分后移至足够体质量体积比为0.1至4%的NaOH溶液中，于60°C水浴中加热I小时，水浴后将复合生物材料的初产物取出滤水后再次用蒸馏水浸泡清洗泡十分钟，重复以上水浴步骤3次，清洗后的复合生物材料的初产物中加入蒸馏水，并滴入1%的醋酸溶液至溶液PH值为7，再用蒸馏水清洗3-4次。
【专利摘要】本发明提供了一种新型细菌纤维素和丝素蛋白的复合生物材料及其制造方法，包括细菌纤维素和丝素蛋白，所述复合生物材料是由能产生细菌纤维素的菌和丝素蛋白共同培养，细菌纤维素中的羟基与丝素蛋白上的羧基或氨基发生原位聚合反应形成化学键而制得。本发明所述的复合生物材料中纤维素与丝素蛋白间的结合牢固稳定，不容易分开，能更好地保持复合生物材料的生物学功能，在生物医学领域有极广的应用价值。
【IPC分类】A61K8/64, A61L15/28, A61K8/73, A61L27/20, A61L27/22, A61L15/32
【公开号】CN105012158
【申请号】CN201510382732
【发明人】朱正华, 董悦涵
【申请人】浙江经贸职业技术学院
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2014年3月26日
【公告号】CN103893820A, CN103893820B